KR20050079085A

KR20050079085A - 환경스트레스 칼슘신호전달 관련 인산화 효소와 유전자

Info

Publication number: KR20050079085A
Application number: KR1020040007202A
Authority: KR
Inventors: 윤인선; 이정숙; 차영순
Original assignee: 대한민국(관리부서:농촌진흥청)
Priority date: 2004-02-04
Filing date: 2004-02-04
Publication date: 2005-08-09
Also published as: KR100614418B1

Abstract

본 발명은 신규 칼슘신호전달 인산화 효소인 OsPK1과 이 효소를 암호화하는 유전자에 대한 것이다. 스트레스 처리한 벼에서 분리한 상기 유전자는 칼슘신호, 저온 및 염 스트레스에 유전자 발현이 유도되며 CIPK(CBL-interacting protein kinase) 계열의 인산화 효소를 암호화한다. 상기효소는 아기장대 칼슘센서 단백질의 일종인 calcineurin (CBL)을 인산화시키는 고유활성이 있으며, 인산화 활성은 C 말단 부위에 의해 조절된다. 본 발명에서 제공하는 인산화 효소 및 활성조절 정보는 스트레스 내성 작물 개발에 이용할 수 있다.

Description

환경스트레스 칼슘신호전달 관련 인산화 효소와 유전자{A novel protein kinase gene which may be involved in calcium signaling in stress responses of rice and its encoded protein}

본 발명은 벼에서 분리한 신규 칼슘신호전달 인산화 효소인 OsPK1과 상기 효소를 암호화하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 형질전환 숙주, 상기 효소에 대한 특이적 항체 및 이들의 활용에 관한 것이다. 또한 본 발명은 칼슘 신호전달 기구의 상위 조절자인 칼슘센서 단백질과 관련된 인산화 효소의 활성을 조절하여 식물의 스트레스 저항성을 증진시키는 방법에 관한 것이다.

칼슘이온은 식물의 다양한 스트레스 반응을 매개하는 2차 전달물질로서, 세포내 칼슘센서 단백질과 결합 후 일련의 신호전달과정을 통해 식물의 스트레스 저항성을 유도한다.

식물의 환경스트레스 신호전달에서 칼슘은 주요 신호전달 물질로서 스트레스에 반응해서 세포내 농도가 올라가며(Knight et al. Plant J. 12:1067-1078 (1997)), 이 과정은 일부 스트레스 유도 유전자의 발현에 필수적이다(Knight et al. Plant Cell 8:489-503 (1996), Sheen, Science 274:1900-1902 (1996)). 칼슘은 다양한 칼슘센서단백질과 상호작용을 통해 스트레스 신호를 전달하여 생리반응을 유발하는 것으로 알려져 있다. 식물에서 지금까지 잘 알려져 있는 칼슘센서는 calmodulin, CDPK 등으로, 이들 칼슘센서는 칼슘과 결합하여 다양한 표적 단백질(target protein)의 활성을 조절하는 역할을 한다(Zielinski, Annu.Rev.Plant Physiol. Plant Mol. Bio. 49:697-725 (1998)). Calcineurin B like protein (이하 CBL로 명명)은 최근 아기장대에서 분리된 칼슘센서 단백질의 일종으로 small gene family를 구성하고 있으며(Kudla et al. PNAS 96:4718-4723 (1999)), knock out mutant나 과발현 형질전환체 연구를 통해 식물의 염 스트레스 저항성 (AtCBL4) 및 저온 스트레스 반응 (AtCBL1)을 매개하는 중요한 신호전달 분자임이 밝혀졌다(Liu and Zhu, Science 280:1943-1954 (1998), Albrecht et al. Plant J 36:457-470 (2003)). CBL 자체는 효소활성이 없으나 yeast two hybrid 탐색을 통해 CIPK(CBL-interacting protein kinase)/SIP(SOS3 interacting protein kinase)라는 SNF1 계열의 특정 protein kinase와 결합하며, 일부의 경우 kinase 활성을 촉진한다는 사실이 규명되었다(Shi et al. Plant Cell 11:2393-2405 (1999): Halfer et al. PNAS 97:3735-3740 (2000)). 특히 CBL과 마찬가지로 일부 CIPK 역시 염 및 저온스트레스 신호전달에 중요한 기능을 수행한다는 사실이 알려졌다(Liu et al. PNAS 97:3730-3734 (2000): Gong et al. H. Biol. Chem. 277:28340-28350 (2002): Kim et al. Plant Cell 15:411-423 (2003)). 따라서 상기 연구보고들에 근거할 때, 아기장대에서 밝혀진 CBL/CIPK 칼슘 신호전달 기구의 주요 기능이 식물의 스트레스 반응과 관련되어 있으며, 이를 이용한 스트레스 저항성 식물 생산에 유용 가치가 큰 것으로 판단된다.

지금까지 환경저항성 작물개발은 주로 하위단계의 스트레스 반응 유전자 또는 이를 조절하는 전사인자(예를 들면, CBF, ABF, EREBP 등)를 중심으로 시도되었으나(Kang et al. Plant Cell. 14(2):343-57 (2002): Haake et al. Plant Physiol. 130(2):639-48 (2002): Park et al. Plant Cell. 13(5):1035-46 (2001)) 최근에는 CaM이나 CDPK 등 상위 칼슘센서 유전자의 조작을 통해 광범위한 환경스트레스 조절이 가능하다는 사실이 일부 밝혀졌다(Saijo et al. Plant J. 23:319-237 (2000); Cheng et. al. Plant Physiol 129:469-485 (2002)).

따라서 다양한 식물체 특히 작물에서 칼슘센서 신호전달기구를 구성하는 상위개념의 중점유전자를 발견하여 분리하고 이들의 기작을 연구하여 식물체의 환경 스트레스 저항성을 증대시킬 수 있는 방안의 모색이 요청되고 있다.

본 발명은 식물의 환경스트레스 반응을 매개하는 칼슘신호전달 protein kinase 유전자를 분리하고, 단백질의 작용기작을 구명하여 재해저항성 작물개발에 이용하고자 한다. 특히 주요 작물인 벼 고유의 CIPK 유전자를 분리하고, 이 유전자의 발현이 벼의 스트레스 반응과 연관되어 있는지를 확인하며, 이 유전자로부터 생성된 단백질의 주요 생화학적 특성을 규명하여, 칼슘신호전달 기구 및 환경저항성 조절에 이용 가능성을 분석하고자 하는 것이다.

따라서 본 발명의 목적은 식물체의 환경 스트레스 반응을 매개하는 신규 칼슘신호전달 인산화 효소 및 이를 암호화하는 유전자를 분리하고 특성을 밝히는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 효소 또는 유전자를 이용하여 식물의 재해저항성을 증진시키는 방법을 제공하는 것이다.

전술한 바와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명은, 스트레스 처리한 벼에서 분리한 인산화 효소 OsPK1의 아미노산 서열인 서열 1, 및 서열 1과 85% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열로 이루어져 있으면서 칼슘신호전달 인산화 효소활성이 있는 단백질, 및 상기 단백질을 이용하여 식물체의 환경 스트레스 저항성을 조절하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은, 서열 1의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자, 또는 서열 1과 85% 이상의 상동성을 가지고, 칼슘신호전달 인산화 효소활성이 있는 단백질을 코딩하는 유전자, 또는 서열 2의 염기 서열로 이루어진 유전자에 관한 것이다.

또한 본 발명은, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포에 관한 것이다.

또한 본 발명은, 인산화 효소활성이 있는 상기 단백질의 262번 아미노산 이후 C-말단의 전부 또는 일부가 결실되어 있고, 원래 단백질에 비해 낮은 자가 인산화(autophosphorylation) 활성과 높은 기질 인산화(MBP phosphorylation) 활성을 가지는 단백질을 제공한다.

또한 본 발명은, 인산화 효소활성이 있는 상기 단백질에 특이적으로 반응하는 항체와, 이 항체를 이용하여 상기 단백질 또는 그와 유사한 단백질을 검출 및 분리하는 방법과, 이 항체를 이용하여 상기 단백질의 효소활성을 조절하는 방법과, 이 항체를 이용하여 상기 단백질의 표적 단백질의 활성을 조절하는 방법에 관한 것이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에 의한 상기 유전자는 저온 처리 한 벼 유묘에서 분리한 것으로서, 저온 처리에 의해 발현이 강하게 유도되는 유전자를 선발하여 이를 OsPK1으로 명명한 것이다. 상기 유전자에 암호화된 효소는, 아래의 실시예 2에서 확인된 바와 같이, 121 bp의 ′UTR과 1,350 bp의 coding region, 123 bp의 3′UTR로 이루어진 449개 아미노산으로 구성된 50.9 kD의 단백질(도 2B 참조)이다.

상기 OsPK1 단백질은 ser/thr protein kinase로서 특히 CIPK 또는 PKS(SOS2-like protein kinase) 계열과 높은 아미노산 서열 유사성을 나타낸다. OsPK1 단백질은 특히 Arabidopsis의 저온신호전달을 조절하는 것으로 최근 밝혀진(Kim et al. Plant Cell 15:411-423 (2003)) AtCIPK3와 70% 정도의 높은 상동성을 보인다.

도 2B에 도시된 바와 같이, 상기 OsPK1 단백질은, N-말단 부위에 SNF1-related protein kinase domain을, C-말단부위에는 regulatory domain을 가지는 CIPK 계열 단백질의 특징을 보이며, CBL과 상호작용하는 데 필수적인 것으로 알려진 NAF motif가 잘 보존되어 있다. 반면 NAF motif 이외 C-terminal domain의 아미노산 서열은 유사성이 낮다. 이는 본 발명에 의한 상기 OsPK1 단백질이 종래 알려진 protein kinase들과는 다른 고유한 기능이 있는 신규 칼슘신호전달 인산화 효소 (CIPK)임을 확인해 주는 것이다.

본 발명에 의한 OsPK1 유전자는 뿌리에서는 발현되지 않으며, 줄기나 잎 등 광합성조직에서 주로 발현되며(도 3A 참조), 저온 처리, 고농도 염스트레스나 칼슘처리에 의해서 발현이 크게 유도된다(도 3B). 이처럼 OsPK1 유전자가 벼의 잎에서 칼슘 또는 저온 처리에 의해 유전자 발현이 강하게 유도된다는 사실은 상기 유전자가 벼의 저온신호 전달에 관련된 유전자임을 증명하는 것이다.

본 발명에 의한 OsPK1 유전자의 염색체 내 존재형태에 관하여 조사한 바(하기 실시예 4 참조), 이 유전자는 벼의 염색체 3에 single copy로 존재하는 것으로 밝혀졌다(도 4A, 4B).

이렇게 확인된 본 발명에 의한 1,594 bp 크기의 OsPK1 유전자를 pBluescript에 subcloning하여 pSK-OsPK1 벡터를 제작하고, 이를 통상의 방법으로 E.coli DH5 alpha 균주에 도입하였다. 상기 pSK-OsPK1 벡터가 도입된 숙주(E.coli DH5 alpha)를 농업생명공학연구원 농용미생물보존센터(KACC)에 기탁하여 2004. 1. 28자로 기탁번호 KACC 95027를 부여받았다.

OsPK1 단백질을 생산하고, 생화학적 특성을 규명하기 위해 GST fusion 단백질 발현 벡터를 다음과 같이 제작하여 숙주에 도입(형질전환)한 다음 통상의 방법으로 재조합 OsPK1 단백질을 생산, 분리하였다(하기 실시예 5의 (1)). 분리된 OsPK1 재조합 단백질의 반응특성을 조사한 바(하기 실시예 5의 (2)), OsPK1 재조합 단백질이 자가 인산화 (autophosphorylation) 및 기질 인산화(MBP phosphorylation) 활성이 있으며, kinase 활성이 Mn²⁺ 농도에 의존적임이 확인되었다(도 6A). 또한 OsPK1 단백질의 C-말단 쪽의 158개 아미노산이 결실된 경우, 자가 인산화 활성은 크게 감소되고 기질 인산화 활성은 오히려 증가하는 특성을 보인다(도 6B). 이러한 사실은 본 발명에 의한 OsPK1 단백질의 C-말단 영역이 kinase 활성조절 능력이 있는 도메인 영역임을 증명하는 것이어서, OsPK1의 활성을 C-말단 결실 등 방법을 통해 인위적으로 조절할 수 있다는 것을 보여준다. 본 발명에 의한 OsPK1 유전자의 이러한 특성은 단백질을 이용한 스트레스 내성 작물 생산에 유용할 것으로 기대된다. 하기 실시예 5에서는 OsPK1 단백질의 C-말단 쪽의 158개 아미노산이 결실된 불완전 단백질을 대상으로 C-말단 결실에 의한 활성특성 변화를 검토하였다. 그러나 291개 아미노산으로 이루어지는 잔류하는 잔류 단백질의 10% 정도가 추가로 결실되더라도 kinase의 catalytic domain을 모두 포함하므로 일반적으로 그 활성에 큰 변이가 없는 것으로 예측할 수 있다. 따라서 본 발명에서는 OsPK1 단백질의 262번 아미노산 이후 C-말단의 전부 또는 일부가 결실되어 있고, OsPK1 단백질에 비해 낮은 자가 인산화 활성과 높은 기질 인산화 활성을 가지는 단백질도 특허권리로 청구한다.

본 발명에서는 OsPK1 단백질에 대한 항체를 제작하고, 제작된 항체의 반응 특이성을 조사하였다(하기 실시예 6 참조). 즉, 생산된 GST-OsPK1 재조합 단백질을 단백질 분해효소로 처리하여 GST moiety가 절단?제거된 OsPK1 단백질을 얻고 이를 토끼에 주입하여 항체 생산 유도한 후 혈청 및 IgG를 분리하였다. 제작된 OsPK1 항체의 반응특성을 분석한 바(도 7A), GST는 물론 벼 유래의 다른 SNF1 계열의 인산화 단백질과 반응하지 않아 항체 특이성이 있음이 확인되었다. 이러한 항원-항체 특이성을 활용하여 항체를 이용한 OsPK1 특이적인 단백질의 기능조절 또는 상호작용 단백질의 발견과 분리 등이 가능하게 될 것이다.

과연 본 발명에 의한 OsPK1 재조합 단백질이 AtCBL3 단백질을 인산화시킬 수 있는지를 확인하였다(실시예 7). 유전자 재조합 방법으로 생산된 GST-AtCBL3 재조합 단백질을 적절한 반응조건에서 GST-OsPK1 재조합 단백질로 처리하였을 때 AtCBL3 단백질이 OsPK1 kinase에 의해 인산화되었다(도 9).

신호전달 분자에 있어서 단백질 인산화는 그 활성을 조절하는 중요한 기작으로 알려져 있다. 따라서 위와 같은 결과들은, OsPK1 또는 OsPK1의 결실돌연변이를 이용하여, 칼슘센서 단백질 calcineurin의 활성을 조절하거나 CBL/CIPK 신호전달 방향을 조절할 수 있음을 보여주는 것이다.

이하 실시예를 들어 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 명확하게 설명하기 위한 예시적인 것이므로 본 발명의 기술적 사상의 범위가 이에 의해 변경되거나 축소되는 것은 아니다.

실시예 1: 벼로부터 OsPK1 유전자의 분리

저온처리된 벼 유묘의 cDNA 유전자은행을 제작하고 reverse Northern 방법으로 본 발명에 의한 OsPK1 유전자를 분리하였다.

6℃에서 24시간 저온처리한 벼 유묘에서 분리한 poly A+ RNA로부터 cDNA를 합성하고 이를 lambda Zap II vecto (Stratagene)에 연결 후, in vitro packaging 하여 cDNA 유전자 은행을 제작하였다.

이어서 reverse Northern 방법에 의해 스트레스 유도 유전자군을 차등 선발하였다. 이를 위하여 XLOR cell에서 in vivo excision하여 분리한 cDNA 플라스미드를 Nylon membrane(Hybond N+)에 blotting 한 후 저온 및 ABA를 처리한 벼 유묘에서 분리한 poly A+ RNA에서 합성한 first cDNA를 ³²P로 표지하여 각각 hybridization 하였다(도 1의 (A) 참조). reverse Northen 결과(도 1의 (B) 참조), 저온처리에 의해 발현이 강하게 유도되는 유전자를 선발하여 이를 OsPK1으로 명명하였다.

실시예 2: OsPK1 유전자의 서열 및 단백질의 구조적 특성 분석

전기 실시예 1에서 선발된 OsPK1 유전자의 전체 염기 서열, 이 유전자가 암호화하는 OsPK1 단백질의 아미노산 서열 및 상기 단백질의 구조적 특성을 분석하였다.

(1) 서열 특성

선발된 OsPK1 유전자는 121 bp의 ′ UTR과 1,350 bp의 coding region, 123 bp의 3′UTR로 구성되어 있는 것을 확인하였다(도 2A 참조). ORF(Open Reading Frame)는 449개 아미노산으로 구성된 50.9 kD의 단백질을 암호화하였다. 데이터베이스(NCBI, BLAST)를 이용한 상동성 분석 결과, 본 발명에 의한 OsPK1 단백질은 ser/thr protein kinase로서 특히 CIPK(CBL-interacting protein kinase) 또는 PKS(SOS2-like protein kinase) 계열의 Arabidopsis 단백질과 높은 아미노산 서열 유사성을 보이며, 특히 Arabidopsis의 저온신호전달을 조절하는 것(Kim et al. Plant Cell 15:411-423 (2003))으로 최근 밝혀진 AtCIPK3와 68.9 %의 높은 상동성을 보였다. 따라서 본 발명에서는 아미노산 서열의 상동성이 본 발명에 의한 OsPK1 단백질의 아미노산 서열에 더 가까우면서―즉, OsPK1 단백질과 AtCIPK3 단백질의 상동성이 약 70%이므로, OsPK1 단백질의 아미노산 서열 상동성이 85% 이상이면서―칼슘신호전달 인산화 효소활성이 있는 단백질을 권리로 청구한다.

(2) 단백질의 구조적 특성

아미노산 서열에 근거하여 본 발명에 의한 OsPK1 단백질의 구조적 특징을 분석하였다.

상기 아미노산 서열에 대하여 NCBI GenBank BlastX로 검색한 바, Ser/Thr kinase 중 특히 SNF1-related kinase와 가장 상동성이 높았으며 Ser/Thr kinase의 catalytic domain 특이적인 12개의 conserved subdomain이 OsPK1의 N말단에 위치함을 확인하였다. 특히 CIPK 계열 단백질의 특징이며 CBL과 상호작용하는 데 필수적인 것으로 알려진 NAF motif가 잘 보존되어 있었다(도 2B 참조). 이로부터, 상기 단백질의 N-말단 부위에 SNF1-related protein kinase domain이, C-말단부위에는 CIPK 계열 특이적인 regulatory domain이 위치하고 있음을 유추할 수 있다.

또한 유사계열의 유전자군이 코딩하는 단백질들의 아미노산 서열을 LaserGene 분석프로그램(DNASTAR)을 이용하여 비교한 결과 catalytic domain과 NAF domain은 상동성이 높았으나 C-말단부위의 유사성은 낮았다.

이는, OsPK1 단백질은 종래 환경 스트레스 저항에 관련된 인산화 효소들과는 상이한 고유의 기능이 있음을 시사한다. 따라서 OsPK1 유전자의 구조적 특징에 근거할 때, 이 유전자가 신규 칼슘신호전달 인산화 효소(CIPK)임을 재확인 할 수 있었다.

실시예 3: OsPK1 유전자의 발현양상 분석

식물체의 어느 조직에서 OsPK1 유전자가 발현되는지, 어떤 조건에서 OsPK1 유전자가 발현되는지를 검토하였다.

온실 토양재배, 또는 배양실내 수경 재배한 벼 유묘 및 성체에서 각 조직별로 RNA를 추출, 전기영동으로 분리하여 nylon membrane에 blotting 한 후 32P로 표지한 OsPK1 cDNA를 이용하여 Northern hybridization을 수행하였다. 그 결과 OsPK1 유전자는 뿌리에서는 발현되지 않으며, 줄기나 잎 등 광합성 조직에서 주로 발현되고 있음을 알 수 있었다(도 3A 참조).

OsPK1 유전자의 발현조절을 분석하기 위해, 2주간 키운 벼 유묘를 각 시간별로 저온처리(4℃) 하거나 NaCl 또는 CaCl2를 각 농도별 24시간 처리 후 shoot로부터 RNA를 분리하여 Northern 분석을 수행한 결과, 저온 처리에 의해 이 유전자의 발현이 강하게 유도되며, 고농도 염스트레스나 칼슘처리에 의해서도 발현이 크게 유도된다는 사실을 확인하였다(도 3B).

이처럼 OsPK1이 벼의 잎에서 칼슘 또는 저온 처리에 의해 유전자 발현이 강하게 유도된다는 사실은 상기 유전자가 벼의 저온신호 전달에 관련되어 있음을 재확인해 준다.

실시예 4: OsPK1 유전자의 존재 형태 분석

식물체에서 OsPK1 유전자의 존재 형태를 조사하였다.

벼 유묘잎에서 CTAB 방법으로 추출한 genomic DNA 15 ug을 각 제한효소(Hind III, Kpn I, Xba I, Xho I, EcoR I)로 절단하고 전기영동으로 분리하여 nylon membrane에 blotting 한 후 32P로 표지한 OsPK1 cDNA를 이용하여 high stringency 조건(65℃, 2 X SSPE)에서 hybridization을 수행하였다. Kpn I과 Xba I에 의한 단일 밴드, EcoR I 과 Hind III에 의한 두개의 밴드가 나타난 실험 결과는 OsPK1이 single copy로 존재한다는 것을 보여준다(도 4A).

밀양23호와 기호벼를 교배하여 얻은 164 계통의 재조환 자식 계통(MG RI 집단)을 이용하여 OsPK1의 염색체상의 위치를 분석하였다. 각 계통으로부터 genomic DNA를 분리하고, 제한효소로 절단하여 전기영동하여 나일론막에 blotting 후 ³²P로 방사선 표지한 OsPK1 cDNA를 이용하여 Southern hybridization을 실시하여 유전 분석 집단 내에서 분리 정보를 얻었다. 이 분리 정보와 이미 제작된 유전자 지도(MGRImap) 상의 다른 마커들간의 연관 분석을 통해 OsPK1의 염색체 상의 위치를 확인하였고, Kosambi function을 이용하여 유전지도 상의 유전적 거리를 계산하였다(도 4B). 전술한 방식의 조사 및 벼 데이터베이스 검색 결과, 이 유전자가 벼의 염색체 3에 단일 유전자로 위치하고 있음을 보여준다. 이런 결과는 상기 유전자의 고유성을 입증해 준다.

실시예 5: OsPK1 단백질의 활성 측정

(1) OsPK1 재조합 단백질의 생산

OsPK1 단백질을 생산하고, 생화학적 특성을 규명하기 위해 GST fusion 단백질 발현 벡터를 다음과 같이 제작하였다.

OsPK1 유전자의 전체 ORF를 proof reading 기능이 강화된 Taq polymerase (Pyrobest, TAKARA)를 이용하여 PCR 증폭하고 pGEM-T vector(PROMEGA)에 클로닝 후 전 염기서열을 재확인하였다. 이때 사용한 PCR primer는 양 끝에 Sma I 제한효소자리를 첨가하였으며, 염기서열은 다음과 같다:

5'-TTCCCGGGCAATGTATAGGGCTAAGAGGGATGA-3' (sense) 서열 3

5'-ATCCCGGGTCACGCCGCGGCGCCGTTT-3'. (antisense) 서열 4

클로닝한 플라스미드를 Sma I으로 절단하여 얻은 OsPK1 DNA를 벡터 pGEX 5X-3(Amersham)의 Sma I 위치에 삽입하였고, 이 DNA가 GST 단백질의 C 말단에 in frame으로 연결된 것을 염기서열 분석을 통해 확인하였다. 또한 OsPK1의 N 말단 kinase 영역에 대한 단백질을 생산하기 위해, OsPK1의 PCR 산물을 Sma I/Spe I으로 절단후 pBluescript(Stratagene)에 subcloning하였다. 이렇게 제작된 벡터 즉, 1,594 bp의 OsPK1 유전자 전체 cDNA를 포함하는 벡터를 pSK-OsPK1 벡터라 명명하고 이를 통상의 방법으로 E.coli DH5 alpha 균주에 도입하였다. 상기 pSK-OsPK1 벡터가 도입된 숙주(E.coli DH5 alpha)를 농업생명공학연구원 농용미생물보존센터(KACC)에 기탁하여 2004. 1. 28자로 기탁번호 KACC 95027를 부여받았다.

기탁과는 별도로, 상기 pSK-OsPK1 벡터를 Sma I/Not I으로 절단하여 pGEX 5X-3 벡터의 Sma I/Not I 위치에 삽입하여 연결부분의 염기서열을 확인하였다. 이렇게 제작된 두 종류 벡터 pGEX OsPK1F와 OsPK1N(도 5의 A 참조)를 각각 E. coli BL21(DE3) plysS(Novagen)에 도입(형질전환)하고, 37℃에서 A600 이 0.5가 되도록 배양 후 IPTG(0.1 mM)을 첨가하고 2시간 배양하여 재조합단백질을 유도하였다. 배양액을 원심분리하여 균을 회수하고 차가운 TBS 완충액으로 세척한 후 freeze-thaw 방법으로 cell lysate을 얻은 다음 이를 10,000g에서 10분간 원심분리하고, 상등액을 glutathione-agarose column(Peptron, Korea)에 통과시켰다. Column에 결합한 GST-fusion 단백질을 5 mM glutathione으로 용출하여 회수한 단백질을 SDS-PAGE로 확인하였다(도 5의 B).

(2) in vitro protein kinase 활성 측정

전기 (1)에서 수득한 재조합 단백질 0.5～1ug을 기질(myelin basic protein; MBP)과 함께 kinase 활성측정 반응액(10uCi r-32-P-ATP, 20mM Tris-HCl pH7.5, 5mM MgCl₂ 또는 MnCl₂)에 넣고 30℃에서 30분간 배양하였다. 반응액을 5 X SDS sample buffer와 함께 5분간 끓인 후 SDS-PAGE로 단백질을 분리하고 gel을 염색, 건조 후, phosphorimage analyzer(BioRad)를 이용하여 단백질에 포함된 방사능을 측정하였다.

그 결과 (1)에서 수득한 OsPK1 재조합 단백질이 자가 인산화 (autophosphorylation) 및 기질 인산화(MBP phosphorylation) 활성이 있으며, kinase 활성 즉, OsPK1F의 기질 인산화 기능이 Mn²⁺ 농도에 의존적이라는 생화학적 특성을 규명할 수 있었다(도 6A).

한편, OsPK1 단백질의 C-말단 쪽의 158개 아미노산이 결실된 경우(OsPK1N) 자가 인산화 활성이 크게 감소한 반면, 기질 인산화 활성은 오히려 증가하는 특성을 보여(도 6B), C-말단 영역이 kinase 활성조절 능력이 있다는 사실을 규명하였다. 도에서 1, 2, 3은 3중 실험을 의미하며, F는 전체 ORF(OsPK1F), N은 C-말단이 결실된 단백질(OsPK1N)을 의미한다.

이러한 결과는 OsPK1 유전자가 실제 인산화 활성을 가지는 단백질을 암호화한다는 것을 증명해주며, 더 나아가 OsPK1의 활성을 C-말단 결실 등 방법을 통해 인위적으로 조절할 수 있다는 것을 보여준다. 본 발명에 의한 OsPK1 유전자의 이러한 특성은 단백질을 이용한 스트레스 내성 작물 생산에 유용할 것으로 기대된다.

실시예 6: OsPK1 항체 제작 및 반응 특이성 확인

(1) OsPK1 항체 제작

전기 실시예 5에서 glutathione-agarose에 결합시킨 GST-OsPK1 재조합 단백질을 단백질 분해효소인 factor Xa(Amersham)로 처리하고 5mM glutathione으로 용출하여 GST moiety가 절단?제거된 OsPK1 단백질 분획을 얻었다(도 7A). 도 7A는 각 분획물의 SDS-PAGE 사진이다. 도에서 M은 단백질 size marker, P는 freeze-thaw 방법으로 파괴한 E.coli 를 원심분리하여 얻은 침전물로 불용성 단백질 분획, SPT는 원심분리하여 얻은 상등액으로 수용성 단백질 분획, W는 glutathione-agarose 컬럼을 수용액으로 washing하여 얻은 분획, F1~F3는 factor Xa로 절단 후 수용액으로 용출한 OsPK1 단백질 분획, G1~G3는 glutathione으로 용출한 단백질 분획

Glutathione-Agarose 컬럼에 붙어있는 GST-OSPK1 단백질에 factor Xa를 처리하면 GST와 OsPK1이 분리된다. 이 혼합물이 들어있는 컬럼을 수용액으로 washing하면 먼저 OsPK1 단백질이 분리되어 나오고(F1~F3 분획), 2차적으로 glutathione으로 용출하여 GST 단백질 및 반응이 완결되지 않은 GST-OsPK1 단백질이 용출된다(G1~G2 분획).

약 2 mg의 회수된 단백질을 SDS-PAGE를 이용하여 GST가 제거된 OsPK1에 해당하는 단일밴드(F1~F3 분획)를 분리하고 이를 다시 전기영동하여 단일밴드를 재분리하여 얻은 정제된 OsPK1 단백질을 토끼에 2회 주입하고 항체 생산 유도 후 혈청 및 IgG 분획을 분리하였다.

(2) OsPK1 항체 제작의 반응 특이성 분석

제작된 항체의 반응 특이성을 확인하기 위하여, GST-OsPK1 재조합 단백질, GST 및 다른 종류의 kinase 재조합 단백질 2종을 SDS-PAGE로 분리하여 PVDF(Amesham) membrane에 bloting 후 다음과 같이 Western 분석을 수행하였다.

5 % skim milk를 포함하는 TBST 용액으로 1시간 blocking한 membrane을 1/3000로 희석한 OsPK1 항체와 함께 1시간 배양 후, TBST 용액으로 10분간 3번 세척하였다. 1/3000 희석한 HRP-conjugated anti rabbit IgG를 넣고 1시간 배양 후 다시 TBST 용액으로 10분간 3번 세척하고 1/10 희석한 발색시약(Super Signal, Pierce)을 이용하여 발생되는 chemilumenescnece를 X-ray 필름에 감광하여 단백질 밴드를 확인하였다(도 7B). 도 7B에서 M은 size marker, 1은 대장균 단백질, 2는 GST-OsPK1, 3은 GST-OsPK1N, 4와 5는 GST-fused other protein kinase(OsPK1과 비교해서 아미노산 상동성이 각각 50 %, 35%인 두 단백질), 6은 GST를 나타낸다.

비록 제작된 OsPK1 항체와 비특이적으로 반응하는 대장균 유래 단백질이 검출되었으나 GST는 물론 벼 유래의 다른 SNF1 계열 인산화 단백질과 반응하지 않았으므로 항체의 특이성을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 제작된 항체를 이용하여 OsPK1 특이적인 단백질의 기능을 억제하거나 또는 상호작용 단백질을 분리하는데 이용 가능성이 높다는 사실을 보여준다.

실시예 7: OsPK1에 의한 AtCBL3 단백질의 인산화여부 확인

(1) 아기장대 칼슘센서(AtCBL3) 재조합 단백질 생산

아기장대 total RNA를 재료로 데이터베이스에 등록된 AtCBL3 유전자(AAC26010)의 전체 ORF를 RT-PCR(TAKARA) 방법으로 증폭하고(도 8의 (A)) pGEM-T vector(PROMEGA)에 클로닝 후 전 염기서열을 결정하여 AtCBL3 유전자와 100 % 일치하는 것을 확인하였다. 이때 사용한 PCR primer는 양 끝에 EcoR I (5'-말단) 및 Xho I (3'-말단) 제한효소자리를 첨가하였으며, 염기서열은 다음과 같다:

5'-GTCGACCATGTCGCAGTGCATAGACGGT-3' (sense) 서열 5

5'-GAATTCTCAGGTATCTTCCACCTGCGAGTG-3' (antisense) 서열 6

클로닝한 플라스미드를 EcoR I과 Xho I으로 절단하여 얻은 AtCBL3 유전자를 pGEX 4T-1(Amersham) 벡터의 EcoR I/Xho I 위치에 삽입하였고(도 8의 (B)), 이 DNA가 GST 단백질의 C-말단에 in frame으로 연결된 것을 염기서열분석을 통해 확인하였다. 완성된 재조합 단백질 벡터를 전기 실시예 5와 동일하게 BL21(DE3) plysS(Novagen)에 도입하고, GST-AtCBL3 재조합 단백질을 생산하였다(도 8의 (C)). 도에서 C는 E.coli cell total protein으로 lysis하기 전의 세포 단백질, E1은 컬럼을 glutathione으로 용출한 단백질 분획(컬럼에 결합되어 있던 GST-AtCBL3 단백질이 용출됨), 다른 기호는 전기 도 7A와 동일하다.

(2) OsPK1에 의한 AtCBL3 단백질의 인산화

전기 실시예 5와 위 (1)에서 생산한 GST-OsPK1과 GST-AtCBL3 재조합 단백질을 kinase 활성 측정 반응액(10 uCi r-32-P-ATP, 20 mM Tris-HCl pH7.5, 5 mM MnCl2)에 넣고 30℃에서 30분간 배양하였다. 실시예 6과 동일한 방법으로 단백질에 포함된 방사능을 확인한 결과 AtCBL3 단백질이 OsPK1 kinase에 의해 인산화되는 것을 확인하였다(도 9).

신호전달 분자에 있어서 단백질 인산화는 그 활성을 조절하는 중요한 기작으로 알려져 있다. 따라서 상기 결과는 OsPK1 또는 OsPK1의 결실돌연변이를 이용하여, 칼슘센서 단백질 calcineurin의 활성을 조절하거나 CBL/CIPK 신호전달 방향을 조절하는데 유용하게 이용할 수 있다.

전술한 실시예에서 상세히 기술한 바와 같이, 본 발명자들은 스트레스 처리한 벼로부터 저온 및 염 유도성 신규 칼슘신호전달 인산화 효소 유전자 OsPK1을 찾아내고 상기 유전자가 벼 유전체상에 단일 유전자로 존재한다는 것을 보였다. 또한 상기유전자가 암호화하는 단백질의 C 말단 부위에 의해 인산화 효소 활성이 조절된다는 사실을 규명하였으며, 특히 상기 인산화 효소가 아기장대 칼슘센서 단백질 AtCBL3를 인산화시키는 고유 활성이 있음을 증명하였다. 즉 상기 유전자의 발현이 저온 및 염처리에 의해 강하게 유도되며 식물의 스트레스 반응과 관련된 것으로 알려진 칼슘신호전달 분자 calcineurin을 인산화시킨다는 사실은 상기 유전자가 벼의 스트레스 반응에 중요한 역할을 할 가능성이 매우 높다는 사실을 강하게 시사한다.

따라서 본 발명에서 제공한 상기 OsPK1 유전자 또는 상기 인산화 효소의 활성 조절 및 상기 인산화 효소에 의한 CBL 활성 조절 기능을 이용하여 작물의 스트레스 저항성을 증진시킬 수 있다.

본 발명에 의한 OsPK1 유전자는 벼에서 저온, 염 등 환경스트레스에 의해 강하게 유전자 발현이 유도되는 특징을 가질 뿐만 아니라, 상기 유전자가 암호화하는 효소는 스트레스 저항성을 유도하는 것으로 알려진 아기장대의 칼슘센서를 인산화시키는 고유 활성을 가지므로 다양한 작물의 환경저항성 조절에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 저온 및 스트레스 호르몬인 ABA를 처리한 벼에서 cDNA 은행을 제작하여 reverse Northern에 의한 OsPK1 유전자를 선발하는 과정을 보여주는 흐름도.

도 2A는 OsPK1 단백질의 구조적 특징을 보여주는 모식도.

도 2B는 OsPK1 유전자의 완전 염기서열 및 아미노산 서열.

도 3A는 OsPK1의 조직별 발현양상을 보여주는 Northen blot 결과 사진.

도 3B는 벼 유묘를 저온, 칼슘이온 및 NaCl 처리시 유도되는 OsPK1 유전자의 발현양상을 보여주는 Northen blot 결과 사진.

도 4A는 OsPK1 유전자가 유전체상에서 single copy로 존재한다는 것을 보여주는 genomic Southern blot 분석 결과 사진.

도 4B는 벼 연관군지도상에서 OsPK1 유전자의 위치를 나타내는 모식도.

도 5는 OsPK1 재조합 단백질 생산용 발현벡터의 개략도(A)와, 분리한 OsPK1 재조합 단백질의 SDS-PAGE 결과 사진(B).

도 6A는 재조합 단백질 GST-fused OsPK1 전체 ORF(OsPK1F) 및 C말단 결실된 것(OsPK1N)의 인산화 활성을 보여주는 SDS-PAGE 결과 사진.

도 6B는 C-말단이 결실된 OsPK1N의 인산화 활성의 특성을 보여주는 도표.

도 7A는 GST-OsPK1 재조합 단백질에서 GST moiety가 절단?제거된 OsPK1 단백질 분획을 확인해 주는 SDS-PAGE 결과 사진.

도 7B는 GST를 제거한 OsPK1 재조합 단백질에 대한 항체의 반응 특이성을 보여주는 항원항체반응 결과 사진.

도 8은 RT-PCR로 증폭된 AtCBL3 유전자의 전기영동 사진(A), GST-AtCBL3 재조합 단백질 생산용 발현벡터의 개략도(B)와, 분리한 AtCBL3 재조합 단백질의 SDS-PAGE 결과 사진(C).

도 9는 in vitro에서 OsPK1 단백질에 의한 AtCBL3의 인산화 활성을 보여주는 SDS-PAGE 결과 사진.

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> A novel protein kinase gene which may be involved in calcium signaling in stress responses of rice and its encoded protein <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 449 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 1 Met Tyr Arg Ala Lys Arg Ala Ala Leu Ser Pro Lys Val Lys Arg Arg 1 5 10 15 Val Gly Lys Tyr Glu Leu Gly Arg Thr Ile Gly Glu Gly Thr Phe Ala 20 25 30 Lys Val Arg Phe Ala Lys Asn Thr Glu Asn Asp Glu Pro Val Ala Ile 35 40 45 Lys Ile Leu Asp Lys Glu Lys Val Gln Lys His Arg Leu Val Glu Gln 50 55 60 Ile Arg Arg Glu Ile Cys Thr Met Lys Leu Val Lys His Pro Asn Val 65 70 75 80 Val Arg Leu Phe Glu Val Met Gly Ser Lys Ala Arg Ile Phe Ile Val 85 90 95 Leu Glu Tyr Val Thr Gly Gly Glu Leu Phe Glu Ile Ile Ala Thr Asn 100 105 110 Gly Arg Leu Lys Glu Glu Glu Ala Arg Lys Tyr Phe Gln Gln Leu Ile 115 120 125 Asn Ala Val Asp Tyr Cys His Ser Arg Gly Val Tyr His Arg Asp Leu 130 135 140 Lys Leu Glu Asn Leu Leu Leu Asp Ala Ser Gly Asn Leu Lys Val Ser 145 150 155 160 Asp Phe Gly Leu Ser Ala Leu Thr Glu Gln Val Lys Ala Asp Gly Leu 165 170 175 Leu His Thr Thr Cys Gly Thr Pro Asn Tyr Val Ala Pro Glu Val Ile 180 185 190 Glu Asp Arg Gly Tyr Asp Gly Ala Ala Ala Asp Ile Trp Ser Cys Gly 195 200 205 Val Ile Leu Tyr Val Leu Leu Ala Gly Phe Leu Pro Phe Glu Asp Asp 210 215 220 Asn Ile Ile Ala Leu Tyr Lys Lys Ile Ser Glu Ala Gln Phe Thr Cys 225 230 235 240 Pro Ser Trp Phe Ser Thr Gly Ala Lys Lys Leu Ile Thr Arg Ile Leu 245 250 255 Asp Pro Asn Pro Thr Thr Arg Ile Thr Ile Ser Gln Ile Leu Glu Asp 260 265 270 Pro Trp Phe Lys Lys Gly Tyr Lys Pro Pro Val Phe Asp Glu Lys Tyr 275 280 285 Glu Thr Ser Phe Asp Asp Val Asp Ala Ala Phe Gly Asp Ser Glu Asp 290 295 300 Arg His Val Lys Glu Glu Thr Glu Asp Gln Pro Thr Ser Met Asn Ala 305 310 315 320 Phe Glu Leu Ile Ser Leu Asn Gln Ala Leu Asn Leu Asp Asn Leu Phe 325 330 335 Glu Ala Lys Lys Glu Tyr Lys Arg Glu Thr Arg Phe Thr Ser Gln Cys 340 345 350 Pro Pro Lys Glu Ile Ile Thr Lys Ile Glu Glu Ala Ala Lys Pro Leu 355 360 365 Gly Phe Asp Ile Gln Lys Lys Asn Tyr Lys Met Arg Met Glu Asn Leu 370 375 380 Lys Ala Gly Arg Lys Gly Asn Leu Asn Val Ala Thr Glu Val Phe Gln 385 390 395 400 Val Ala Pro Ser Leu His Val Val Glu Leu Lys Lys Ala Lys Gly Asp 405 410 415 Thr Leu Glu Phe Gln Lys Phe Tyr Arg Thr Leu Ser Thr Gln Leu Lys 420 425 430 Asp Val Val Trp Lys Cys Asp Gly Glu Val Glu Gly Asn Gly Ala Ala 435 440 445 Ala <210> 2 <211> 1594 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 2 cgaggtttcc tcctgttctt gagagaactg aatctgctgt ccagctgctg ctccggctgg 60 tctctgagtt gaaggtactt gaataacttg aaggttccta ggaaccttca tttgttggaa 120 gatgtatagg gctaagaggg ctgcattatc tccaaaggtg aagcgccgtg tagggaagta 180 tgagctcggg cgcaccattg gagaaggaac ctttgcaaag gtccggtttg cgaagaacac 240 tgaaaatgac gaaccagttg ctatcaaaat ccttgacaag gagaaggttc agaagcacag 300 attggttgaa cagattaggc gtgaaatttg tactatgaag ttagtaaagc atcctaatgt 360 tgttcggctg ttcgaggtca tgggaagtaa agcaagaatt ttcattgttc tggaatatgt 420 tactggagga gagctctttg aaatcattgc aactaatgga aggttgaagg aggaggaagc 480 acgaaaatac tttcaacaac ttatcaatgc agttgactac tgccacagta ggggtgtgta 540 ccacagagac ttgaagttag aaaatttgct gcttgatgct tctggaaacc tgaaagtatc 600 tgactttggt ttgagtgctt taaccgagca agtgaaggct gacggtttgc tgcacacgac 660 atgtggaact cctaattatg tcgctccaga ggtgattgag gacagaggct atgatggggc 720 agctgcagat atctggtctt gtggggtaat cctttatgtt ctgcttgctg ggtttttacc 780 atttgaggat gacaacatca ttgctcttta taaaaagatc tctgaagctc agtttacctg 840 tccctcttgg ttttctactg gagctaagaa gctgatcacc agaattctgg atcccaaccc 900 tacaactagg atcaccattt ctcaaatact ggaagatcct tggttcaaaa agggttacaa 960 accgcctgta tttgacgaga aatatgaaac tagttttgac gatgtcgatg ctgcttttgg 1020 agactccgaa gaccggcatg tcaaagaaga aactgaagat cagcctacct ctatgaacgc 1080 gtttgaactc atttcactga atcaggcact gaatctggac aatttgttcg aggcaaaaaa 1140 ggagtataaa agagagacaa gattcacatc acaatgtcct ccaaaagaaa ttatcaccaa 1200 gattgaagaa gctgcaaagc cacttggatt tgatattcaa aagaaaaatt acaagatgcg 1260 catggagaac ctgaaagcag gtagaaaagg caatctcaat gttgcaactg aggttttcca 1320 agtagctcca tccttacatg tggttgagct caagaaggca aagggggaca ctctggagtt 1380 ccaaaagttc tacagaaccc tgtcgaccca gctcaaggac gtggtctgga agtgcgacgg 1440 cgaggtcgaa ggcaacggcg ccgcggcgtg aacgtggttt ttgccatggc tttcggggca 1500 ccggttcttc gtgtacatag ctgctctgcc atcatcaatg gggtgttcgc cgtagagtag 1560 ctttttgtaa caagagaaaa aaaaaaaaaa aaaa 1594 <210> 3 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for cloning the OsPK1 gene <400> 3 ttcccgggca atgtataggg ctaagaggga tga 33 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for cloning the OsPK1 gene <400> 4 atcccgggtc acgccgcggc gccgttt 27 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for cloning the OsPK1 gene <400> 5 gtcgaccatg tcgcagtgca tagacggt 28 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for cloning the OsPK1 gene <400> 6 gaattctcag gtatcttcca cctgcgagtg 30

Claims

서열 1의 아미노산 서열과 85% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열로 이루어진 칼슘신호전달 인산화 효소활성이 있는 단백질.
제 1 항에 있어서,

서열 1의 아미노산 서열로 이루어진 칼슘신호전달 인산화 효소활성이 있는 단백질.
서열 1의 아미노산 서열과 85% 이상의 상동성을 가지고, 칼슘신호전달 인산화 효소활성이 있는 단백질을 코딩하는 유전자.
제 3 항에 있어서,

서열 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코딩하는 유전자.
제 4 항에 있어서,

서열 2의 염기 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 유전자.
제 4 항에 의한 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
제 6 항에 있어서,

상기 벡터는 pSK-OsPK1(기탁번호 KACC 95027)인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제 6 항에 의한 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포.
제 8 항에 있어서,

pSK-OsPK1(기탁번호 KACC 95027)로 형질전환된 숙주세포 E.coli DH5 alpha
제 1 항에 의한 단백질의 262번 아미노산 이후 C-말단의 전부 또는 일부가 결실되어 있고, 제 1 항에 의한 단백질에 비해 낮은 자가 인산화 활성과 높은 기질(MBP) 인산화 활성을 가지는 단백질.
제 1 항에 의한 단백질의 효소활성을 이용한 식물체의 환경 스트레스 저항성 조절방법.
제 1 항에 의한 단백질의 효소활성을 이용한 AtCBL3의 인산화 방법.
제 1 항에 의한 단백질에 특이적으로 반응하는 항체.
제 13 항에 의한 항체를 이용한, 제 1 항에 의한 단백질 또는 그와 유사한 단백질의 검출 및 분리방법.
제 13 항에 의한 항체를 이용한, 제 1 항에 의한 단백질의 효소활성 조절방법.
제 13 항에 의한 항체를 이용한, 제 1 항에 의한 단백질의 표적 단백질의 활성 조절방법.