CN103609451A - 一种枸杞无菌苗及其诱导愈伤的获得方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种枸杞无菌苗及其诱导愈伤的获得方法，属于植物组织培养技术领域，它包括以下步骤：果实干燥，种子消毒：用含有70%乙醇、0.1%TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)的无菌蒸馏水进行种子消毒，种子萌发：先置于4℃的冰箱中，静置2天，然后移至温度为25±2℃，每日光照14小时的培养室培养20±2天，愈伤继代培养：将种子放置于继代培养基上，25±2℃条件下，每日光照16小时的培养室中培养，每两周更换培养基。该方法在获得枸杞无菌苗的同时获得了枸杞的诱导愈伤组织，简化了枸杞愈伤组织诱导过程中对其进行物理创伤的这一步骤，缩短了获得枸杞愈伤组织的周期。

Description

一种枸杞无菌苗及其诱导愈伤的获得方法

技术领域

本发明涉及一种组织培养愈伤组织诱导的方法，尤其是一种枸杞无菌苗及其诱导愈伤的获得方法。

背景技术

枸杞（Lycium）为一种多分枝、多刺灌木，其果实在中国有很多民间叫法，如苟起子、枸杞红实、甜菜子、西枸杞、狗奶子。枸杞子被卫生部列为“药食两用”品种，枸杞子可以加工成各种食品、饮料、保健酒、保健品等。枸杞子主要成分含甜菜碱(betane)，阿托品(atropine)，天仙子胺(gyoscyamine)，枸杞多糖和枸杞色素。其中又以枸杞多糖的免疫调节和抗肿瘤作用的研究最多。现已有很多研究表明，枸杞具有促进免疫、抗衰老、抗肿瘤、预防动脉粥样硬化、清除自由基、抗疲劳、抗辐射、保肝、生殖功能保护和改善等作用。

枸杞喜冷凉湿润的肥沃土壤，耐寒，耐旱，耐风雨，但不耐高温，在贫瘠的路、沟、渠旁也能正常生长，山坡、荒地、田野、庭院等向阳干燥的地方都可种植。对土壤要求不严，但以砂质壤土最好,低洼积水的地方不宜栽种。但是传统种植方法一般为自然萌发出苗，发芽率不高，一般为60%，且容易受气候和季节影响，不能全天候萌发。同时在自然条件下，幼苗的成苗率也偏低。这些不利因素都影响了枸杞的大规模种植和商业化运作。

当枸杞的外植体为苗、茎和叶片等植物器官时，枸杞愈伤的获得一般均需先对其外植体进行物理创伤，然后通过一定的特殊培养基对创伤的外植体进行诱导培养，方可使外植体产生愈伤。并且，如果外植体取自自然环境，也需要考虑季节的因素，例如，如果选用叶片进行愈伤诱导，则冬季就很难进行。如果外植体取自自然环境，一般要先对外植体进行无菌处理，之后方可进行愈伤的诱导工作，而无菌处理一般使用0.1%的升汞，其对外植体的毒性高，伤害较大，致死率较高，从而导致愈伤诱导率较低；此外还可在无菌环境下直接对枸杞无菌苗进行物理创伤处理，从而诱导枸杞愈伤产生，但是同样的，需要先行对枸杞种子进行无菌处理，同样需要使用0.1%的升汞，其对种子毒性高，致死率较高，致使枸杞发芽率降低。无论使用何种方法，都面临这同样的问题，即外植体的愈伤组织的诱导率较低，方法繁琐。

发明内容

本发明提供了一种组织培养愈伤组织诱导的方法，该方法可以高效、快速、简单的获得枸杞无菌苗及其愈伤，该方法不仅能够获得无菌的枸杞无菌苗，方便快捷的同时获得了枸杞的诱导愈伤组织。

本发明解决技术问题所采取的技术方案是：

一种枸杞无菌苗及其诱导愈伤的获得方法，其特征在于，包括以下步骤：

    （1）果实干燥：将收集到的枸杞果实放于尼龙网袋中，吊置于干燥通风的房间中，20-25℃条件下，放置14天左右，每隔一天翻动一次，直至果实完全干燥；

（2）种子消毒：当种子和果皮容易分开时，取出种子，无菌条件下放置于无菌的蓝盖拧口试剂瓶中，加入处理液，将蓝盖拧口试剂瓶置于震荡摇床上，20-25℃条件下，快速震荡2分钟，然后将种子和处理液一并倒在干燥的无菌滤纸上，无菌条件下，干燥处理；

所述处理液为含有70%(v/v)乙醇、0.1%(v/v)Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)的无菌蒸馏水，所述无菌蒸馏水的电阻率≥0.1×10⁶Ω·cm(欧·厘米)；

（3）种子萌发：将经过步骤（2）处理的种子轻轻的均匀撒在预处理培养基上，将放有种子的预处理培养基放置于4℃的冰箱中，静置2天，然后移至温度为25±2℃，每日光照14小时的培养室，连续培养20±2天，直至带有愈伤组织的枸杞幼苗出现；

（4）愈伤继代培养：在无菌条件下将枸杞愈伤与幼苗分离，放置于继代培养基上，置于培养室中，在温度为25±2℃条件下，每日光照16小时，连续培养，期间每两周换至新的继代培养基上。

优选的，所述预处理培养基为pH5.8的基本的MS培养基，所述的MS培养基中含有6-BA(6-苄氨基嘌呤)2-3mg/L，NAA(α-萘乙酸)0.1-0.3mg/L，激动素（6-糖基氨基嘌呤）1-3 mg/L，赤霉素0.5-1 mg/L，二苯脲0.5-2mg/L，20g/L蔗糖，8g/L琼脂。NAA为植物生长激素，促进细胞增殖生长。6-BA为细胞分裂素，促进芽的形成，也可以诱导愈伤组织发生。激动素为细胞分裂素，可诱导离体组织的细胞分裂和调节分化。赤霉素，可刺激叶和芽的生长。二苯脲，具有细胞分裂素作用。几者的组合可以一方面促进种子的发芽，减少种子的休眠时间提高出芽率，同时促进枸杞苗的根冠薄壁细胞愈伤组织的形成，提高愈伤组织的诱导率和增殖速率；

继代培养基为pH5.8的基本的MS培养基，所述的MS培养基中含有6-BA(6-苄氨基嘌呤)3-5mg/L，NAA(α-萘乙酸)0.3-0.5mg/L，激动素（6-糖基氨基嘌呤）2-5mg/L，二苯脲1-3mg/L，20g/L蔗糖，8g/L琼脂。适当的增加几种激素的浓度并调节适当的比例，减少赤霉素的用量，能够迅速并且显著地提高愈伤组织的增殖速率。在温度为25±2℃，每日光照16小时，连续培养，期间每2周换至新的继代培养基上。

优选的，所述步骤（2）中，种子和处理液的质量体积比为1：30（g：ml），种子和溶液的总体积为蓝盖拧口试剂瓶体积的10%，所述质量体积比为g：mL。

优选的，所述步骤（2）中，震荡摇床转速为300rpm。

本发明的有益效果：

    （1）本发明通过6-BA(6-苄氨基嘌呤)、NAA(α-萘乙酸)、激动素（（6-糖基氨基嘌呤）、赤霉素、二苯脲的组合对枸杞苗的根冠薄壁细胞作用，不通过任何的物理创伤，能够直接获得根部带有愈伤组织的无菌苗，并且，后期愈伤的存活率可达到97.5±2%。该方法在获得枸杞无菌苗的同时获得了枸杞的诱导愈伤组织，简化了枸杞愈伤组织诱导过程中对其进行物理创伤的这一步骤，缩短了获得枸杞愈伤组织的周期。

 （2）本发明不用茎秆、叶子等进行愈伤，直接采取种子愈伤，一年四季都可以进行诱导愈伤，克服了茎秆、叶子等进行愈伤的季节选择性问题。

（3）本发明采用含有70%乙醇和0.1%Triton X-100的处理液对种子消毒，得到的枸杞苗的无菌率可达97.4±1%。 

（4）本发明采用种子和处理液的质量体积比在1：30（g：ml），种子和处理液的总体积为蓝盖拧口试剂瓶体积的10%，因此得到的枸杞苗的无菌率进一步提高，可达98.6±1%。

（5）普通的组织诱导一般要经过水洗、酒精洗、升汞处理等等步骤，一般需时2小时以上；本发明采用震荡摇床转速为300rpm，处理时间为2分钟，因此得到的枸杞苗的无菌率大大提高，同时处理时间大大的减少。

（6）本发明采用枸杞诱导愈伤培养基配方中激素6-BA 2-3mg/L，NAA 0.1-0.3mg/L，激动素1-3mg/L，赤霉素0.5-1 mg/L，二苯脲0.5-2mg/L,因此缩短了枸杞种子的低温处理时间，在获得枸杞苗的同时得到了其诱导愈伤组织，简化了枸杞愈伤组织诱导的实验步骤，同时保证诱导率高达51.7±2%。

（7）本发明采用了枸杞诱导愈伤的继代培养中6-BA 3-5mg/L，NAA 0.3-0.5mg/L，激动素2-5mg/L，二苯脲1-3mg/L,因此枸杞愈伤组织得到了快速的增长，增殖率为89.8±2%，明显高于同样生长周期中的一般培养基。

具体实施方式

实施例1

    （1）果实干燥：将收集到的枸杞果实放于尼龙网袋中，吊置于干燥通风的房间中，20-25℃条件下，放置14天左右，每隔一天翻动一次，直至果实完全干燥；

（2）种子消毒：当种子和果皮容易分开时，取出种子，无菌条件下放置于无菌的蓝盖拧口试剂瓶中，加入处理液，将蓝盖拧口试剂瓶置于震荡摇床上，20-25℃条件下，快速震荡2分钟，然后将种子和处理液一并倒在干燥的无菌滤纸上，无菌条件下，干燥处理；所述处理液为含有70%(v/v)乙醇、0.1%(v/v)Triton X-100聚乙二醇辛基苯基醚)的无菌蒸馏水，蒸馏水的电阻率≥0.1×10⁶Ω·cm(欧·厘米)。

将实施例1步骤（2）中处理液变为含有70%乙醇的无菌蒸馏水，得到的枸杞苗的无菌率降为84±5%。

将上述步骤（2）中种子和处理液的质量体积比控制在1：30（g：mL），种子和处理液的总体积为蓝盖试剂瓶体积的10%，得到的枸杞苗的无菌率提高到98.6±1%。

将上述步骤（2）中震荡摇床的转速调为0～400rpm，震荡时间控制为0～20分钟，发现当震荡摇床转速大于等于300rpm，震荡时间大于等于2分钟时，获得的枸杞苗的无菌率无明显变化。

上述结果具体见下表1和表2。 

表1 用不同的处理液对种子消毒后的无菌率变化

表2 不同的种子和处理液的质量体积比得到的枸杞苗无菌率对比

（3）种子萌发：将经过步骤（2）处理的种子轻轻的均匀撒在预处理培养基上，将放有种子的预处理培养基放置于4℃的冰箱中，静置2天，然后移至温度为25±2℃，每日光照14小时的培养室，连续培养20±2天，直至带有愈伤组织的枸杞幼苗出现；所述预处理培养基为pH5.8的基本的MS培养基，所述的MS培养基中含有6-BA(6-苄氨基嘌呤)2-3mg/L，NAA(α-萘乙酸)0.1-0.3mg/L，激动素（（6-糖基氨基嘌呤）1-3 mg/L，赤霉素0.5-1 mg/L，二苯脲0.5-2mg/L，20g/L蔗糖，8g/L琼脂。几者的组合可以一方面促进种子的发芽，减少种子的休眠时间提高出芽率，同时促进枸杞苗的根冠薄壁细胞愈伤组织的形成，提高愈伤组织的诱导率和增殖速率；

将上述步骤（3）中预处理培养基6-BA变为1～3mg/L，NAA 0.1～0.3mg/L时，在枸杞种子低温处理时间由2天增加到4天，获得了枸杞苗及其诱导愈伤组织，枸杞诱导愈伤出现时间由20±2天增加到37±2天，诱导率由原来的51.7±2%下降至28.6±2%。

上述结果见下表3。

表3不同激素对愈伤组织诱导率的影响

（4）愈伤继代培养：在无菌条件下将枸杞愈伤与幼苗分离，放置于继代培养基上，置于培养室中，在温度为25±2℃条件下，每日光照16小时，连续培养，期间每两周换至新的继代培养基上；继代培养基为pH5.8的基本的MS培养基，所述的MS培养基中含有6-BA(6-苄氨基嘌呤)3-5mg/L，NAA(α-萘乙酸)0.3-0.5mg/L，激动素（6-糖基氨基嘌呤）2-5mg/L，二苯脲1-3mg/L, 20g/L蔗糖，8g/L琼脂。适当的增加几种激素的浓度并调节适当的比例，减少赤霉素的用量，能够迅速并且显著地提高愈伤组织的增殖率，后期愈伤的存活率可达到97.5±2%。在温度为25±2℃，每日光照16小时，连续培养，期间每2周换至新的继代培养基上。

将上述步骤（4）中继代培养基6-BA变为3～5mg/L，NAA 0.3～0.5mg/L时，发现在同样的单位时间内（两周），获得的枸杞诱导愈伤增殖率由89.8±2%下降至25.9±2%。

具体结果见下表4。

表4不同激素对愈伤组织增殖的影响

Claims (4)

1.一种枸杞无菌苗及其诱导愈伤的获得方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）果实干燥：将收集到的枸杞果实放于尼龙网袋中，吊置于干燥通风的房间中，20-25℃条件下，放置14天左右，每隔一天翻动一次，直至果实完全干燥；

（2）种子消毒：当种子和果皮容易分开时，取出种子，无菌条件下放置于无菌的蓝盖拧口试剂瓶中，加入处理液，将蓝盖拧口试剂瓶置于震荡摇床上，20-25℃条件下，快速震荡2分钟，然后将种子和处理液一并倒在干燥的无菌滤纸上，无菌条件下，干燥处理；

所述处理液为含有70%(v/v)乙醇、0.1%(v/v)Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)的无菌蒸馏水，所述无菌蒸馏水的电阻率≥0.1×10⁶Ω·cm(欧·厘米)；

（3）种子萌发：将经过步骤（2）处理的种子轻轻的均匀撒在预处理培养基上，将放有种子的预处理培养基放置于4℃的冰箱中，静置2天，然后移至温度为25±2℃，每日光照14小时的培养室，连续培养20±2天，直至带有愈伤组织的枸杞幼苗出现；

（4）愈伤继代培养：在无菌条件下将枸杞愈伤与幼苗分离，放置于继代培养基上，置于培养室中，在温度为25±2℃条件下，每日光照16小时，连续培养，期间每两周换至新的继代培养基上。

2.根据权利要求1所述的枸杞无菌苗及其诱导愈伤的获得方法，其特征在于，

所述预处理培养基为pH5.8的基本的MS培养基，所述的MS培养基中含有6-BA(6-苄氨基嘌呤)2-3mg/L，NAA(α-萘乙酸)0.1-0.3mg/L，激动素（6-糖基氨基嘌呤）1-3 mg/L，赤霉素0.5-1 mg/L，二苯脲0.5-2mg/L，20g/L蔗糖，8g/L琼脂；继代培养基为pH5.8的基本的MS培养基，所述的MS培养基中含有6-BA(6-苄氨基嘌呤)3-5mg/L，NAA(α-萘乙酸)0.3-0.5mg/L，激动素（6-糖基氨基嘌呤）2-5mg/L，二苯脲1-3mg/L, 20g/L蔗糖，8g/L琼脂，在温度为25±2℃，每日光照16小时，连续培养，期间每2周换至新的继代培养基上。

3.根据权利要求1所述的枸杞无菌苗及其诱导愈伤的获得方法，其特征在于，所述步骤（2）中，种子和处理液的质量体积比为1：30（g：mL），种子和处理液的总体积为蓝盖拧口试剂瓶体积的10%。

4.根据权利要求1所述的枸杞无菌苗及其诱导愈伤的获得方法，其特征在于，所述步骤（2）中，震荡摇床转速为300rpm。