CN1970794A - 筛选环境胁迫诱导型启动子的方法及该方法获得的启动子 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种筛选环境胁迫诱导型启动子的方法及该方法获得的启动子。本发明所提供的筛选环境胁迫诱导型启动子的方法，是将环境胁迫处理前后的目的植物的总RNA反转录为cDNA，再将所述cDNA作为探针与所述目的植物基因表达微阵列进行杂交；将与环境胁迫处理前相比杂交信号增加2倍或2倍以上的cDNA探针所结合的所述目的植物基因表达微阵列上的核苷酸序列，与所述目的植物的基因组DNA进行分析，得到环境胁迫诱导型启动子。利用该方法成功地从水稻中克隆了包括DL2、DFL4、DF15、DF2和DL5在内的诱导型启动子96个。
Description
技术领域
本发明涉及一种筛选环境胁迫诱导型启动子的方法及该方法获得的启动子。
背景技术
干旱和盐渍土是当今世界上严重影响农作物生产的两个主要因素。为了提高受影响区域的农业生产力，不管是传统育种还是农作物基因工程都在设法提高作物的耐旱性和抗高盐性。了解植物逆境压力在基因水平上的反应可为将来的育种和基因工程提供必要的基础。
最近在对拟南芥干旱和高盐压力反应的研究暗示了很大比例的基因牵涉到对干旱或高盐压力的反应。在一些案例中，显示出单个基因表达水平的改变会在很大程度上影响植物对干旱和高盐压力的反应。对受干旱和高盐条件控制的基因的鉴定有极大的意义；另外，它还有助于对逆境诱导启动子和组织特异性启动子的鉴定，对农作物基因工程的运用都起着重要的作用。
DNA微阵列提供了对基因表达分析进行大批量处理的手段，已经被运用于几种植物种类对干旱和高盐压力的反应的基因表达的图形进行研究。最初，利用一个摘自拟南芥的含有1300个全长型cDNA克隆的微列阵对干旱压力和冷压力的基因表达进行研究。这个研究分别鉴定出44和19个cDNA克隆，它们都是干旱和冷可诱导基因。其他研究采用一个拟南芥的含有大约7000个全长型cDNA克隆的微列阵去描绘对于abscisic acid(ABA)处理，还有冷、干旱、高盐压力反应的基因表达。还有的研究采用了一个含有大约8100个拟南芥基因的Affymetrix GeneChip来临控基因表达在盐、渗透和冷压力下的变化；这个研究揭示了根基因表达的变化和叶基因表达的变化有很显著的不同，仅有微小的重叠。类似的研究，还有利用一个含有1463个DNA元件的微列阵来评估大麦对干旱、高盐反应的基因表达。
发明内容
本发明的目的是提供一种筛选环境胁迫诱导型启动子的方法及该方法获得的启动子。
本发明所提供的筛选环境胁迫诱导型启动子的方法，是将环境胁迫处理前后的目的植物的总RNA反转录为cDNA，再将所述cDNA作为探针与所述目的植物基因表达微阵列进行杂交；将与环境胁迫处理前相比杂交信号增加2倍或2倍以上的cDNA探针所结合的所述目的植物基因表达微阵列上的核苷酸序列，与所述目的植物的基因组DNA进行分析，得到环境胁迫诱导型启动子。
所述目的植物基因表达微阵列(芯片)可从商业途径获得，如安捷伦(Agilent)科技有限公司公司、Affymetrix出售包括水稻、拟南芥等在内的多种植物的基因表达微阵列；所述目的植物基因表达微阵列也可按照常规方法构建，如文献《DNA芯片实验操作指南》(韩金祥，等编译.山东大学出版社，2001)等。
其中，所述环境胁迫包括干旱胁迫、盐胁迫和冷胁迫等由环境因素引起的水分胁迫。
所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物，如农作物水稻、小麦、玉米、烟草、矮牵牛、茄子、番茄、曼陀罗、西瓜、甜瓜、黄瓜、黄豆、绿豆、豌豆、豇豆和紫藤等。
所述目的植物的总RNA可来源于胁迫处理前或胁迫处理后植物材料的RNA。
所述目的植物的总RNA可为相同或不同组织和/或器官的总RNA。
所述方法中还可包括将得到的环境胁迫诱导型启动子转化到植物中进行报告基因表达鉴定的步骤。
本发明所提供的利用上述方法筛选到的启动子，其核苷酸序列是如下1)、2)、3)、4)或5)：
1)序列表中的序列1或在严格条件下与所述序列表中的序列1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；
2)序列表中的序列2或在严格条件下与所述序列表中的序列2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；
3)序列表中的序列3或在严格条件下与所述序列表中的序列3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；
4)序列表中的序列4或在严格条件下与所述序列表中的序列4限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；
5)序列表中的序列5或在严格条件下与所述序列表中的序列5限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
所述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜。
序列表中的序列1由1301个脱氧核苷酸组成，该启动子的名称为DF2。序列表中的序列2由1301个脱氧核苷酸组成，该启动子的名称为DF15。序列表中的序列3由1244个脱氧核苷酸组成，该启动子的名称为DFL4。序列表中的序列4由1304个脱氧核苷酸组成，该启动子的名称为DL2。序列表中的序列5由1300个脱氧核苷酸组成，该启动子的名称为DL5。
本发明筛选环境胁迫诱导型启动子的方法流程如图1A所示，该方法首先采用微阵列法(Microarray)取得在指定压力条件下的特定组织的基因表达概貌，选取候选启动子，然后对候选启动子进行植物转化和基因表达鉴定。传统的分离环境胁迫诱导性启动子的方法流程如图1B所示。本发明的方法与传统方法相比具有以下优点：1、结合了微阵列法进行启动子的分离：首次将微阵列法用于启动子的分离。人们一般只用微阵列法研究基因的表达情况，研究环境胁迫引起基因表达的差异性，研究基因表达的组织特异性，未有人将微阵列法用于环境胁迫诱导性启动子的分离。2、启动子分离的高通量性：本发明方法一次可以分离上百个受环境胁迫诱导的启动子。由于微阵列法研究基因表达的高效性，一次可以对上万个基因表达情况进行研究，从中发现数百甚至上千个受环境胁迫诱导的基因，因此可以一次分离几十个或上百个候选的环境胁迫诱导的启动子。3、启动子分离的高效性：由于微阵列法的仪器化程度很高，所以杂交用时很短也很方便，所以用新方法分离启动子很方便快捷。3、与组织特异性启动子分离相结合：由于微阵列法不仅提供了基因表达的诱导性情况，同时也提供了基因表达组织特异性信息，所以用本发明方法分离的启动子不仅是环境胁迫(如干旱或高盐)诱导的，而且还可以知道启动子的组织特异性。
利用本发明的方法筛选到的干旱诱导启动子DL2、DFL4、DF15、DF2和DL5，其中DL2在普通叶具有明显的诱导现象；DFL4和DF2在普通叶具有明显的诱导现象；DF15和DL5在普通和旗叶中都有明显的诱导现象。
本发明以水稻为实例证实了本发明筛选环境胁迫诱导型启动子的方法的可行性、高通量和实用性。利用本发明筛选环境胁迫诱导型启动子的方法成功地从水稻中克隆了包括DL2、DFL4、DF15、DF2和DL5在内的诱导型启动子96个。
附图说明
图1A为本发明筛选组织特异性启动子的方法流程图；
图1B为传统的分离干旱和高盐诱导性启动子的方法流程图；
图2为干旱处理植株D1、D2和D3期的照片；
图3为籼稻品种明恢63的旗叶、普通叶和小穗的cDNA探针与微阵列的杂交情况；
图4为重组载体pCAMBIA1303/inducible promoter T-DNA区的图谱；
图5为干旱诱导启动子的RT-PCR电泳图谱；
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
本发明的筛选组织特异性启动子的方法，可用于筛选各种启动子，下面以水稻为例阐明新的高通量分离干旱诱导性启动子的方法：
实施例1、从水稻中筛选干旱诱导组织特异性启动子
本实施例中采用了一个覆盖36，926单一基因或基因模型的70mer寡聚体水稻基因表达微阵列，来测试水稻叶在干旱压力环境下基因表达的变化。该水稻基因表达微阵列按照文献：《Conservation and divergence of light-regulated genomeexpression patterns during seedling development in rice and Arabidopsis》(Jiao，Y.，Ma，L.，Strickland，E.，and Deng，X.W.(2005)，Plant Cell 17，3239-3256)和《A microarray analysis of the rice transcriptome and its comparison toArabidopsis》(Ma，L.G.，et al.(2005)，Genome Res.15，1274-1283)中描述的方法制备。基于对这些基因概貌的分析，已经克隆了96个候选启动子，已经对其中的5个进行了验证。
1、候选干旱诱导组织特异性启动子的筛选
(1)植物材料和压力处理
用于和上述水稻基因表达微阵列杂交的植物材料为籼稻品种明恢63(OryzaSativa L.ssp.indica cv.Minghui 63，购自中国水稻所)。芽样品取自4分蘖阶段(营养期)旗叶和普通叶(除旗叶以外的其它叶片)，圆锥花序样品取自抽穗前的一个星期(生殖期)。用于取芽样品的植物生长在半浓度的霍格兰溶液中至四叶期，然后生长在土壤中直到生殖期。
干旱处理的材料和样品在以下阶段收集：期1(D1)：叶轻微卷，相对含水量(RWC)在90％-95％；期2(D2)：叶半卷，相对含水量(RWC)在80％-85％；期3(D3)：叶完全卷，相对含水量在70％-75％(图2)。图2中，D1、D2和D3代表干旱处理的三个阶段。复水后的样品取自第一批经干旱处理叶完全卷曲的植株(D3)给水48小时后。对每个处理阶段，取样三份。采样完毕，样品立即用液氮冷冻保存于-80℃。
(2)微阵列杂交和数据分析
按照文献：《A microarray analysis of the rice transcriptome and itscomparison to Arabidopsis》(Ma，L.G.，et al.(2005)，Genome Res.15，1274-1283)中描述的方法配制和使用RNAwiz试剂提取经过步骤(1)处理的样品的总RNA。每份总RNA的提取物经反转录得到的cDNA第一条链经Cy3或Cy5荧光标记后作为探针。其中，第一链cDNA的合成及其荧光标记按照文献：《Conservation anddivergence of light-regulated genome expression patterns during seedlingdevelopment in rice and Arabidopsis》(Jiao，Y.，Ma，L.，Strickland，E.，andDeng，X.W.(2005)，Plant Cell 17，3239-3256)中描述的方法进行。所有的cDNA探针与上述水稻基因表达微阵列按照文献：《Conservation and divergence oflight-regulated genome expression patterns during seedling development inrice and Arabidopsis》(Jiao，Y.，Ma，L.，Strickland，E.，and Deng，X.W.(2005)，Plant Cell 17，3239-3256)中描述的方法进微阵列杂交、洗涤和扫描。其中，用Axon GenePix 4000B扫描仪对杂交微阵列玻片进行扫描，图像保存为TIFF格式的Cy3和Cy5两种，用于后续的分析。每个实验记录五组重复的高质量数据，每组数据来自独立的样品。
数据质量控制以及标准化方法按照文献：《Conservation and divergence oflight-regulated genome expression patterns during seedling development inrice and Arabidopsis》(Jiao，Y.，Ma，L.，Strickland，E.，and Deng，X.W.(2005)，Plant Cell 17，3239-3256)和《A microarray analysis of the rice transcriptomeand its comparison to Arabidopsis》(Ma，L.G.，et al.(2005)，Genome Res.15，1274-1283)中描述的方法进行。检测干旱和高盐压力下的差异表达的基因采用LimmaR软件包按照文献Smyth，G.K.(2005)Limma：Linear models for microarray data.In Bioinformatics and Computational Biology Solutions using R andBioconductor，R.Gentleman，V.Carey，S.Dudoit，R.Irizarry，W.Huber，eds(New York：Springer)，pp.397-420中描述的方法进行，即通过表达的数据构建线性模型而实施空假设检验。在干旱或高盐处理过的样品和对照样品(未经干旱和高盐处理)的配对比较中，中度的t-值统计方法采用经验的Bayes方法计算，收缩基因的样品变量指向一个共同的值(myth，G.K.(2005)Limma：Linear models formicroarray data.In Bioinformatics and Computational Biology Solutions usingR and Bioconductor，R.Gentleman，V.Carey，S.Dudoit，R.Irizarry，W.Huber，eds(New York：Springer)，pp.397-420)，并且记录计算不同水平的转化强度比。用Benjamini和Hochberg方法(Benjamini，Y.，and Hochberg，Y.(2000).Theadaptive control of the false discovery rate in multiple hypotheses testing.J.Behav.Educ.Statist.25，60-83；Reiner，A.，Yekutieli，D，and Benjiamini，Y.(2003)Identifying differentially expressed genes using false discoveryrate controlling procedures.Bioinformatics 19，368-375)的P值调节用于控制多重实验的错误率。若P值小于0.05，则说明基因有明显的不同，进一步采用三倍严格的标准以避免假阳性的出现。未经干旱和高盐处理、经干旱或高盐处理的籼稻品种明恢63(Oryza Sativa L.ssp.indica cv.Minghui 63，购自中国水稻所)的旗叶、普通叶和小穗的cDNA探针与微阵列的杂交结果如图3所示，表明经过经干旱或高盐处理的旗叶、普通叶和小穗中表达的基因总数要比未经干旱和高盐处理的多。图3的纵坐标为有杂交信号的基因表达微阵列上的核苷酸序列数，干旱诱导(drought induced)表示基因表达微阵列上与来源于干旱处理植株的cDNA探针有杂交信号的的核苷酸序列数，盐诱导(salt induced)表示基因表达微阵列上与来源于高盐处理植株的cDNA探针有杂交信号的的核苷酸序列数，Common表示基因表达微阵列上与来源于未经干旱和高盐处理的cDNA探针有杂交信号的核苷酸序列数。从基因表达微阵列上与处理前相比杂交信号增加2倍或2倍以上的cDNA探针所结合的基因表达微阵列上，在旗叶、幼苗和花序中，分别有582、1257和614个干旱正调节基因，从这些核苷酸序列中，选择如表1所示的5个核苷酸序列(基因)与水稻基因组DNA进行比较分析，从表1的工作ID分别为DF2、DF15、DFL4、DL2和DL5的5个基因翻译起始位点前1.0-2Kb中选择候选启动子，其名称分别为DF2、DF15、DFL4、DL2和DL5。DF2的核苷酸序列是序列表中的序列1，由1301个脱氧核苷酸组成。DF15的核苷酸序列是序列表中的序列2，由1301个脱氧核苷酸组成。DFL4的核苷酸序列是序列表中的序列3，由1244个脱氧核苷酸组成。DL2的核苷酸序列是序列表中的序列4，由1304个脱氧核苷酸组成。DL5的核苷酸序列是序列表中的序列5，由1300个脱氧核苷酸组成。
其中，基因表达微阵列上5个受干旱诱导的基因数据分析结果如表1所示。表1中的比值为该基因干旱诱导后的杂交信号值与干旱诱导前的杂交信号值的比值，D1、D2和D3比值表明基因表达在D1、D2和D3期三个时间点比干旱诱导前增加的倍数。
表1 5个受干旱诱导的基因表达微阵列数据分析结果
| 工作ID | D1的比值 | D2的比值 | D3的比值 | TIGR登记号 | cDNA注释 |
| DF2 | 4.303852503 | 5.204527793 | 5.524397951 | 11668.m03107 | germin-like protein |
| DF15 | 2.477700694 | 2.248201439 | 3.523608175 | 11673.m04317 | expressed protein |
| DFL4 | 2.983293556 | 2.772387025 | 5.672149745 | 11682.m02925 | hypothetical protein |
| DL2 | 6.101281269 | 0.116821065 | 0.705517144 | 11670.m02696 | expressed protein |
| DL5 | 5.267563796 | 5.847115027 | 5.328429757 | 11673.m04210 | Protein Kinase domain |
3、干旱诱导组织特异性启动子的鉴定
(1)候选干旱和高盐诱导启动子的选择和引物设计
根据微阵列和原始数据的分析的结果，选择了5个可能的干旱诱导启动子进行分离(表1)。启动子的选择为基因翻译起始位点前1.0-2Kb，用计算机辅助设计引物进行启动子的分离(表2)。
表2 可能的受干旱诱导的启动子引物设计
| 工作ID | 启动子5‘端引物 | 启动子3‘端引物 | 启动子长度(单位：bp) |
| DL2 | GAGGGGTCTCAAGCTTCAGTACGTCGCCTATCACCAT | CCTCGGTCTCCCATGGGCTACTCGATCACTCCATTCG | 1304 |
| DFL4 | GAGGGGTCTCAAGCTTAAGCAAGTCCGAAGACCATTA | CCTCGGTCTCCCATGGAGCAGAAGGCTGACAAAGTGA | 1244 |
| DF15 | GAGGGGTCTCAAGCTT GGAGATCAAACAGGAAACAA | CCTCGGTCTCCCATGGACCCACTTGTCAGTGACTGCT | 1301 |
| DF2 | GAGGGGTCTCAAGCTTGATGCAGGAGTGCGATTAAGT | CCTCGGTCTCCCATGGCGGAAGTGCAGAGATGGTTAG | 1301 |
| DL5 | GAGGGGTCTCAAGCTTTGGACAGCAGGCTACAGATTT | CCTCGGTCTCCCATGGAGGCAAGGTGGAACTGAAAAC | 1300 |
(2)侯选启动子的扩增和pCAMBIA1303/inducible promoter载体的构建
利用天为时代生物公司植物基因组提取试剂盒提取日本晴的基因组DNA。
PCR所用试剂为TaKaRa公司的EXTaq试剂盒；PCR的模板为日本晴的基因组DNA。PCR引物如表2。PCR程序为：先94℃5分钟进行预变性；然后进行如下35个循环：94℃40秒进行变性，55℃1分钟进行退火，72℃2分钟进行延伸；最后72℃10分钟。然后在1.2％的琼脂糖凝胶中电泳检测。PCR产物回收后，用BsaI酶切后回收启动子片段，pCAMBIA1303(购自CAMBIA实验室，见www.cambia.com)用HindIII和NcoI酶切后回收载体片段，然后与BsaI酶切片段连接转化，阳性克隆送至擎科生物有限公司进行测序，测序引物为：R：5’ATCCAGACTGAATGCCCACA3’和F：5’GCACCCCAGGCTTTACACTT3’，将含有核苷酸序列分别是序列1、2、3、4和5的启动子的重组载体pCAMBIA1303/inducible promoter分别命名为pCAMBIA1303-DF2、pCAMBIA1303-DF15、pCAMBIA1303-DFL4、pCAMBIA1303-DL2和pCAMBIA1303-DL5。上述内切酶购自TaKaRa公司，连接酶和转化所用感受态大肠杆菌DH5α购自天为时代生物公司，方法均按照试剂盒中所述。
重组载体pCAMBIA1303/inducible promoter的T-DNA区图谱如图4所示，LB和RB分别为T-DNA的左臂和右臂；hpt：潮霉素抗性基因；CaMV35S：花椰菜花叶病毒启动子；inducible promoter：通过微列阵数据分析出的候选干旱诱导启动子；GUS-GFP：gus和GFP融合蛋白基因；HindIII和NcoI：内切酶HindIII和NcoI的酶切位点。
按照文献：《Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediatedby Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DAN.》(Hiei Y，Ohta S，Komari T et al.Plant J 1994，6：271-282.)中描述的方法将pCAMBIA1303-DF2、pCAMBIA1303-DF15、pCAMBIA1303-DFL4、pCAMBIA1303-DL2和pCAMBIA1303-DL5分别通过根癌农杆菌菌株LBA4404的介导转化水稻愈伤组织、进行植株再生，得到转基因植株(T0代)。将T0代得到的种子经过50mg/L的潮霉素发苗筛选后种植到土壤中，培育至抽穗期。将正处抽穗期的植株，在不破坏根系的情况下进行失水处理至D2期：叶半卷，相对含水量(RWC)在80％-85％。转入pCAMBIA1303-DF2、pCAMBIA1303-DF15、pCAMBIA1303-DFL4、pCAMBIA1303-DL2或pCAMBIA1303-DL5的植株每个取4个独立株系，每个株系在失水前后各取6株，然后RT-PCR检测干旱处理前和失水处理至D2期植株的旗叶和普通叶中GUS-GFP基因的表达。
按照《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔等，第三版，黄培堂等译，科学出版社：518-522)中描述的方法提取干旱处理前和失水处理至D2期植株的旗叶和普通叶的RNA。利用上海申能博彩生物公司反转录试剂盒合成cDNA第一链作为模板，进行PCR扩增，从而检测GUS-GFP基因和actin基因在旗叶和普通叶中的表达：actin两条引物分别为：5-TCCGTGACATCAAGGAAAAG-3’和5’-GATATCAACATCGCACTTCATG-3’；GUS-GFP基因的两条引物分别为：5’AACTGCATCAGCCGATTATCATC 3’和5’GCATTGAACACCATAAGAGAAAGT 3’；PCR所用试剂为TaKaRa公司的EXTaq试剂盒；PCR程序为：先94℃ 5分钟进行预变性；然后进行如下29个循环：94℃40秒进行变性，55℃1分钟进行退火，72℃1分钟进行延伸；最后72℃10分钟。然后在1.2％的琼脂糖凝胶中电泳检测。RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳后，紫外凝胶成像仪扫描成像，然后利用LabWorksTM 4.0.08软件进行灰度分析，计算GUS-GFP基因的在诱导后和诱导在前普通叶和旗叶中的比值。
其中，4株转入每种启动子的干旱处理前和失水处理至D2期植株的旗叶和普通叶的RT-PCR电泳结果如图5所示，表明DF2、DF15、DFL4、DL2和DL5均可启动GUS-GFP基因表达。图4中KT00219，KT00228，KT00234，KT00236和KT00264分别为DL2、DFL4、DF15、DF2和DL5的编号。“D0”和“D2”分别为处理前和相对含水量为(relative water content，RWC)80％-85％；“L”水稻普通叶；“FL”水稻的旗叶；“1”、“2”、“3”和“4”：分别指独立来源的转基因水稻；“gus”为GUS-GFP基因的扩增产物；“actin”为水稻actin基因的扩增产物。
按照上述RT-PCR方法检测了20株未转基因的日本晴植株(空白对照)中的GUS-GFP基因表达情况，结果表明未转基因的日本晴植株均无GUS-GFP基因表达。
干旱诱导后与诱导前普通叶和旗叶中的GUS-GFP基因表达量比值结果如表3所示，表明DL2在普通叶具有明显的诱导现象；DFL4在普通叶具有明显的诱导现象；DF2、DF15和DL5在普通叶和旗叶中都有明显的诱导现象。
表3 GUS基因的在诱导后和诱导在前普通叶和旗叶中的比值
| 工作ID | 诱导后与诱导前基因表达的比值(RT-PCR分析) | ||||||||
| 1L | 1FL | 2L | 2FL | 3L | 3FL | 4L | 4FL | ||
| KT00219 | DL2 | 8.8±1.2 | 1.5±0.7 | 7.8±2.0 | 1.2±0.3 | 4.8±1.1 | 2.5±0.8 | 39.6±7.1 | / |
| KT00228 | DFL4 | 4.9±0.6 | 4.8±1.9 | 1.4±0.4 | 0.5±0.2 | 2.2±0.9 | 0.4±0.1 | 35.8±8.8 | / |
| KT00234 | DF15 | 5.3±1.3 | 57.0±10.1 | 3.7±0.6 | 0.1±0.1 | 174.6±11.1 | 22.3±2.3 | 7.8±1.3 | 15.4±2.0 |
| KT00236 | DF2 | 31.9±10.0 | 12.2±3.3 | 3.8±0.7 | 7.2±2.4 | / | 89.3±15.5 | 3.6±1.0 | 0.1±0.1 |
| KT00264 | DL5 | 2.2±1.4 | 2.9±0.8 | 4.5±1.0 | 7.3±1.1 | 16.1±7.4 | / | 0.7±0.2 | 5.9±1.2 |
表3中，“1L”、“2L”、“3L”和“4L”分别为独立来源的4个转基因水稻株系的普通叶；“1FL”、“2FL”、“3FL”和“4FL”分别为相应独立来源的4个转基因水稻株系的旗叶；“/”指诱导前后都没有表达。
序列表
<160>5
<210>1
<211>1301
<212>DNA
<213>稻属水稻(Oryza sativa var.Lansheng)
<400>1
gatgcaggag tgcgattaag ttgcgtcagc ggcaagggat tattatccct ttctatatcc 60
ggcggcggcg cgctcccggc cggttggagg cggccatgga cagcctgcta cgccacgaaa 120
gcatcattat atctgcccag atgattcata cacatatatg atctcaaaag gcgatcgatg 180
tgcgcacgta catacaggtc acaactggtc atgcctacga tagatatgcc gtgcaacatg 240
cgttgctcgg agcacttcaa ttaagataga gggaacaaat gttataagaa agattttcat 300
cggtagtcga ctgttgagaa aagatgtgca ttctatgtat aaacacaagc tactgaactg 360
aaagccgagt gccaaaccgg ttattggtat tattcatgat cattcccaga ttattctgtt 420
ttaaccagtc gtgggaacta ttggccaact atgctggatc ctatgactcc tccctggtcc 480
tgagtttctt ggaagcctta tctacaggtt caatgcacgc acgcacgatt gacgacgacc 540
tgaacgactc ttccggtcaa taatgccagc ccatgtggtc ctccgcagtc cgcactgtgc 600
aagtgtgcag cgtccacttg aaaatccaca gaagccacca ttcttcagag cctccctccc 660
tgcttcttca atacacttcc agaactaggg gcatgttcga tttagcctgg tgtagttgga 720
gaaaattttt aattttagtt atcatatcgg atatacagat atatatttgg agtattaaat 780
gtagtctaat aacaaaacaa attacagatt ccgtcagaaa actacaagac gaatttatta 840
agtctaatta atccatcatt agcaaatgtt tactgtagca ctatattgtc aaattatggc 900
ataattaggc ttaaacgatt cgtctcacaa tttacacgta atctgtgtaa ttggtttttt 960
ttcctacatt taatactcca tacatgtatt caaacattcg atatgacggc acgaaaattt 1020
ttgttttggg aactaaatag ggtcttagag gaaaagtaaa gaatttggat ttctcaggat 1080
taatttctat atgagttatt cgatttgtta aaataaagta tgagaaagcc aaaacaatat 1140
tttctttcct acaagttgca tagagaaaaa aaaatccact caaacctcta attttttttc 1200
tatagattga tatgtacata tatttctatc ccttcacttt tcctattctt ttccgcatga 1260
agaaaaaaaa gagaactttt ctaaccatct ctgcacttcc g 1301
<210>2
<211>1301
<212>DNA
<213>稻属水稻(Oryza sativa var.Lansheng)
<400>2
cggagatcaa acaggaaaca atctcaccat cacaaccgac ctagcaggcg attacagcga 60
tggaatcacg cttaccgcga gcgaatcgga tcaaaacgga ggggctcgag cggagggagg 120
gaatgcttct tcggttcgtc tcgtctcgtc gcatcgcgtt cgcctctgga gttttggatt 180
ctaccgctct agaagcttcc ggacgagccc cgaatcggca cgggagagcg cacacgcgtg 240
gcggcgcctg aaggcctttt atgatgggga cgcgtggcgt gttggccgtc ggatcgtgac 300
acgtgtccac gagatgacgc ggttggacgg tgcgagtggc gacgtcgttg tgtgggccgc 360
gaagtttgtc atcggctcgt gggcctagcc ttttctcggc cctgaaaggt aggaaaccga 420
ggcctttcca tccattttct tctctttttc ctgttctatt attgatgttg tattgggtga 480
ttttgaaacc cttttgaaag aaattttggg taatttttgt tcattgaatt cttgaatttg 540
atctcctcct aagtaagttg aataaatgga tttgtggatt gtgagaagct gacctaagac 600
aaaagatttt ttgcagtagt agtacattaa aaaagcaggc attgcattcc atccctcttc 660
aagggctaag gcttatctac ctaacatttt ttcttgtttc ctgcacacga tgataacatt 720
tcctttctgt tgatctgtca ttcgtgattt gagtagctat atgtaaatag gtttgatgtt 780
gtttgacaat atcaccagca tagctattct catgcttaca gttcatctaa ccagctttcc 840
tgatcagggt tcagaggtta tatccaaagt tttattcaga agaacgcaaa aggaacattc 900
aagattagca tccataatat ttatgagtag tacgactagt acattaaaca agctctagat 960
taggatcaac acaagtgatc aaagtgatgg ggatgagaaa gccctggaat ggtccgaacc 1020
caatgtgtgt aatccaccga ttggccttag ctgattgtga ctccgttcat gtttgatgtg 1080
ctagtaccaa ccacctgtgc cactatctgt cctccacatg tacactccat aggcgtatgg 1140
acgtatggaa caaaagataa gatacaaaga tgcatggaga agattatagt taaaactgaa 1200
agctgtacat cactatcatt tggtaattca gaattcagaa gtgaatatgg acatggaatc 1260
tgcagtacta cttgtgcggt agcagtcact gacaagtggg t 1301
<210>3
<211>1244
<212>DNA
<213>稻属水稻(Oryza sativa var.Lansheng)
<400>3
aagcaagtcc gaagaccatt actcctctta ctcctctcct ctgtttcata ttataaatcg 60
tttaaccttt ttcctagtta aagttcgcta tgtttgacta aatttataaa ataaattagt 120
aacatctata acaccaaatt agttttatta aattcaacat tgaatatatt ttgataatat 180
gtttgttttg tattgaaaga ttattatatt tttctacaaa tttggtaaaa cttaaagatg 240
tttgattaag aacataaatc aaacgactta taatacgaaa cggacgaagt agctagctag 300
caggctatat attgatctac tagctacctc tgttttttta gtaatcgaca gtaaataata 360
ttgaataaac acacaaaatt taaccactaa tttttttcct tcagaattta taaaaacatg 420
tgattctgca ccactgcatt aaaataaaat tcaaaatgat tctaacagta tgtgctttag 480
tgtacaaaat agaataaatt agtgttcata aaagtttgga taggagaatc ctctgttttc 540
aaatagtcag tgatttataa ttaatgcaag tgttaatatt tgcattgtga aaaatatcat 600
tttgtttgtt gtagaaacaa tacaatgatg catgcaatat taaggacaat ttaaatgcag 660
gagtaaaatt tttattaaag acaaagttat atgaaggaaa ataaaatggt aggggatcaa 720
aaaccatttt tatgccatta tatttttaat aactttaagg aatacacagt attaaaaaat 780
aattatcaaa tgttattgtt tcccatgtta gatatgtcta gaacgactac taagatagta 840
ttaaatacag agatataaag gaagtctcca aactttttgt ttgaattaca aacccaaggg 900
ctaaagttta ttacctgcat gttaattgaa ggaaaaatat ctgcctcgta ctgcactgat 960
aacgtacagt ggattgagaa aatattaatt ttggattcat ctactagatt tactagctct 1020
tacaagagga ttttcagtaa taagttagca ctggtactta actagcgaat aacttcgcaa 1080
aattctgcta gtttaattta ttttcaaaca aggattctct ctccaacttg tcaacaaaat 1140
agcactatat agctgacgaa ctcttacgtt acaacattat agtcgcaggg tcatcttctt 1200
cttttcccct ttcgaaggca ttgtcacttt gtcagccttc tgct 1244
<210>4
<211>1304
<212>DNA
<213>稻属水稻(Oryza sativa var.Lansheng)
<400>4
cagtacgtcg cctatcacca taacgcatcc gacgcgagtg ctgcctgtcc cagctacttg 60
tgtcctagct gcctgtgtcc cagggtcccg gttacttgtg tcgtacccac ccacgctgcc 120
agcaaccaca tgtaggtgta gaaccaacta accaaaatgt gtttaattag ctatattcta 180
ttgaaaaact agggtagtgg ccggggcaaa aattttttag tcactccagt gatcaagatt 240
taaaatttaa attccttagg ttctgttgcc aatttttttt ggggaatgtt gccaaaaata 300
tttcttcaaa cggagagagt aatattatat atattgacgc tggatgatgc actgcttgtg 360
ttgctggtgt gcaagcttcc ctgccaagtg ccaaacggaa tcaaatcctc tcatgtgaac 420
ttccacttga cgtggtcact gacaggtggg cccgtgagcg gtggagcccg catgtcagtc 480
accacgttcc tctgacttca cgtcagagga ttctaatccg tgccaaactg ccaacttgtg 540
gtcggtgcct gcaagcatcc cgcgtgagtg ctgcctaccc tcgccaaagc ccgcgtcttc 600
aacacagccg cgtggatttt tttatttttt tagacttttt tatgctttat tattagacca 660
ttcaaaaaag tatttccgaa aactgaacct tttggccacg tctgcagtgg tgacgtgata 720
agaggctggc gtggcagggc aacgctacca caccagctac ccgtggtgtg atagagttat 780
ttggtcacca ggctggataa aaggttcata tttaaaattt tttttggaaa tcgtcaatta 840
ataaaattaa aacataaaaa agttactacc attctgcggt aaaaaagtta ctgcacttcc 900
ctgacaaaaa tatcaaatat ctacaattcg ttttttgacc ggtggagtgg cgcaaatgta 960
gatcactcct acaaattaaa taatctgaac ggataagata agaaatttta attttaactc 1020
gtgatgacag tttactcttt aaatgagagt aattaacttt ctactctaaa tttctgaatg 1080
ggatgcggag aacgggaagg aaaaccagag aataactttt tctttctttt ttgagaagaa 1140
cggcagtacg gtataggaaa gggaataata ataacaatat atgttttcgt gtagttatat 1200
ttaacgtcat ttataaacat atactagata ctagtaataa cggaatatat gtcaataata 1260
caagacgtga aaaccaaaaa tgacgaatgg agtgatcgag tagc 1304
<210>5
<211>1300
<212>DNA
<213>稻属水稻(Oryza sativa var.Lansheng)
<400>5
tggacagcag gctacagatt tatagccagc tgtagcacgg actttaagat gcatatgtat 60
atgacagatg agaccagata ttaattatgt agtatatgtt tatatgtaac tactgtatga 120
attgactatt aaattgacta tagatgattt ggagtccgca gttagcttta ctactaaact 180
tgctcttaat ggaatgttcc atcccaaagt tcatcattct gtttggttag cattagagca 240
ggtacaatag cagactatta accagctata aacatatttt aatgagataa aaagataaga 300
aaaaagagca gcgggctata aatctgcagc cggttgtagc acggactcta agatgcaatg 360
tgtgtataat agataggact atatactaat agtatagtaa acaattattg tataaattag 420
ctattagatt agctatagat gaattagagt tagtagtggg ctatactatt aaacttgctc 480
ttagcatgcg gttagagtga cagcaacatc ggttcatcga tcaagagtag attatgagtg 540
gattataagt tgtaatagct tactagtgaa aaatatttta cgagtaaaac ttttatatat 600
acacatccat aaatttttat aatttttaaa ataaatgcat taatgatacc taaaatccac 660
ttaaaattaa gttttaaaat ttaaactttg acgtcgatta atttgttata cgtcaatcaa 720
taagaccctt tagctattgc acctaccgta tttttcctgg atataaagta agatcctggg 780
atcaaagaaa gcttcgcaat cacatgttga gaaaaggagt gggctttcag aagcaggagc 840
agaaaatgat gtatgataga ctagttcggt actgcagtta ggtgcccata aagaagatct 900
tccggtgatt gcattgggaa tgttcggttg catttggagc tagtatttgg ctatagtatt 960
atactagtat tgaacttgct ttaacagatt tcttcagctt aataatttac tgtttgaatt 1020
tgttctacat tttgagcagc tttgatggtt tctttgtgta gttttttcaa gtataaacca 1080
actcgatcaa agttaggaac agtacagata gaaggcaaca atgtcatatc agaggagaga 1140
atcattcctg tgttacgtgg agtataaaca atctgcaata ctctggtcat tgctacatct 1200
gacaaaagtc gttgtgttac cacttaccac catgtcgttc aagcagagct ggagaatctt 1260
ttcctcaatt ttctgttcgg ttttcagttc caccttgcct 1300
Claims (9)
1、一种筛选环境胁迫诱导型启动子的方法，是将环境胁迫处理前后的目的植物的总RNA反转录为cDNA，再将所述cDNA作为探针与所述目的植物基因表达微阵列进行杂交；将与环境胁迫处理前相比杂交信号增加2倍或2倍以上的cDNA探针所结合的所述目的植物基因表达微阵列上的核苷酸序列，与所述目的植物的基因组DNA进行分析，得到环境胁迫诱导型启动子。
2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述环境胁迫包括干旱胁迫、盐胁迫和冷胁迫等由环境因素引起的水分胁迫。
3、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物。
4、根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述目的植物为水稻。
5、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述目的植物的总RNA为相同或不同组织和/或器官的总RNA。
6、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述目的植物的总RNA可来源于胁迫处理前或胁迫处理后植物材料的RNA。
7、根据权利要求1至6中任一权利要求所述的方法，其特征在于：所述方法中还包括将得到的环境胁迫诱导型启动子转化到植物中进行报告基因表达鉴定的步骤。
8、利用权利要求1至7中任一权利要求所述的方法筛选得到的启动子，其核苷酸序列是如下1)、2)、3)、4)或5)：
1)序列表中的序列1或在严格条件下与所述序列表中的序列1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；
2)序列表中的序列2或在严格条件下与所述序列表中的序列2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；
3)序列表中的序列3或在严格条件下与所述序列表中的序列3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；
4)序列表中的序列4或在严格条件下与所述序列表中的序列4限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；
5)序列表中的序列5或在严格条件下与所述序列表中的序列5限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
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