CN115997685A - 一种独蒜兰的组培快繁方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种独蒜兰的组培快繁方法，涉及中药材植物组织培养技术领域。该独蒜兰的组培快繁方法，包括以下步骤：S1、种子的选取及无菌消毒处理；选取的种子冲洗干净，冰箱内冷藏后，消毒刷洗以及水吸干；S2、诱导培养：种子在无菌超净台内切开，种粉无菌水浸泡，浸泡后的种粉均匀的洒在培养基表面，培养18天后种粉变绿形成大量圆球茎，变绿的种粉在相同条件和相同培养基中继续培养30天；S3、增殖培养；S4、生根培养。通过种子预处理、控制培养基成分，使独蒜兰的种子萌发周期缩短至18天，假鳞茎增大至1.0‑1.2cm，提高了独蒜兰种苗成活率的同时大大降低了种植成本，满足独蒜兰药用及观赏的需求，缓解野生资源严重枯竭的现状。

Description

一种独蒜兰的组培快繁方法

技术领域

本发明涉及中药材植物组织培养技术领域，具体为一种独蒜兰的组培快繁方法。

背景技术

独蒜兰，又名冰球子，为兰科独蒜兰属，作为地生或附生的多年生草本植物，生长于海拔1100-3500米的林下或林缘多石地上或苔藓覆盖的岩石上，也常见于草坡稍阴蔽的砾石地上，以假鳞茎入药，具有清热解毒，消肿散结功效，用于治疗痈肿疔毒、淋巴结核、喉癖肿痛、蛇虫咬伤及狂犬伤等。

近年来因其抗肿瘤的功效而备受关注，加之野生资源严重枯竭，种子难于透水、透气、胚乳发育不完全，在自然条件下几乎不萌发等原因，独蒜兰的价格不断提高，并且野生的独蒜兰或者靠采挖野生独蒜兰的球茎进行驯化已经不能满足人们的需求，但根据独蒜兰和其它的兰科植物的特性一样，独蒜兰的蒴果中含有数万粒种子，因此通过种子繁殖，是解决独蒜兰种源问题最快速有效的方法。

经现有技术检索，中国专利公开了一种提高云南独蒜兰组培苗假鳞茎膨大和数量的方法(公布号为202210866641.X)，该方法采用把生根培养好的培养瓶苗放置在可以控制光照、温度的培养室中进行再次培养，再次培养分为三个阶段，第一阶段将温度控制在35℃，无光照的环境中培养25-30天，让高温抑制云南独蒜兰组培苗的生长，使叶子的光合作用降低，让原有的叶子黄化，把营养全部供给给假鳞茎，让假鳞茎膨大，等到叶子全部枯萎；第二阶段将培养温度降低至20℃继续培养25-30天，直至独蒜兰假鳞茎旁边有新的假鳞茎长出并出现新的芽点；第三阶段将培养温度提高至25℃继续培养25-30天，使第一阶段叶片黄化的假鳞茎再次长出新叶片，假鳞茎旁边长出的芽点也继续长大和长出叶片；另外，经现有技术检索，中国专利还公开了一种促进大花独蒜兰种子萌发的方法(公开号为202011321204.7)，该方法通过种子采收及预处理、无菌化处理、无菌播种处理等步骤缩短大花独蒜兰种子萌发所需的时间，21-30天即可使得大花独蒜兰种子达到90％以上的萌发率，种子萌发整齐，本专利不仅通过种子预处理来缩短种子萌发周期；还通过控制培养基成分来增大假鳞茎，从而提高移栽成活率。

基于上述现有技术分析，随着组培技术的不断进步，已经获得了独蒜兰的组培苗，但是独蒜兰的组培苗存在假鳞茎比较小，增大假鳞茎的效果不明显、并且种子萌发周期比较长等问题，导致其不能很好地进行产业化生产及推广种植。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种独蒜兰的组培快繁方法，解决了现有独蒜兰的组培苗方法存在种子萌发周期较长，假鳞茎比较小以及移栽成活率较低的问题。

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种独蒜兰的组培快繁方法，包括以下步骤：

S1、外植体的选取与无菌消毒：

选取饱满、成熟度适中、无病斑的独蒜兰种子，将种子不需要的部分去除，用自来水将种子冲洗干净，放入冰箱内冷藏，在超净工作台内用75％的酒精消毒30-60s，再用0.1％的升汞消毒5-10mi n，消毒完后用无菌水刷洗2-5次，最后用无菌的吸水纸把种子表面的水吸干，备用；

S2、诱导培养：

将准备好的种子在无菌超净台内切开，把独蒜兰的种粉抖在无菌的滤纸中，将装有种粉的滤纸折成小长方形，系上无菌的细线后，放入无菌的玻璃瓶内，倒入适量的无菌水浸泡，把浸泡后的种粉均匀的洒在培养基表面，并在培养环境为温度22℃-25℃，空气相对湿度70％-80％，光照时间10小时/天，光照强度2000Lux的条件下培养，培养18天后种粉变绿形成大量圆球茎，变绿的种粉在相同条件和相同培养基中继续培养30天；

S3、增殖培养：

选取在诱导培养中培养48天后长成带叶的幼苗，将幼苗转接入增殖培养基中进行增殖培养，并在培养环境为温度22℃-25℃，空气相对湿度70％-80％，光照时间8小时/天，光照强度2000Lux的条件下培养50天；

S4、生根培养：

在增殖培养基中培养50天后，转接到生根培养基中培养，在培养环境为温度22℃-25℃，空气相对湿度70％-80％，光照时间8小时/天，光照强度2000Lux的条件下培养，培养时间为60天，60天后进行炼苗移栽。

优选的，所述S1步骤中，独蒜兰种子洗干净后放入温度为2-6℃的冰箱内冷藏5-15h。

优选的，所述S2步骤中，独蒜兰种粉的无菌水浸泡时间为12-36h。

优选的，所述S2步骤中，诱导培养基：MS为基础培养基，并添加浓度为0.5mg/L 6-BA、0.3mg/L NAA、0.1-0.5mg/L GA、30g/L蔗糖、9.4g/L卡拉胶、0.3g/L活性炭。

优选的，所述S3步骤中，增殖培养基：MS为基础培养基，并添加浓度为1.0mg/L 6-BA、0.3mg/L NAA、30g/L蔗糖、9.4g/L卡拉胶、0.3g/L活性炭。

优选的，所述S4步骤中，生根培养基：MS为基础培养基，并添加浓度为0.5mg/LNAA、1g/L蛋白胨、20-40g/L芦荟汁、0.5-1.5mg/L萘乙酸钠、0.5-1.5mg/L土菌消、1g/L花宝2号、30g/L蔗糖、9.4g/L卡拉胶、0.5g/L活性炭。

本发明提供了一种独蒜兰的组培快繁方法。具备以下有益效果：

1、本发明通过对独蒜兰种子进行预处理，并且优化了独蒜兰组织培养的诱导阶段和生根阶段，特别是独蒜兰诱导培养阶段和生根培养阶段的操作方法，使独蒜兰种子萌发周期缩短，仅18天独蒜兰种粉就变绿形成大量圆球茎，同时假鳞茎大幅度增大至1.0-1.2cm，从而提高种苗移栽成活率。

2、本发明通过将独蒜兰种子放入冰箱冷藏可以打破种子休眠，促进种子萌发，并且通过使用无菌水浸泡种粉，可以促进种粉快速吸收水分，激活种粉中生物活性物质，加快种粉的萌发速度，再搭配赤霉素可以诱导α-淀粉酶的合成，加速淀粉的水解，促进种子萌发。

3、本发明通过在生根培养基中添加蛋白胨，蛋白胨不仅能吸附独蒜兰自身分泌的物质，也能使独蒜兰正常生根，再通过在生根培养基中添加的芦荟汁，其富含生物碱和各种酶，可以促进黑色素和各种独蒜兰自身分泌物的代谢，进而使假鳞茎增大，其次，在生根培养基中的萘乙酸钠可促进假鳞茎膨大，而土菌消不仅具有杀菌消毒的作用，在适宜浓度内和生长素一起使用还可促进生根和假鳞茎增大。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

本发明实施例提供一种独蒜兰的组培快繁方法，包括以下步骤：

S1、外植体的选取与无菌消毒：

选取饱满、成熟度适中、无病斑的独蒜兰种子，将种子不需要的部分去除，用自来水将种子冲洗干净，放入冰箱内冷藏，在超净工作台内用75％的酒精消毒30-60s，再用0.1％的升汞消毒5-10mi n，消毒完后用无菌水刷洗2-5次，最后用无菌的吸水纸把种子表面的水吸干，备用；

具体的，独蒜兰种子洗干净后放入温度为2-6℃的冰箱内冷藏10h。

S2、诱导培养：

将准备好的种子在无菌超净台内切开，把独蒜兰的种粉抖在无菌的滤纸中，将装有种粉的滤纸折成小长方形，系上无菌的细线后，放入无菌的玻璃瓶内，倒入适量的无菌水浸泡，把浸泡后的种粉均匀的洒在培养基表面，并在培养环境为温度22℃-25℃，空气相对湿度70％-80％，光照时间10小时/天，光照强度2000Lux的条件下培养，培养18天后种粉变绿形成大量圆球茎，变绿的种粉在相同条件和相同培养基中继续培养30天；

具体的，独蒜兰种粉的无菌水浸泡时间为24h。

更进一步的，诱导培养基：MS为基础培养基，并添加浓度为0.5mg/L 6-BA、0.3mg/LNAA、0.3mg/L GA、30g/L蔗糖、9.4g/L卡拉胶、0.3g/L活性炭。

S3、增殖培养：

选取在诱导培养中培养48天后长成带叶的幼苗，将幼苗转接入增殖培养基中进行增殖培养，并在培养环境为温度22℃-25℃，空气相对湿度70％-80％，光照时间8小时/天，光照强度2000Lux的条件下培养50天；

具体的，增殖培养基：MS为基础培养基，并添加浓度为1.0mg/L 6-BA、0.3mg/LNAA、30g/L蔗糖、9.4g/L卡拉胶、0.3g/L活性炭。

S4、生根培养：

在增殖培养基中培养50天后，转接到生根培养基中培养，在培养环境为温度22℃-25℃，空气相对湿度70％-80％，光照时间8小时/天，光照强度2000Lux的条件下培养，培养时间为60天，60天后进行炼苗移栽。

具体的，生根培养基：MS为基础培养基，并添加浓度为0.5mg/L NAA、1g/L蛋白胨、30g/L芦荟汁、1mg/L萘乙酸钠、1mg/L土菌消、1g/L花宝2号、30g/L蔗糖、9.4g/L卡拉胶、0.5g/L活性炭。

实施例2：

本实施例与实施例1相同的特征不再赘述，不同的特征在于：本实施例中的S4步骤：生根培养的培养基中芦荟汁的添加量为40g/L、萘乙酸钠的添加量为1.5mg/L、土菌消的添加量为1.5mg/L。

实施例3：

本实施例与实施例1相同的特征不再赘述，不同的特征在于：本实施例中的S4步骤：生根培养的培养基中芦荟汁的添加量为20g/L、萘乙酸钠的添加量为0.5mg/L、土菌消的添加量为0.5mg/L。

实施例4：

本实施例与实施例1相同的特征不再赘述，不同的特征在于：本实施例中的S1步骤：外植体的选取与无菌消毒阶段独蒜兰种子放入温度为2-6℃的冰箱内冷藏时间为15h；以及S2步骤：诱导培养中种粉浸泡时间为36h、GA的添加量为0.5mg/L。

实施例5：

本实施例与实施例1相同的特征不再赘述，不同的特征在于：本实施例中的S1步骤：外植体的选取与无菌消毒阶段独蒜兰种子放入温度为2-6℃的冰箱内冷藏时间为5h；以及S2步骤：诱导培养中种粉浸泡时间为12h、GA的添加量为0.1mg/L。

对比例1：

本对比例与实施例1相同的特征不再赘述，不同的特征在于：本对比例中的S4步骤：生根培养阶段的培养基中芦荟汁的添加量为0mg/L。

对比例2：

本对比例与实施例1相同的特征不再赘述，不同的特征在于：本对比例中的S4步骤：生根培养阶段的培养基中土菌消的添加量为0mg/L。

对比例3：

本对比例与实施例1相同的特征不再赘述，不同的特征在于：本对比例中S4步骤：生根培养阶段的培养基中土菌消的添加量为0mg/L。

对比例4：

本对比例与实施例1相同的特征不再赘述，不同的特征在于：本对比例中S4步骤：生根培养阶段的培养基中芦荟汁的添加量为0mg/L，萘乙酸钠的添加量为0mg/L。

对比例5：

本对比例与实施例1相同的特征不再赘述，不同的特征在于：本对比例中S4步骤：生根培养阶段的培养基中芦荟汁的添加量为0mg/L，土菌消的添加量为0mg/L。

对比例6：

本对比例与实施例1相同的特征不再赘述，不同的特征在于：本对比例中S4步骤：生根培养阶段的培养基中萘乙酸钠的添加量为0mg/L，土菌消的添加量为0mg/L。

对比例7：

本对比例与实施例1相同的特征不再赘述，不同的特征在于：本对比例中S4步骤：生根培养阶段的培养基中芦荟汁的添加量为0mg/L、萘乙酸钠的添加量为0mg/L、土菌消的添加量为0mg/L。

对比例8：

本对比例与实施例1相同的特征不再赘述，不同的特征在于：本对比例中S1步骤：外植体的选取与无菌消毒阶段中独蒜兰种子不放入冰箱内冷藏。

对比例9：

本对比例与实施例1相同的特征不再赘述，不同的特征在于：本对比例中S2步骤：诱导培养中独蒜兰种粉不用无菌水浸泡。

对比例10：

本对比例与实施例1相同的特征不再赘述，不同的特征在于：本对比例中S2步骤：诱导培养中培养基GA的添加量为0mg/L。

对比例11：

本对比例与实施例1相同的特征不再赘述，不同的特征在于：本对比例中S1步骤：外植体的选取与无菌消毒阶段中独蒜兰种子不放入冰箱内冷藏，以及S2步骤：诱导培养中独蒜兰种粉不用无菌水浸泡，培养基中GA的添加量为0mg/L。

将实施例和对比例的不同处理，对独蒜兰种子萌发时间及假鳞茎大小的影响进行统计与分析，结果如表1所示：

表1：不同处理对独蒜兰种子萌发及假鳞茎的影响对比表

通过实施例1-3、对比例1-7可以得出：独蒜兰幼苗进行生根培养时用MS培养基、添加30g/L芦荟汁、1.0mg/L萘乙酸钠、1.0mg/L土菌消时假鳞茎最大为1.2cm，当芦荟汁、萘乙酸钠、土菌消超过该浓度时，独蒜兰会出现徒长、玻璃化、变黄现象，浓度太低没有增大假鳞茎的效果，添加物只有其中一种或两种时增大假鳞茎的效果没有添加三种时明显。

因此，对比公开号为202011321204.7发明的一种提高云南独蒜兰组培苗假鳞茎膨大和数量的方法，该专利中所用方法虽然也有增大假鳞茎的效果，但并没有实验组1明显，说明本发明提供的一种独蒜兰的组培快繁方法能够有效且明显的起到增大假鳞茎的效果，并且假鳞茎大幅度增大至1.0-1.2cm，从而有效地提高了种苗移栽的成活率。

通过实施例1、实施例4、实施例5、以及对比例8-11可以得出：进行种子冷藏10h、无菌水浸泡种粉24h的预处理后，在诱导培养的培养基中添加0.3mg/LGA时独蒜兰种子萌发时间最短，仅18天就能变绿形成大量圆球茎，其余配比效果都不佳。

因此，对比公开号为202011321204.7发明的一种促进大花独蒜兰种子萌发的方法，该方法中的诱导方法虽然也有缩短种子萌发的效果，但所需时间比本方法的长，说明本发明提供的一种独蒜兰的组培快繁方法通过独蒜兰诱导培养阶段和生根培养阶段的操作方法，使独蒜兰种子萌发周期缩短，仅18天独蒜兰种粉就变绿形成大量圆球茎，有效地缩短了种子萌发周期，提高后续经济效益。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (6)

1.一种独蒜兰的组培快繁方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1、外植体的选取与无菌消毒：

选取饱满、成熟度适中、无病斑的独蒜兰种子，将种子不需要的部分去除，用自来水将种子冲洗干净，放入冰箱内冷藏，在超净工作台内用75％的酒精消毒30-60s，再用0.1％的升汞消毒5-10min，消毒完后用无菌水刷洗2-5次，最后用无菌的吸水纸把种子表面的水吸干，备用；

S2、诱导培养：

将准备好的种子在无菌超净台内切开，把独蒜兰的种粉抖在无菌的滤纸中，将装有种粉的滤纸折成小长方形，系上无菌的细线后，放入无菌的玻璃瓶内，倒入适量的无菌水浸泡，把浸泡后的种粉均匀的洒在培养基表面，并在培养环境为温度22℃-25℃，空气相对湿度70％-80％，光照时间10小时/天，光照强度2000Lux的条件下培养，培养18天后种粉变绿形成大量圆球茎，变绿的种粉在相同条件和相同培养基中继续培养30天；

S3、增殖培养：

选取在诱导培养中培养48天后长成带叶的幼苗，将幼苗转接入增殖培养基中进行增殖培养，并在培养环境为温度22℃-25℃，空气相对湿度70％-80％，光照时间8小时/天，光照强度2000Lux的条件下培养50天；

S4、生根培养：

在增殖培养基中培养50天后，转接到生根培养基中培养，在培养环境为温度22℃-25℃，空气相对湿度70％-80％，光照时间8小时/天，光照强度2000Lux的条件下培养，培养时间为60天，60天后进行炼苗移栽。

2.根据权利要求1所述的一种独蒜兰的组培快繁方法，其特征在于：所述S1步骤中，独蒜兰种子洗干净后放入温度为2-6℃的冰箱内冷藏5-15h。

3.根据权利要求1所述的一种独蒜兰的组培快繁方法，其特征在于：所述S2步骤中，独蒜兰种粉的无菌水浸泡时间为12-36h。

4.根据权利要求1所述的一种独蒜兰的组培快繁方法，其特征在于：所述S2步骤中，诱导培养基：MS为基础培养基，并添加浓度为0.5mg/L6-BA、0.3mg/LNAA、0.1-0.5mg/LGA、30g/L蔗糖、9.4g/L卡拉胶、0.3g/L活性炭。

5.根据权利要求1所述的一种独蒜兰的组培快繁方法，其特征在于：所述S3步骤中，增殖培养基：MS为基础培养基，并添加浓度为1.0mg/L6-BA、0.3mg/LNAA、30g/L蔗糖、9.4g/L卡拉胶、0.3g/L活性炭。

6.根据权利要求1所述的一种独蒜兰的组培快繁方法，其特征在于：所述S4步骤中，生根培养基：MS为基础培养基，并添加浓度为0.5mg/LNAA、1g/L蛋白胨、20-40g/L芦荟汁、0.5-1.5mg/L萘乙酸钠、0.5-1.5mg/L土菌消、1g/L花宝2号、30g/L蔗糖、9.4g/L卡拉胶、0.5g/L活性炭。