CN104145822B

CN104145822B - 一种杉木优良无性系11c的组织培养育苗方法

Info

Publication number: CN104145822B
Application number: CN201410435936.7A
Authority: CN
Inventors: 郑仁华; 肖晖; 苏顺德; 方禄明; 谢汝根; 黄金华
Original assignee: FUJIAN ACADEMY OF FORESTRY
Current assignee: FUJIAN ACADEMY OF FORESTRY
Priority date: 2014-08-29
Filing date: 2014-08-29
Publication date: 2016-03-23
Anticipated expiration: 2034-08-29
Also published as: CN104145822A

Abstract

本发明涉及一种杉木优良无性系11C的组织培养育苗方法，包括以下步骤：(1)将杉木优良无性系11C的外植体接入诱导培养基，进行不定芽诱导培养，获得不定芽；(2)将所述不定芽转接至继代增殖培养基，进行继代增殖培养，获得继代苗；(3)将所述继代苗接种到生根培养基中，进行诱导生根培养，获得生根苗。本发明的杉木优良无性系11C的组织培养育苗方法具有诱导率高、增殖倍数高、有效苗率高及生根率高的优点。

Description

一种杉木优良无性系11C的组织培养育苗方法

技术领域

本发明涉及植物组织培养育苗领域，特别涉及一种杉木优良无性系11C的组织培养育苗方法。

背景技术

杉木优良无性系11C是福建省林业科学研究院郑仁华等选育出的杉木优良无性系，具有速生、优质的优良特性。有关杉木优良无性系组织培养的技术与专利已见公开报道，由于不同杉木个体的生长习性存在差异，不同杉木无性系组织培养各阶段的技术方法不能简单地照搬和套用。现有技术中的杉木无性系的组织培养育苗方法并不能适用于杉木优良无性系11C的培养，表现为培养出的杉木优良无性系11C继代增殖倍数、生根率和移栽成活率低。现有技术中也并没有针对杉木优良无性系11C的组织培养育苗方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种生根率高和继代增殖倍数高的杉木优良无性系11C的组织培养育苗方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

一种杉木优良无性系11C的组织培养育苗方法，包括以下步骤：

(1)将杉木优良无性系11C的外植体接入诱导培养基，进行不定芽诱导培养，所述诱导培养基的配方包括以下组分：1/2MS、0.5-0.8mg/L的6-BA、0.1-0.2mg/L的IBA、30g/L的蔗糖和5.6-6.0g/L的琼脂，调节pH值为5.6-6.0，进行培养，获得不定芽；

(2)将所述不定芽转接至继代增殖培养基，进行继代增殖培养，所述继代增殖培养基的配方包括以下组分：1/2MS、0.3-0.5mg/L的6-BA、0.1-0.2mg/L的IBA、30g/L的蔗糖和5.6-6.0g/L的琼脂，调节pH值为5.6-6.0，培养时间为35-40d，获得继代苗；

(3)将所述继代苗接种到生根培养基中，进行诱导生根培养，所述生根培养基的配方包括以下组分：1/4MS、0.1-0.5mg/L的IBA、0.3-0.5mg/L的NAA、15g/L的蔗糖和6.5-7.0g/L的琼脂，调节pH值为5.6-6.0，培养时间为25-30d，获得生根苗。

本发明的有益效果在于：

(1)选择6-BA与IBA作为诱导培养基添加的激素，并通过6-BA与IBA对诱导率的影响，设计出适宜的诱导培养基配方，使得不定芽诱导率提高至63-76.7％，出芽指数高达2.53-3.03；

(2)通过选择适宜的培养基、选择适宜的激素、激素配比及激素间的交互作用，设计出适宜的继代培养基配方，使得继代培养的增殖倍数达2.03-3.11倍，同时有效苗率高达17.98-37.50％以上；

(3)通过选择适宜的生长素种类、单一生长素的配比及两种生长素的复合配比对生根率的影响，设计出适宜的生根培养基配方，使得生根培养的生根率高达62.2-100％，平均生根数达5-7.3条；

(4)本发明通过诱导培养基、继代培养基及生根培养基配方的设计，针对性的设计出杉木优良无性系11C的组织培养育苗方法，该方法具有诱导率高、增殖倍数高、有效苗率高及生根率高的优点，此外，该方法培育的杉木优良无性系11C的移栽成活率为85％，为杉木优良无性系11C组培苗规模化生产提供技术支撑。

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式详予说明。

本发明最关键的构思在于：通过诱导培养基、继代培养基及生根培养基配方的设计，使本发明的杉木优良无性系11C的组织培养育苗方法具有诱导率高、增殖倍数高及生根率高的优点。

本发明提供的一种杉木优良无性系11C的组织培养育苗方法，包括以下步骤：

从上述描述可知，本发明的有益效果在于：

进一步的，所述组织培养育苗方法具体为：

(1)将杉木优良无性系11C的外植体接入诱导培养基，进行不定芽诱导培养，所述诱导培养基的配方包括以下组分：1/2MS、0.8mg/L的6-BA、0.2mg/L的IBA、30g/L的蔗糖和5.6-6.0g/L的琼脂，调节pH值为5.6-6.0，进行培养，获得不定芽；

(2)将所述不定芽转接至继代增殖培养基，进行继代增殖培养，所述继代增殖培养基的配方包括以下组分：1/2MS、0.3mg/L的6-BA、0.1-0.2mg/L的IBA、30g/L的蔗糖和5.6-6.0g/L的琼脂，调节pH值为5.6-6.0，培养时间为35-40d，获得继代苗；

(3)将所述继代苗接种到生根培养基中，进行诱导生根培养，所述生根培养基的配方包括以下组分：1/4MS、0.3mg/L的IBA、0.5mg/L的NAA、15g/L的蔗糖和6.5-7.0g/L的琼脂，调节pH值为5.6-6.0，培养时间为25-30d，获得生根苗；

本实施例为本发明的优选实施例，本实施例的有益效果为：进一步使不定芽诱导率提高至76.7％，出芽指数高达3.03，继代培养的增殖倍数达2倍以上，同时有效苗率高达32％以上，生根率高达95-100％，平均生根数达7.3条。

进一步的，步骤(1)中所述外植体经过灭菌处理，所述灭菌处理为：将所述外植体的针叶剪除，洗净外植体表面，用体积浓度为75％的乙醇浸泡外植体8-10s，用无菌水冲洗1次后，加入质量浓度为0.1％的升汞溶液和体积浓度为0.5％的吐温-20浸泡外植体，浸泡时间为8-10min。用无菌水清洗5次，每次4-5min；采用0.1％升汞，灭菌时间控制在8-10min，该灭菌条件在保证外植体不被伤害的前提下，可有效降低外植体的污染率及褐化死亡率，污染率由73.3％下降为33.3％。

进一步的，所述步骤(1)中的培养条件为：培养温度为25℃±2℃，先暗培养4-5d，再转入光培养，所述光培养的光照强度为1500-2000lx，光照时间为每天12-14h，培养周期为35-40d。

进一步的，还包括步骤(4)：将所述生根苗转移至拱棚，所述拱棚覆盖遮光率为75％的遮阳网，进行炼苗，所述炼苗时间为15-20d；15-20d的炼苗时间是适宜的炼苗时间，可以在保证组培苗的正常生长的同时，控制组培苗的木质化程度。

进一步的，还包括步骤(5)：将炼苗后的杉木苗移栽至黄心土，杉木苗覆盖遮光率为75％的遮阳网，保持空气相对湿度为80-95％，喷施1500倍的甲基托布津，之后每7-10d喷施1000-1500倍的多菌灵、百菌清或甲基托布津1次。当杉木苗恢复生长后，撤除遮阳网，进行全光育苗；黄心土是杉木优良无性系11C适宜的移栽基质，在该移栽基质下的移栽成活率高，移栽60d后移栽成活率为85％，且苗木长势良好。

进一步的，当所述杉木苗恢复生长后，每10-15d用质量浓度为0.05-0.2％的尿素追肥1次，苗木封顶前1个月停止追肥；所述尿素可以用复合肥替代，所述复合肥为氮、磷、钾含量分别为15—15—15的氮磷钾复混(合)肥料。

进一步的，步骤(1)中所述外植体选自杉木优良无性系11C原株的树干的基部的萌芽条或杉木优良无性系11C分株的根颈部的萌芽条，所述萌芽条高度为15-20cm。

本发明的实验数据及效果分析

1选取外植体

选取杉木优良无性系11C原株的树干的基部的萌芽条或其分株的根颈部的萌芽条为组织培养外植体，萌芽条高度为15-20cm，木质化程度达半木质化。

2外植体表面灭菌

先剪除外植体的针叶，用自来水冲洗后数遍后，用软毛刷蘸取家用洗洁精清洗外植体表面，再用自来水流水冲洗60min。在无菌接种室的超净工作台中，用75％乙醇浸泡外植体8-10s，倒净乙醇后用无菌水冲洗1次；倒净无菌水后，倒入0.1％升汞溶液并添加4-5滴吐温-20浸泡外植体，并不断轻摇容器以除去外植体表面气泡，灭菌时间处理设为5个处理，分别为4、6、8、10、12min。灭菌后用无菌水清洗外植体5次，每次4-5min。外植体表面灭菌后，切成长度1cm的茎段，接种在已经高压灭菌的诱导培养基上，每瓶接种1个茎段，每种处理接种30瓶，接种30d后观察统计外植体的污染率、褐化/死亡率及诱导率。污染率(％)＝污染数外植体数÷接种外植体总数×100％；褐化/死亡率(％)＝发生褐化或死亡的外植体数÷接种外植体总数×100％；诱导率(％)＝萌芽生长的外植体数÷无菌的接种外植体总数×100％。

表1为不同表面灭菌时间对杉木优良无性系11C外植体接种效果的影响表。

表1

如表1所示，在5种表面灭菌时间处理中，随着0.1％升汞灭菌时间的增加，污染率呈下降趋势，污染率由73.3％下降为26.7％，但褐化与死亡率呈上升趋势，诱导率呈下降趋势，诱导率由100％下降为45.5％。试验结果表明，增加0.1％升汞的灭菌时间，能有效降低外植体的污染率，但同时会加重升汞对外植体的伤害，减少有生活力无菌外植体的得率和外植体的诱导率。因此，综合考虑有生活力无菌外植体的得率和外植体的诱导率，对杉木优良无性系11C外植体进行表面灭菌时，0.1％升汞灭菌时间控制在8-10min效果较好。

3诱导培养

培养基以1/2MS培养基为基本培养基，添加蔗糖30g/L，琼脂5.6-6.0g/L，pH值为5.6-6.0。培养条件为温度控制在25℃±2℃，光照强度为1500-2000lx，光照时间为每天12-14h。接种后暗培养4-5d，再转入光照培养，培养周期为35-40d，下同(除特殊说明外)。

3.1诱导培养基筛选

外植体经表面灭菌后，切割成1cm长的茎段，接入不同的诱导培养基进行不定芽诱导试验。培养基添加不同浓度的6-BA(0.2，0.5，0.8，1.0，1.5mg/L)进行单因子试验，每处理接种30个外植体，试验重复3次，接种40d后统计诱导率、出芽指数和芽生长情况。出芽指数＝诱导出芽的外植体上的平均出芽数。

表2为不同6-BA浓度对外植体诱导的影响表。

表2

从表2可知，在培养基中添加不同浓度的6-BA，外植体的诱导率、出芽指数和生长情况存在差异。当6-BA浓度范围为0.2-1.0mg/L时，随着6-BA浓度的增加，外植体的诱导率和出芽指数相应提高；但当6-BA浓度达为1.0mg/L和1.5mg/L时，诱导出芽的正常形态发生了改变，表现为芽体粗短，并且部分芽发生了玻璃化现象，这表明过高浓度的6-BA会抑制芽的正常生长，不利于杉木优良无性系11C外植体芽的诱导。试验结果表明，当6-BA浓度为0.8mg/L时诱导效果最好，诱导率为68.9％，芽体生长良好。

3.2诱导培养基的优化

根据诱导培养基筛选试验结果，对诱导培养基进行优化试验。在培养基中添加6-BA0.8mg/L时，添加不同浓度的IBA(0.1，0.2，0.3mg/L)进行试验，每处理接种30个外植体，试验重复3次，接种40d后统计诱导率、出芽指数和芽生长情况。

表3为不同激素配比对外植体诱导的影响表。

表3

从表3可知，在诱导培养基中添加6-BA的同时，添加一定浓度的生长素IBA，能有效提高外植体的诱导率和出芽指数，诱导率可由63.3％提高到76.7％，出芽指数可由2.53提高到3.03。试验结果表明，以1/2MS培养基添加0.8mg/L的6-BA和0.2mg/L的IBA时效果最好，诱导率可达76.7％，出芽指数可达3.03，诱导芽的生长良好。

4继代增殖培养

4.1继代增殖基本培养基的筛选

将诱导出的不定芽转接至继代增殖培养基进行继代增殖培养，以MS、1/2MS、DCR培养基为基本培养基，添加0.5mg/L的6-BA和0.2mg/L的IBA，各试验处理接种10瓶，每瓶接种3个新芽，试验重复3次，培养周期为35d。调查统计增殖倍数、有效苗率、综合指数和生长分化情况。增殖倍数＝继代一次后的总芽数÷原接种芽数；有效苗数＝大于2.0cm可供生根的芽苗数量；有效苗率＝有效苗数÷丛生芽苗总数×100％；综合指数＝继代增殖倍数×有效苗率。

表4为基本培养基对继代培养的影响表。

表4

基本培养基	增殖倍数	有效苗率(％)	综合指数	继代苗生长情况
					1/2MS培养基	2.4	26.7	64.08	芽体生长快且粗壮，叶色浓绿
MS培养基	1.8	30.0	54.00	芽体生长快且粗壮，叶色浓绿
					DCR培养基	2.1	23.3	48.93	芽体生长慢且细弱，叶色淡绿

培养基是影响植物组织培养组织器官分化生长的重要因素，选择适宜的继代增殖基本培养基将有利于丛生芽的增殖和生长。由表4可知，在添加相同外源激素的情况下，杉木优良无性系11C继代苗在3种基本培养基上的增殖倍数和生长状况存在差异。以1/2MS为基本培养基时，增殖倍数最高，达2.4倍；以MS为基本培养基时，有效苗率最高，达30％；以1/2MS和MS为基本培养基时，继代苗的生长情况优于DCR培养基。以综合反映继代苗的增殖和生长情况的综合指数为评价指标时，以1/2MS为基本培养基时综合指数最高，因此以1/2MS为基本培养基效果最好。

4.2继代增殖激素配比的筛选

以1/2MS培养基为基本培养基，6-BA设4个水平，分别为0.2、0.3、0.5、1.0mg/L；IBA设3个水平，分别为0.1、0.2、0.3mg/L，进行继代增殖激素配比筛选试验，各试验处理接种10瓶，每瓶接种3个新芽，试验重复3次，培养周期为35d。调查统计增殖倍数、有效苗率和综合指数。

表5为不同激素配比对杉木优良无性系11C继代增殖的影响表。

表5

处理	6BA(mg/L)	IBA(mg/L)	平均增殖倍数	平均有效苗率(％)	平均综合指数
						1	1.0	0.1	3.46	10.11	34.56
2	1.0	0.2	3.07	14.00	43.36
						3	1.0	0.3	2.69	17.02	47.23
4	0.5	0.1	3.11	17.98	54.17
						5	0.5	0.2	2.53	23.19	56.70
6	0.5	0.3	2.10	26.23	54.81
						7	0.3	0.1	2.64	32.00	83.44
8	0.3	0.2	2.03	37.50	77.01
						9	0.3	0.3	1.16	53.33	53.97
10	0.2	0.1	1.76	32.08	58.14
						11	0.2	0.2	1.40	43.90	61.11
12	0.2	0.3	0.93	48.15	44.44

由表5可知，继代苗丛生芽的增殖和生长与外源激素的种类和浓度密切相关。当6-BA浓度一定时，随着IBA浓度的增加，能促进继代苗丛生芽的生长，有效苗率呈现增加的趋势。当IBA浓度一定时，随着6-BA浓度的增加，继代苗增殖倍数呈现增加的趋势。

表6为方差分析表。表7为LSD多重比较表。

表6

变异来源	平方和	自由度	均方	F值	显著水平P值
						重复	1.19559	2	0.5978	0.23446	0.79295

6-BA	1479.318	3	493.1061	4.94524*	0.04622
						IBA	219.1282	2	109.5641	1.09879	0.3921
6-BA×IBA	598.2793	6	99.71321	39.10905**	<0.001
						误差	56.09164	22	2.54962

注：**表示差异达到极显著；*表示差异达到显著。

表7

处理	均值	5％显著水平	1％极显著水平
				7	66.00138	a	A
8	61.36823	b	B
				11	51.42266	c	C
10	49.69098	cd	CD
				5	48.85265	cd	CD
6	47.76444	d	CD
				4	47.39494	d	D
9	47.28946	d	D
				3	43.41146	e	E
12	41.80818	e	E
				2	41.17816	e	E
1	36.00628	f	F

表6方差分析结果表明，激素6-BA和IBA之间的交互作用对综合指数的影响达极显著水平，6-BA对综合指数的影响达显著水平，IBA对综合指数的影响不显著，数据统计分析说明6-BA和IBA不同浓度的配比、6-BA的浓度，对继代苗的增殖和生长起主要作用。进而，表7多重比较结果表明，处理7和处理8、11之间差异极显著，处理8和处理11之间差异极显著。试验结果表明，采用处理7培养基时效果最佳，其次是处理8培养基，继代苗在保持一定的增殖倍数的同时，又能促进分化的丛生芽较快生长。因此，杉木优良无性系11C最佳的继代增殖培养基为1/2MS基本培养基附加0.3mg/L的BA和0.1-0.2mg/L的IBA。

5生根培养

将生长健壮的继代苗切割为1.5cm的单芽接种到生根培养基诱导生根。生根培养以1/4MS培养基为基本培养基，添加蔗糖15g/L，琼脂6.5-7.0g/L，pH值为5.6-6.0，培养时间为25-30d。

5.1单一生长素对生根的影响

以1/4MS培养基为基本培养基，分别单独添加IBA、NAA和IAA，每1种生长素浓度设4个水平，分别为0.1、0.3、0.5、1.0mg/L进行单因素试验，各处理培养接种30个单芽，重复3次，培养30d后调查生根率、平均生根数及生长情况。生根率＝生根的株数÷接种的总株树×100％。

表8为生根培养基中添加单一生长素对杉木优良无性系11C组培苗生根的影响表。

表8

处理	培养基配方(mg/L)	生根率(％)	平均生根数(条)
				1	1/4MS+IBA0.1	22.2	2.9
2	1/4MS+IBA0.3	48.9	5.3
				3	1/4MS+IBA0.5	66.7	6.5
4	1/4MS+IBA1.0	52.2	3.3
				5	1/4MS+NAA0.1	12.2	2.2
6	1/4MS+NAA0.3	31.1	4.6
				7	1/4MS+NAA0.5	45.6	3
8	1/4MS+NAA1.0	23.3	2.1
				9	1/4MS+IAA0.1	5.6	2.1
10	1/4MS+IAA0.3	8.9	2.5
				11	1/4MS+IAA0.5	20.0	4
12	1/4MS+IAA1.0	24.4	4.3

从表8可知，以1/4MS为基本培养基时，单独添加IBA、NAA和IAA均能诱导杉木优良无性系11C组培苗生根，但不同生长素及其浓度诱导生根的效果存在差异。在生根培养基中，添加IBA诱导生根的效果最好，添加IAA的效果最差；3种生长素浓度在0.1-0.5mg/L范围时，生根率随着生长素浓度的增加呈增加的趋势；IBA和NAA浓度达1.0mg/L时，生根率反而有所下降，组培苗基部切口处愈伤组织增大较明显。试验结果表明，添加单一生长素的生根培养基以1/4MS添加0.5mg/L的IBA效果最好，生根率为66.7％。

5.2生长素复配对生根的影响

以1/4MS培养基为基本培养基，添加IBA和NAA，每种生长素浓度设3个水平，分别为0.1、0.3、0.5mg/L，进行双因子试验，各处理培养接种30个单芽，重复3次，培养30d后调查生根率、平均生根数及生长情况。生根率＝生根的株数÷接种的总株树×100％。

表9为IBA和NAA对杉木优良无性系11C组培苗生根的影响表。

表9

处理	培养基配方(mg/L)	生根率(％)	平均生根数(条)
				1	1/4MS+IBA0.1+NAA0.1	47.8	3
2	1/4MS+IBA0.1+NAA0.3	62.2	5
				3	1/4MS+IBA0.1+NAA0.5	86.7	6.5
4	1/4MS+IBA0.3+NAA0.1	65.6	5.3
				5	1/4MS+IBA0.3+NAA0.3	84.4	6.5
6	1/4MS+IBA0.3+NAA0.5	100	7.3
				7	1/4MS+IBA0.5+NAA0.1	81.1	5.3
8	1/4MS+IBA0.5+NAA0.3	91.1	6.5
				9	1/4MS+IBA0.5+NAA0.5	72.2	5

从表9可知：以1/4MS为基本培养基时，在生根培养基中同时添加IBA和NAA，组培苗的生根情况得到明显改善。与添加单一生长素的生根培养基相比较，生根率由66.7％提高到100％，增加了33.3％；平均生根数由6.5条提高到7.3条，增加了0.8条，组培生根苗生长健壮。试验结果表明，在生根培养基中同时添加IBA和NAA更有利于杉木优良无性系11C组培苗生根，最佳生根培养基为1/4MS添加0.3mg/L的IBA和0.5mg/L的NAA。

6炼苗

当组培生根瓶苗根长达0.3-0.5cm时，将瓶苗从培养室转移至炼苗大棚炼苗，炼苗大棚覆盖遮光率为75％的遮阳网，炼苗时间设4个水平分别为10d、15d、20d和30d，分别调查组培苗的生长情况。

表10为不同炼苗时间对组培苗生长的影响表。

表10

炼苗时间(d)	生长情况
		10	生长正常，木质化程度低，苗梢和叶片嫩绿色，苗根白色
15	生长健壮，木质化程度较高，苗梢和叶片深绿色，苗根白色
		20	生长健壮，木质化程度较高，苗梢和叶片深绿色，苗根白色
30	生长较好，木质化程度高，部分苗木基部叶片黄化，苗根浅黄色

由表10可知，试验结果表明，炼苗时间为10d时，组培苗的木质化程度低，苗梢和叶片嫩绿色，对移栽后的外部环境适应能力较低，不利于移栽成活；炼苗时间为15-20d时，组培苗生长健壮，木质化程度较高，苗梢和叶片深绿色，苗根白色，对移栽后的外部环境适应能力较高，有利于移栽成活和恢复生长；炼苗时间为30d时，组培苗木质化程度进一步提高，苗梢和叶片颜色为深绿色，但部分苗木基部叶片出现黄化，苗根由白色浅黄色，组培苗表现出了长势衰退的现象，表明炼苗时间过长。试验结果表明，杉木优良无性系11C组培苗适宜的炼苗时间为15-20d。

7移栽

杉木优良无性系11C组培生根瓶苗炼苗20d后进行移栽试验。移栽前2-3d，用0.3-0.5％的高锰酸钾溶液将移栽基质淋透消毒。用清水洗净组培苗根部的培养基，用竹签在苗床上打孔后将组培苗植入，株行距为10×10㎝。移栽后及时浇定根水，喷施1500倍的甲基托布津；立即搭建塑料薄膜小拱棚保湿，上方覆盖遮光率为75％的遮阳网；保持苗床基质湿润，小拱棚内空气相对湿度保持在80-95％，每7d～10d喷施1000倍～1500倍的多菌灵、百菌清、甲基托布津等杀菌剂1次。组培苗移栽基质筛选试验选用4种基质，分别为黄心土、黄心土+河沙(黄心土：河沙＝3：1)、泥炭土+珍珠岩(泥炭土：珍珠岩＝3：1)和圃地土；移栽季节的筛选试验的移栽基质为黄心土，移栽60d后调查苗木的成活率和生长情况。

表11为组培苗移栽基质筛选结果表。

表11

由表11可知，不同移栽基质组培苗成活率不同，圃地土移栽成活率最低，黄心土移栽成活率最高，移栽60d后移栽成活率为85％，苗木长势良好；黄心土来源容易，生产成本低，易于推广应用。在实际育苗生产中，移栽基质选用黄心土效果最佳。

表12为不同移栽季节对组培苗成活率的影响表。

表12

移栽月份	移栽苗数(株)	平均移栽成活率(％)
			1	1000	82
2	1000	84
			3	1000	86
4	1000	73
			5	1000	57
6	1000	41
			10	1000	46
11	1000	55
			12	1000	78

不同移栽季节对组培苗成活率的影响见表12，试验结果表明：不同季节对杉木优良无性系11C组培苗移栽成活率存在差异。在天气炎热的季节进行移栽，组培苗的成活较低，在6月和10月间进行组培苗移栽，移栽成活率仅为41-46％；在1-3月和12月进行移栽，移栽成活率较高，移栽成活率为78-86％。由表12可知，杉木优良无性系11C组培苗适宜的移栽季节为春季的1-3月。

综上所述，本发明提供的杉木优良无性系11C的组织培养育苗方法的不定芽诱导率为63-76.7％、出芽指数为2.53-3.03、增殖倍数为2.03-3.11倍、有效苗率为17.98-37.50％、生根率为62.2-100％、平均生根数为5-7.3条、移栽成活率为85％，为杉木优良无性系11C组培苗规模化生产提供技术支撑。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims

1.一种杉木优良无性系11C的组织培养育苗方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将杉木优良无性系11C的外植体接入诱导培养基，进行不定芽诱导培养，所述诱导培养基的配方由以下组分组成：1/2MS、0.5-0.8mg/L的6-BA、0.1-0.2mg/L的IBA、30g/L的蔗糖和5.6-6.0g/L的琼脂，所述诱导培养基的pH值为5.6-6.0，进行培养，获得不定芽；

(2)将所述不定芽转接至继代增殖培养基，进行继代增殖培养，所述继代增殖培养基的配方由以下组分组成：1/2MS、0.3-0.5mg/L的6-BA、0.1-0.2mg/L的IBA、30g/L的蔗糖和5.6-6.0g/L的琼脂，所述继代增殖培养基的pH值为5.6-6.0，培养时间为35-40d，获得继代苗；

(3)将所述继代苗接种到生根培养基中，进行诱导生根培养，所述生根培养基的配方由以下组分组成：1/4MS、0.1-0.5mg/L的IBA、0.3-0.5mg/L的NAA、15g/L的蔗糖和6.5-7.0g/L的琼脂，所述生根培养基的pH值为5.6-6.0，培养时间为25-30d，获得生根苗。

2.根据权利要求1所述的杉木优良无性系11C的组织培养育苗方法，其特征在于，所述组织培养育苗方法具体为：

(1)将杉木优良无性系11C的外植体接入诱导培养基，进行不定芽诱导培养，所述诱导培养基的配方由以下组分组成：1/2MS、0.8mg/L的6-BA、0.2mg/L的IBA、30g/L的蔗糖和5.6-6.0g/L的琼脂，调节pH值为5.6-6.0，进行培养，获得不定芽；

(2)将所述不定芽转接至继代增殖培养基，进行继代增殖培养，所述继代增殖培养基的配方由以下组分组成：1/2MS、0.3mg/L的6-BA、0.1-0.2mg/L的IBA、30g/L的蔗糖和5.6-6.0g/L的琼脂，调节pH值为5.6-6.0，培养时间为35-40d，获得继代苗；

(3)将所述继代苗接种到生根培养基中，进行诱导生根培养，所述生根培养基的配方由以下组分组成：1/4MS、0.3mg/L的IBA、0.5mg/L的NAA、15g/L的蔗糖和6.5-7.0g/L的琼脂，调节pH值为5.6-6.0，培养时间为25-30d，获得生根苗。

3.根据权利要求1或2所述的杉木优良无性系11C的组织培养育苗方法，其特征在于，步骤(1)中所述外植体经过灭菌处理，所述灭菌处理为：将所述外植体的针叶剪除，洗净外植体表面，用体积浓度为75％的乙醇浸泡外植体8-10s，用无菌水冲洗1次后，加入质量浓度为0.1％的升汞溶液和体积浓度为0.5％的吐温-20浸泡外植体，浸泡时间为8-10min，用无菌水清洗5次，每次4-5min。

4.根据权利要求1或2所述的杉木优良无性系11C的组织培养育苗方法，其特征在于，所述步骤(1)中的培养条件为：培养温度为25℃±2℃，先暗培养4-5d，再转入光培养，所述光培养的光照强度为1500-2000lx，光照时间为每天12-14h，培养周期为35-40d。

5.根据权利要求1或2所述的杉木优良无性系11C的组织培养育苗方法，其特征在于，还包括步骤(4)：将所述生根苗转移至拱棚，所述拱棚覆盖遮光率为75％的遮阳网，进行炼苗，所述炼苗时间为15-20d。

6.根据权利要求1或2所述的杉木优良无性系11C的组织培养育苗方法，其特征在于，还包括步骤(5)：将炼苗后的杉木苗移栽至黄心土，杉木苗覆盖遮光率为75％的遮阳网，保持空气相对湿度为80-95％，喷施1500倍的甲基托布津，之后每7-10d喷施1000-1500倍的多菌灵、百菌清或甲基托布津1次，当杉木苗恢复生长后，撤除遮阳网，进行全光育苗。

7.根据权利要求6所述的杉木优良无性系11C的组织培养育苗方法，其特征在于，当所述杉木苗恢复生长后，每10-15d用0.05-0.2％的尿素追肥1次，苗木封顶前1个月停止追肥。

8.根据权利要求1或2所述的杉木优良无性系11C的组织培养育苗方法，其特征在于，步骤(1)中所述外植体选自杉木优良无性系11C原株的树干的基部的萌芽条或杉木优良无性系11C分株的根颈部的萌芽条，所述萌芽条高度为15-20cm。