JP3943559B2 - 稲の雄蕊の特異的発現システムプロテアーゼ遺伝子、該遺伝子の雄蕊の特異的発現プロモーター、該遺伝子の発現抑制を利用した雄性不妊導入稲の生産方法 - Google Patents
稲の雄蕊の特異的発現システムプロテアーゼ遺伝子、該遺伝子の雄蕊の特異的発現プロモーター、該遺伝子の発現抑制を利用した雄性不妊導入稲の生産方法 Download PDFInfo
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Description
稲は、国内は勿論全世界の3分の1以上の国で主食になっている米の生産植物であって、経済的に重要な農作物のうちの一つである。この作物の生産量増大のために雄性不妊導入によるF1ハイブリッド生産は、全世界の研究者が注目している技術開発である。稲においても細胞質雄性不妊(CMS)方式が可能であるが、生産費用や実際利用面においては現実的でなく遺伝子操作による雄性不妊形質転換体開発方式にはタペチュム(tapetum)特異的プロモーターを利用して外部毒性遺伝子(バクテリアまたは植物体遺伝子)を利用して選択的な雄蕊組織の死滅を誘導することにより雄性不妊を作る方法が利用されている。
種子発芽のための栄養供給は胚乳に保存された澱粉と貯蔵蛋白質を加水分解することにより得られ、従って、CysPは夫々麦と稲における主要貯蔵蛋白質であるホルデイン(hordein)、グルテンの加水分解の責任を負う主要酵素として報告されている(非特許文献2)。
また、CysPは細胞が細胞予定死(programmed cell death;PCD)を経験するに寄与する役割を有するが(Solomon et al.,1999)、これと関連して豆細胞において前記酵素の生産がPCDの間に増加し調節されるのが発見された。
Shutov and Vaintraub.1987;Ryan and Walker-Simmons,1991;Ho et al.,2000 Rostogi and Oaks,1986;Kato Minamikawa,1996
本発明の別の目的は、前記遺伝子の稲雄蕊の特異的発現プロモーターを提供することにある。
本発明のまた別の目的は、前記遺伝子の発現抑制を利用した雄性不妊導入稲の生産方法を提供することにある。
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また別の目的により前記遺伝子の発現を抑制して雄性不妊導入稲を生産する方法を提供する。
本発明の遺伝子は稲(Oryza sativa L.)のT-DNA挿入変異株から分離され雄蕊に特異に発現して花粉発達に関与し、ゲノム上の塩基配列としては前記配列番号1で表示される新規のシステインプロテアーゼである。前記rCysP1遺伝子の概略を図示すると図1aの通りであり、その配列を示すと前記配列番号1の通りである。
図1aにおいて、右側の黒色矩形はエキソン(exon)を示し、左側の灰色箱はIPCR(inverse PCR)の結果物であったrCysP1遺伝子のプロモーター部位を指す。逆3角形はT-DNA挿入位置を表示するが、T-DNAはバイナリベクター(binary vector)の右側境界(BR)の左側境界(BL)との間にリポーター遺伝子であるGUS遺伝子と選別遺伝子であるhph(ハイグロマイシン抵抗性遺伝子)を含んでいる。また、矢印はT2子孫(T2 progeny)の遺伝子型分析に用いられた三つのプライマー(a,bおよびc)を示す。
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本発明遺伝子の雄蕊特異的発現プロモーターは、前記配列番号1の塩基配列のうち‐2333番目乃至‐119番目の塩基配列に該当する配列番号4で表示される。前記プロモーターは稲ゲノムDNAから通常的なクローニング方法で得られるが、例えば、配列番号4の塩基配列を利用して適切にプライマーを合成した後、通常的なPCR方法を行うのである。
一方、稲は1株に多数の分げつ枝(tiller)を有しているため、前記分げつ枝を人為的に分離して更に移植する方法により無性繁殖することができる。
<実施例1:rCysP1遺伝子のクローニングおよび配列分析>
(1)先ず、2000年前などにより公知された方法(Jeon et al.,2000.T‐DNA insertional mutagenesis for functional genomics in rice.Plant J.22,561-570参照)によりGUS遺伝子転写体(GUS gene transcript)が無作為でゲノム内に挿入された稲(Oryza sativa L.)のT−DNA挿入変異株を製作し、2003年ゴタンダム等により公知された方法(Gothandam et al.,2003.Identification of anther-specific gene expression from T−DNA tagging rice.Mol.Cells 15,102‐109参照)により前記変異株らのT2世代で見せたGUS発現を探索し、その結果、前記変異株のうち特に雄蕊でGUS発現を見せたT‐DNA標識変異株を選択してその特性を調査した(図4参照)。
IPCRは1988年トリグリア等により公知された方法(Triglia et al.,1988.A procedure for In vitro amplification of DNA segment that lie outside the boundaries of known sequences.Nucl.Acids Res.16,8186)により行われた。Genomic DNA 1μgをPstI制限酵素で12時間切断した。前記反応はエタノール沈澱により止まり、前記DNAは40Ulの水で再懸濁された。その後、前記再懸濁されたgenomic DNAはT4 DNA ligaseにより分子内連結(self-ligation)された。PCR反応はDNA 20ng,1Ex Taqバッファー、0.2mM dNTP,0.5 unit Ex Taqポリマーレーズ(Takara,Japan)およびプライマー1UMを含む50ULの混合物で行われた。前記IPCRで用いられたプライマーは下記の通りである。
5’‐TTGGGGTTTCTACAGGTAAC‐3’(reverse)
5’‐GAACCCGCTCGTCTGGCTAAGATC‐3’(forward)
前記IPCR結果、前記T‐DNAが前記稲ゲノムで1,666bp長さORFの上流部位に融合されたのが明かされ、前記隣接配列に対するデータベース検索結果は前記ORFがcontig8664(http://btn.genomics.org.cn:8080/rice/)、OSJNBa0043A12(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)およびAK107506(http://cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA/)に位置しているのを見せてくれた。
前記配列分析結果は図1の通りであり、ORFが全体490個のアミノ酸を暗号化する。
前記アミノ酸配列に対する調査結果は図2aに示した。図2aにおいて、黒色箱は同一のアミノ酸残基を示し、灰色箱は類似のものを示す。別表はERFNINモチフの保存配列(concensus sequence)を指し、アンダーライン部分はパパイン酵素とシステインプロテアーゼのペプチダーゼ(peptidase)C1ドメインを表示する。また、垂直矢印は翻訳後切断位置(posttranslational cleavage site)と推定される所を表示する。
前記遺伝子は植物から発見されるシステインプロテアーゼらのうち稲のoryzainβとヌクレオチド配列およびアミノ酸配列において、夫々89%,69%の同一性を見せたが、oryzainβはorizainαおよびγと共にシステインプロテアーゼのパパイン酵素科(papain family)に属する(Watanabe et al.,1991)。また、前記rCysP1遺伝子はカテプシンB(cathepsin B)を除く全てのパパイン酵素とステインプロテアーゼに存在するRFNINモチフの保存配列(consensus sequence)を含んでおり(Karrer et al.,1993)、前記保存配列はrCysP1のアミノ酸配列のうち84番位置のグルタミンと103番位置のアスパラギンとの間で発見された。また、Karrer等(1993)が描写した通り、本発明者達はrCysP1とOrizainβが同一のモチフ配列を共有するが(図2a参照)、前記保存配列EX3RX2(V/I)FX2NX3IX3Nは種によって多様であることを発見した。しかし、他のIVステインプロテアーゼとは異なりrCysP1とOryzainβは哺乳動物システムで観察されたようにイソルシンの代わりにバリンを用いるものと明かされた(Akasofu et al.,1989)。パパイン酵素科に属するもののうち保存される180番位置のシステイン、297番位置のヒスチジンおよび339番位置のアスパラギンなどの特徴的触媒3対(catalytic triad)が前記rCysP1のアミノ酸配列においても観察された(図1b参照)。一方、このような結果は植物から発見される代表的なシステインプロテアーゼに対する系統分析結果と一致するのであった。前記系統分析結果は図2bに示し、図2bで用いられたシステインプロテアーゼは、じゃが芋(potato;Solanum tuberosum,CAB53515.1)、トマト(tomato;Lycopersicon esculentum,Y06416)、豌豆(garden pea;Pisumsativum,S24602)、白菜科(brassica o.;Brassica oleracea,AAL60579.1)、樅(Douglas fir;Pseudotsuga menziesii,JC4848)、クローブピンク(clove pink;Dianthus caryophyllus,AAA79915.1)、三度豆(phaseolus v.;Phaseolus vulgaris,CAB17076.1)、スプリングベッチ(spring vetch;Vicia sativa,S47312)、煙草(tobacco;Nicotiana tabacum,T03941)、アラビドプシス(arabidopsis;Arabidopsis thaliana,AAK92229.1)、レープ(rape;Brassica napus,JQ1121)、玉蜀黍1(maizel;Zea mays,AAB70820.2)、玉蜀黍2(maize2;Zea mays,T01206)、玉蜀黍3(maize3;Zea mays,T01207)、オリザイン a(oryzain a;Oryza sativa P25777)、麦(barley;Hordeum vulgare,T06208)、クリスマス(Christmas;Sandersonia aurantiaca,AAD28477.1)、薩摩芋(sweet potato;Ipomoea batatas,AAK27968.1)である。
従って、前記結果を総合してみるとき、前記rCysP1遺伝子は稲でシステインプロテアーゼを暗号化したのが分かった。
稲の葉を窒素溶液に入れて粉砕した後、抽出溶液(extraction buffer,100mM Tris‐HCl,pH8.0,50mM EDTA,500mM NaCl,1.25% SDS)で懸濁した。次いでフェノール/クロロホルム(1:1.v/v)で抽出した後、前記水相(aqueous phase)はエタノール沈澱により濃縮した。前記沈殿物はTEバッファー(10mM Tris‐HCl,pH7.4,1mM EDTA)で再懸濁された。このように分離抽出されたgenomic DNA 13Ugを前記rCysP1配列には存在しない三つの互いに異なる制限酵素EcoRI,HindIIIおよびPstIにより切断し、0.8%アガロースゲルで電気泳動した後、変性および中和反応を経てナイロン膜上にブラッチングさせた。前記膜(membrane)を65℃で2時間前処理した後、32Pと標識されたrCysp1特異的な二つの探針で一夜混成化させた。前記二つのフローブはrCysP1全体クーロン(full‐length rCysP1 clone)と前記遺伝子の5’上流部位から製作した。混成化後、前記膜は2SSC,0.5% SDSで5分ずつ洗浄した。更に2SSC,0.1% SDSで65℃で5分ずつ2回洗浄した。
その結果を図3aに示した。図3aにおいて、EはEcoRIを、HはHindIIIを、PはPstI酵素を表示する。1〜3番レーンは全体クローン(full-clone)探針で混成化した結果を示し、4〜6番レーンは5’UTR部位探針で混成化した結果を示す。サイズ表示は左側にした。
前記全体遺伝子(full-gene)の探針から由来した結果は1個以上のバンドで混成化され、このような事実はrCysP1遺伝子が前記稲ゲノムで小さい遺伝子集団として存在することを暗示した(図3a参照)。一方、前記rCysP1遺伝子の5’上流部位から製作された探針の場合には前記ゲノムでrCysP1遺伝子のみを認識した(図3a右側参照)。
rCysP1遺伝子の発現様相を調査するためにRT‐PCR分析を行った(図3参照)。
(1)先ず、稲の雄蕊器官(anther)、雄蕊を除く他の花器官(anther‐less flower)、葉、根におけるrCysP1遺伝子の転写体蓄積および互いに異なる三つの発達段階(young,immature,mature)にある花器官における時間的発現を知るために前記器官らからRNA分離キット(TRI reagent,Molecular Research Center,Cincinnati,OH)を利用してtotal RNAを抽出し、該total RNAの逆転写酵素を利用してcDNA筋を合成した。RT‐PCRは94℃で30秒、55℃で30秒および72℃で50秒を30回繰り返し、そして72℃で5分間延長過程(extension)の条件で行い、rCysP1転写体を探知するためのプライマーは下記の通りである。
5’‐AAGTGCAACCTCGCCAAGAG‐3’(forward)
5’‐CCGGAGTCCTGATATTGTACG‐3’(reverse)
一方、オーエスアクチン(OsActin)を対照区として用い、そのプライマーは下記の通りである。
5’‐TCCATCTTGGCATCTCTCAG‐3’(forward)
5’‐GTACCCGCATCAGGCATCTG‐3’(reverse)
5’‐TGACATCAACAGGGAAAATGCT‐3’(forward)
5’‐GTGTTCAGTTTAGCGAGCGTG‐3’(reverse)
その結果を図3dに示した、図3dにおいて、1dは発芽1日目、3dは発芽3日目、5dは発芽5日目を意味する。図3dを見ると、Oryzainβの転写体は既に研究された通り、種子発芽過程のうち著しく蓄積されたことが分かった(Watanabe et al.,)。しかし、rCysP1の転写体蓄積は稲花の雄蕊で多少特異的であり、発芽する種子では非常に制限された量で現れた。前記結果はrCysP1遺伝子の1番目の役割は発芽過程でなく花粉発達に関与するものであるのを暗示した。
前記rCysP1遺伝子のプロモーター活性を決定するために前記rCysP1‐標識されたT−DNA挿入稲のT2世代を利用した組織化学的GUS分析を行った(図4参照)。
稲の花器官、根器官、葉器官を収集してGUS分析を行い、稲花は雄蕊器官と雄蕊以外の他の花器官に細分化した。本発明でのGUS活性の組織化学的分析は1987年ジェファーソン等により公知された方法(Jefferson et al.,1987.GUS fusion:β‐glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants.EMBO J.6,3901‐3907参照)にやや変更を加えて行ったが、観察組織を100mMの燐酸ナトリウム、pH7.0の0.1% BCIP(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-B-D-glucuronide)、5mMのフェロシアンカリウム(potassium ferrocyanide)、5mMのフェリシアンカリウム(potassium ferricyanide)、10mMのEDTA、0.5%のトリトン(Triton)X‐100および20%のエタノールを含有する溶液に入れて37℃の培養器に1夜間放置した後、70%のエタノールで洗浄して立体顕微鏡で観察した。また、時間による前記薬におけるGUS発現分析を行い、前記プロモーター活性をもっと詳細に分析するためにrCysP1突然変異植物から採取した雄蕊器官を4%(w/v)のパラホルムアルデヒド(paraformaldehyde)、0.5%(v/v)のグルタールアルデヒド(glutaraldehyde)および100mMのフォスフェートバッファー(phosphate buffer,pH 7.0)を含む溶液に4℃で1夜間固定して組織を準備し、前記雄蕊組織をエタノールで完全に脱水した後、アクリル樹脂内で固め、超マイクロトムを利用して1Um大に切開した。その後、サフラニンO(Safranin O)で染色して光学顕微鏡で観察した。
その結果を図4に示した。図4aは互いに異なる発達期にある花器官のGUS発現結果を見せてくれ、4bはGUS遺伝子が発現された雄蕊器官を切開して光学顕微鏡で観察したものであって、前記rCysP1遺伝子の発現位置を見せてくれる。4cは雄蕊部位(anther locule)に限定されたGUS発現(矢印の頭部分)を見せてくれ、4dおよび4eは夫々GUS発現が現われない葉部位とを根部位を示す。Aは雄蕊(anther)、S1は不妊性外翳(sterile lemma)、Pはパレア(palea)、Poは花粉(pollen)、Tはタペチュム(tapetum0、Vは管束(vascular bundle)を意味する。
(1)T−DNAの遺伝学的分離を研究するために前記rCysP1−標識されたT−DNA挿入稲のT2‐子孫を養成して遺伝子型を分析した。
全19個のT2子孫の幼葉からgenomic DNAを抽出してこれを前記遺伝子の同型性または異型性を決定するための遺伝子型分析に利用した。PCR反応は94℃で1分、57℃で1分、72℃で2分の条件で35回行い。下記配列のa,b,c三つのプライマーを用いた。
・プライマーa(rCysP1 gene‐specific forward primer)
:5’‐ATCGAAAAGAAGACCTAAAGAAGCA‐3’
・プライマーb(rCysP1 gene‐specific reverse primer)
:5’‐AACTTGAGGTTGTCCCTACAGGACGTAAC‐3’
・プライマーc(T‐DNA border‐specific reverse primer)
:5’‐TTGGGGTTTCTACAGGACGTAAC‐3’
図5aのその概略図に表現された通り、前記aプライマーはrCysP1遺伝子の上流部位から製作されたフォーワードプライマー(forward primer)であり、bプライマーはrCysP1遺伝子のコーディング領域から製作されたリバースプライマー(reverse primer)である。一方、cプライマーはT−DNA部位から製作されたリバースプライマー(reverse primer)である。a+cのプライマー組合は0.9kbのPCR断片を生産するため単にこのような増幅のみを許容するT2植物は同型接合体であろうと期待された。a+bプライマー組合によるDNA断片(16.5kb)は増幅するにはあまり大きためである(図5a参照)。しかし、野生型植物はゲノム内にT‐DNAが挿入されなかったためa+bプライマーであり、組合による唯一つの1.1kbのPCR断片のみを生産する反面、異型接合T2植物はa+cおよびa+bプライマー組合による0.9kb、1.1kb PCR増幅が可能である。
その結果を図5bに示した。前記図5bを見ると、2,5,9,10,11,14,15,17レーンの8個の形質転換植物は同型接合であり、1,3,4,6,7,8,12,13,16,19レーンの10個の形質転換植物は異型接合であった。残りの18番レーンの植物は野生型であった。このような結果は前記T−DNAが次の世代に同一−分離されることを立証した。
その結果を図5および図6に示した。前記rCysP1同型接合突然変異植物は、種子発芽において約7日〜9日ほど遅延される様相を示したが、結局には完全に成熟した植物に成長した。17個のrCysP1突然変異と24個の野生型植物を準備して植物の長さ(plant height)を分析した結果、rCysP1突然変異植物は野生型に比べて長さの成長が減少する矮小性(dwarfism)を見せ(図5d,5fおよび6a参照)、根および茎成長においては正常的であったが(図5c参照)、全体的な成長は深刻に阻害された(図5f参照)。また、前記突然変異植物は花を有する正常的な円錐花序(panicle)を形成した。しかし、46個のrCysP1突然変異と75個の野生型植物の円錐花序を分析した結果、前記突然変異植物の円錐花序は修正されないまま継続緑色に残っている花を多数個含んでおり(図5e,矢印参照)、修正された種子の比率も野生型に比べてずっと低く(図6b参照)、開花も約15日程遅れた。これは雄蕊の非正常的な発達のためであると判断された。
一方、前記rCysP1突然変異植物と野生型植物から雄蕊器官をテトラゾリウム染色して光学顕微鏡で観察した。前記染色は50%のスクローズ(sucrose)に1%(w/v)の2,3,5‐トリフェニルテトラゾリウムクロライド(triphenyltetrazolium chloride)水溶液を含む溶液を利用して28℃の暗条件下で1時間行った。その結果、前記同型接合植物の多くの雄蕊器官が生育可能な花粉を含んでいないことが分かり(図6c参照)、結果的に、前記rCysP1突然変異は種子形成の数が減少する現象を現した(図6b参照)。
花粉発達において、野生型植物と前記rCysP1突然変異間の差異点を調査するために雄蕊切断組織(anther sections)を光学顕微鏡で観察したところ、前記雄蕊器官の細胞学的な特徴は花粉母細胞期(pollen mother cell stage)で二つ、4分子期(tetrad stage0で二つ、小胞子期で一つ、単核花粉期(uni‐nucleated pollen stage)で二つ、液胞化花粉期(vacuolated pollen stage)で一つ、そして成熟花粉期(mature pollen stage)で二つに構成される全10個の発達段階に細分化して調査した。
野生型と前記rCysP1突然変異稲の花器官を分離して4%(w/v)のパラホルムアルデヒド(paraformaldehyde)、0.5%(v/v)のグルタールアルデヒド(glutaraldehyde)および100mMフォスフェートバッファー(phosphate buffer,pH 7.0)を含む溶液に4℃で1夜間固定してサンプルを準備した。次いで、前記サンプルをエタノール連続処理過程(ethanol series)により脱水し、アクリル樹脂(London Resin Company,London,UK)に入れて固めた。前記樹脂に固定されたサンプルを超マイクロトム(LKB,Bromma 2088)を利用して1Um大に切開し、0.1%炭酸ナトリウムを含む0.5%トルイジンブルー(toluidine blue)で染色した。前記組織部位は光学顕微鏡(Zeiss)で調査した。一方、前記rCysP1標識された雄蕊器官におけるGUS発現を調査するために雄蕊サンプルを実施例3に記載されたものと同一の方法で準備および切開し、サフラニンO(Safranin O)で染色した後に光学顕微鏡で調査し、実施例4に記載されたものと同一の方法でテトラゾリウム染色した後に観察した。
Claims (3)
- 稲(Oryza sativa L.)の雄蕊に特異的に発現して花粉発達に関与する配列番号1の塩基配列およびアミノ酸配列からなるシステインプロテアーゼ遺伝子。
- 配列番号4の塩基配列からなる稲(Oriza sativa L.)の雄蕊の特異的発現プロモーター。
- 請求項1の遺伝子の発現をT-DNA挿入により抑制させ、それからT2子孫を得た後、前記T2子孫のうち長さ成長が減少する矮小性、遅い開花および遅い種子発芽と共に花粉成長抑制を見せた突然変異植物を分裂により無性繁殖することを特徴とする雄性不妊導入稲の生産方法。
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