CN105734138A - 基于四环素调控系统检测叶绿体启动子活性的方法 - Google Patents
基于四环素调控系统检测叶绿体启动子活性的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105734138A CN105734138A CN201610182483.0A CN201610182483A CN105734138A CN 105734138 A CN105734138 A CN 105734138A CN 201610182483 A CN201610182483 A CN 201610182483A CN 105734138 A CN105734138 A CN 105734138A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- promoter
- tetracycline
- seqidno
- prrno1o2
- expression
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 title claims abstract description 44
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 title claims abstract description 44
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 title claims abstract description 44
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 title claims abstract description 44
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 title claims abstract description 44
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 title claims abstract description 16
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 title abstract description 6
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 47
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 claims abstract description 27
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 27
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 15
- 101150066002 GFP gene Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 7
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims abstract description 5
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims abstract description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 18
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 10
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 9
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 9
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 8
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 7
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 claims description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 7
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 6
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 claims description 5
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 claims description 5
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 5
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 5
- YCIHPQHVWDULOY-FMZCEJRJSA-N (4s,4as,5as,6s,12ar)-4-(dimethylamino)-1,6,10,11,12a-pentahydroxy-6-methyl-3,12-dioxo-4,4a,5,5a-tetrahydrotetracene-2-carboxamide;hydrochloride Chemical compound Cl.C1=CC=C2[C@](O)(C)[C@H]3C[C@H]4[C@H](N(C)C)C(=O)C(C(N)=O)=C(O)[C@@]4(O)C(=O)C3=C(O)C2=C1O YCIHPQHVWDULOY-FMZCEJRJSA-N 0.000 claims description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 4
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 3
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 claims description 3
- 241000222065 Lycoperdon Species 0.000 claims description 3
- 241000768494 Polymorphum Species 0.000 claims description 3
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 claims description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 claims description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 3
- 206010025421 Macule Diseases 0.000 claims description 2
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 claims description 2
- 230000004087 circulation Effects 0.000 claims description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 2
- 238000007689 inspection Methods 0.000 claims description 2
- 101150075980 psbA gene Proteins 0.000 claims description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 abstract description 2
- 230000003570 biosynthesizing effect Effects 0.000 abstract 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 abstract 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 abstract 1
- 229940023064 escherichia coli Drugs 0.000 description 15
- 108700020534 tetracycline resistance-encoding transposon repressor Proteins 0.000 description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 9
- 108700031407 Chloroplast Genes Proteins 0.000 description 5
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 1
- 241001465180 Botrytis Species 0.000 description 1
- 235000005637 Brassica campestris Nutrition 0.000 description 1
- 240000007124 Brassica oleracea Species 0.000 description 1
- 235000011302 Brassica oleracea Nutrition 0.000 description 1
- 241001301148 Brassica rapa subsp. oleifera Species 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 108010051219 Cre recombinase Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 241001529246 Platymiscium Species 0.000 description 1
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 1
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000036178 pleiotropy Effects 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种基于四环素调控系统检测叶绿体启动子活性的方法，属植物质体基因工程研究技术领域。本发明的方法以四环素基因及四环素特异性识别序列的核心操控区为基础，生物合成带有四环素核心操控区的prrnO1O2启动子，并在原核细胞中验证该启动子的活性，在该启动子的驱动下GFP基因表达；构建四环素诱导表达载体，筛选出适应细菌生长的最高四环素使用浓度为5μg/mL；最后构建四环素调控系统下的GFP表达载体，在未加入四环素时，prrnO1O2启动子的功能被抑制，加入四环素后，GFP基因表达出绿色荧光蛋白。本发明的有益效果在于：利用四环素调控系统控制叶绿体启动子的活性，从而避开了核基因组对质体基因组的调控干扰，为进一步的质体基因工程育种提供有有效的方法和途径。
Description
技术领域：
本发明涉及一种基于四环素调控系统检测叶绿体启动子活性的方法，属植物质体基因工程研究技术领域。
背景技术：
叶绿体基因工程是伴随着叶绿体基因组研究的不断深入而出现的，目前叶绿体基因组转化技术已在烟草、番茄、马铃薯、拟南芥、大豆、胡萝卜、花椰菜、油菜、水稻和棉花等高等植物中获得了成功。
与细胞核转基因技术相比，叶绿体基因转化具有明显的优势。(1)、通过DNA片段同源重组，可以精确地控制外源基因的插入位点；(2)、安全性及稳定性好。绝大多数植物的叶绿体基因为母系遗传，大大降低了基因扩散所引起的生态风险性；(3)、外源基因可得到超量表达。叶绿体转基因植物中，外源基因的表达量通常比核转化植株的表达量高出数十倍至数百倍。表达产物的区域化，也为目标蛋白的提取提供了方便。
大肠杆菌的四环素抗性操纵子的启动子区存在着两个基本相同的操纵序列(operator)，转座子Tn10编码的TetR(tetrepressor)蛋白可以与上述操纵序列紧密结合，阻止转录起始复合物的形成，从而达到从转录水平抑制四环素抗性基因的表达。当外源的四环素分子穿过大肠杆菌细胞膜进入细胞后，可特异结合TetR蛋白，使其构相改变,从操纵序列解离下来，于是转录起始复合物可以形成。四环素调控系统具有独特之处：(1)、关键元件均来自原核生物，由于原核与真核生物基因组的巨大差差异，该系统对真核基因组的表达几乎没有影响；(2)、原核基因缺乏多效性，简化了对转基因表型的解释；(3)、该系统的诱导因子是抗生素，与其他调控系统的诱导(如热休克、激素等)相比，在活体内不具有多态效应；(4)、诱导所需的Tc剂量较低，对细胞和哺乳动物是无害的；(5)、外源基因表达的水平与所加的Tc浓度在一定范围内相关，可通过控制Tet的浓度来控制基因表达的水平，了解基因不同水平的表达对细胞。
目前对Tet调控系统已经广泛应用于医学治疗，是目前应用最广的一种诱导系统，与Cre/loxP重组酶系统联合应用控制Cre重组酶基因的表达，但在很多植物上至今还未得到成功，四环素诱导表达系统在质体基因工程上的报道更是甚少。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种基于四环素调控系统检测叶绿体启动子活性的方法。通过四环素调控系统控制叶绿体基因的表达，为今后质体基因工程的研究提供一种有效的方法。
一种基于四环素调控系统检测叶绿体启动子活性的方法，其特征在于该方法的具体步骤如下：
a、查阅资料及在NCBI数据库中查得到四环素抗性操纵子的启动子区存在着两个基本相同的操纵序列(如图1)，两区域能够特异性识别四环素蛋白因子。并根据本Bio3-GFP表达载体设计本发明中涉及的特异性引物：SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、及SEQIDNO:5，其中：SEQIDNO:1:和SEQIDNO:2用于扩增步骤b中的新合成prrnO1O2启动子序列，SEQIDNO:3:和SEQIDNO:4用于扩增TetR基因序列，SEQIDNO:1:和SEQIDNO:5启动子prrn，将Tet两个核心操纵区嵌入启动子prrn中(如图2)，单下划线部分为操纵子O1，位于TATA-box方框标注的上游第2个碱基处；双下划线为部分为操纵子O2，位于prrn启动子转录起始位点A灰色底纹标注下游第3个碱基处；将该启动子送昆明硕阳生物公司全基因合成，上下分别游引入HindIII、XbaI酶切位点，以小写字母表示，命名该启动子为prrnO1O2；
b、用SEQIDNO:1和SEQIDNO:2引物对从新合成的基因序列上扩增prrnO1O2，使用TransFastFlyDNA聚合酶进行PCR扩增。PCR扩增体系含ddH2O14μL，5×PCR缓冲液(Mg2 +)5μL，2.5mmolL–1dNTPs2.5μL，引物各1μL，DNA聚合酶0.5μL，稀释模板DNA1μL。PCR扩增参数为95℃2min，95℃20s，54℃30s，72℃30s；35个循环。将回收目的片段分别连接到pEASY-Bluntsimple克隆载体，并转化至大肠杆菌感受态细胞TransT1,经过常规的纯化培养和蓝白斑筛选、PCR鉴定，取阳性克隆进行鉴定并测序；将该菌株进行常规的扩大培养，并进行质粒纯化回收；
c、将带有启动子片段prrnO1O2的载体与Bio3-GFP载体均使用HindIII/XbaI双酶切，酶切反应体系为30μL，包括ddH2O12μL，10×Mbuffer3μL，HindIII1.5μL，XbaI1.5μL，质粒12μL；37℃反应3h，凝胶电泳观察后回收目的片段后，用T4连接酶连接(如图3B)，连接反应体系为10μL：包括ddH2O1μL，T4ligationbuffer1μL，T4ligation0.5μL，目的片段5.5μL，载体片段2μL；检测新合成的prrnO1O2启动子是否具有启动子活性，在60μg/mL的Amp培养基上能够正常生长且菌体呈现出绿色(如图5)，表明该启动子能够在细菌中启动下游GFP基因的表达；
d、用SEQIDNO:3和SEQIDNO:4引物对从原有载体上扩增得到的TetR基因序列连接到pEasy-Blunt克隆载体上，PCR检测正确后，同时将该载体与Bio3-prrn-GFP用SalI/KpnI双酶切，回收目的条带，用T4连接酶连接(如图3A)，PCR及酶切检测表达载体的正确性，命名为Bio3-prrn-TetR；在60μg/mL的Amp抗生素的培养基上，同时设置四环素浓度梯度，分别0、1、2.5、5、10、15、20μg/mL，结果显示在四环素的浓度为5μg/mL是菌体正常生长，而10μg/mL时细菌没有生长，说明四环素的使用最高浓度为5μg/mL；
e、用SEQIDNO:1和SEQIDNO5引物对用于扩增prrn+TetR+psbA表达盒，构建四环素诱导下的GFP基因的表达载体，连接到pEasy-Blunt克隆载体上，PCR检测正确后，同时将该载体与Bio3-TetR均使用HindIII单酶切，回收目的条带，用T4连接酶连接(如图3C)，检测正确后，命名为Bio3-TetR-pO1O2-GFP(如图4)；在60μg/mL的Amp培养基上，含有该表达质粒的大肠杆菌能够正常生长，但是GFP基因没有表达出绿色荧光蛋白(如图6)，说明TetR蛋白表达后结合到prrnO1O2启动子的核心操纵区上，抑制了prrnO1O2启动子的功能；而后加入5μg/mL的盐酸四环素，GFP蛋白表达，显示出绿色的菌体，但表达量降低(如图7)；
f、结果判定
带有核心操纵子的prrnO1O2启动子在原核细胞中能够启动下游GFP基因的表达；TetR蛋白表达后结合到prrnO1O2启动子的核心操纵区上，抑制了prrnO1O2启动子；而加入5μg/mL的盐酸四环素后，下游GFP蛋白表达；说明这是一种基于四环素调控系统检测叶绿体启动子活性的方法。
本发明的有益效果在于：利用新合成的叶绿体启动子，并在大肠杆菌中检测其活性，同时利用四环素调控系统来调控叶绿体基因的表达，为叶绿体基因工程的研究提供一种有效的方法。
附图说明：
图1为Tet操纵子序列。*号碱基代表回纹序列的中心碱基；箭头表示回纹序列；方框内则代表与TetR蛋白直接作用的碱基序列。
图2为prrnO1O2启动子序列结构。其中单下划线部分为操纵子O1，；双下划线为部分为操纵子O2，位于prrn启动子转录起始位点A(灰色底纹标注)下游第3个碱基处；上下分别游引入HindIII、XbaI酶切位点，以小写字母表示。
图3为三种表达载体的构建示意图。A表示prrnO1O2启动子活性检测的Bio3-prrnO1O2-GFP表达载体图；B表示Tet浓度检测的Bio3-prrn-TetR示意图；C表示四环素诱导下的GFP基因的Bio3-TetR-prrnO1O2-GFP表达载体示意图。
图4为上述三种表达载体的酶切检测图。M：Trans2kPlusIIDNAmarker；1：Bio3-TetR-prrnO1O2-GFP用HindIII单酶切；2：Bio3-prrnO1O2-GFP用HindIII/XbaI双酶切；3：Bio3-prrn-TetR用SalI/KpnI双酶切。
图5为检测新合成的prrnO1O2启动子在大肠杆菌中的活性。
图6为Bio3-TetR-prrnO1O2-GFP表达载体在没有四环素诱导时大肠杆菌的生长情况。
图7为Bio3-TetR-prrnO1O2-GFP表达载体在加入5μg/mL的四环素时大肠杆菌生长情况。
具体实例方式：
下面结合附图和实例对本发明作进一步说明。本实施例的方法步骤同发明内容部分描述的方法步骤。
实施例1：
1.准备材料
1.1仪器
PCR仪、超低温冰箱、离心机、超净操作台、电泳仪、紫外凝胶成像系统，超纯水系统。
1.2实验试剂
感受态细胞、pEASY-Blunt克隆载体、DNA聚合酶购置于北京全式金生物公司，T4连接酶、各种限制性内切酶购于Takara生物公司，质粒回收试剂盒、凝胶回收试剂盒购于庄萌国际。
1.3引物设计
本发明中所用到的引物序列SEQID
NO:1(5’-CAAGCTTGCTCCCCCGCCGTCGTTCAAT-3’)、
NO:2(5’-GTCTAGAGCTAGCCTGTCCACCAGTCAT-3’)、
NO:3(5’-CGTCGACATGTCTAGATTAGATAAAAGTA-3’)、
NO:4(5’-CGGTACCTTAAGACCCACTTTCACATTTA-3’)、
NO:5(5’-CAAGCTTCATGAATAAATGCAAGAAAAT-3’)由北京华大基因公司合成。
2.实验方法和结果
2.1四环素诱导基因表达的浓度筛选
将构建正确的Bio3-ppsbA-TetR在60μg/mL的AmpLB固体培养基上，同时设置四环素浓度梯度，分别0、1、2.5、5、10、15、20μg/mL，检测在不同Tc浓度下菌体的生长情况，筛选诱导大肠杆菌GFP正常生长、表达四环素浓度。最终的结果表明四环素的浓度为5μg/mL是菌体正常生长，而10μg/mL时细菌没有生长，说明四环素的使用最高浓度为5μg/mL。
2.2四环素调控下的叶绿体启动子活性检测
将构建好的Bio3-TetR-prrnO1O2-GFP表达载体的菌株在60μg/mL的Amp培养基平板上。一个未加入Tc，另一平板加入5μg/mL的Tc，培养观察两平板中菌株的生长情况。结果表明在60μg/mL的Amp培养基上(未添加Tc)，含有该表达质粒的大肠杆菌能够正常生长，但是GFP基因没有表达出绿色荧光蛋白(如图6)，说明TetR蛋白表达后结合到prrnO1O2启动子的核心操纵区上，抑制了prrnO1O2启动子的功能；而后加入5μg/mL的Tc，大肠杆菌能够正常生长，GFP蛋白表达，显示出绿色的菌体，但表达量降低(如图7)。
序列表
<110>云南农业大学
<120>基于四环素操控系统检测叶绿体启动子活性的方法
<130>2015
<160>7
<170>PatentInversion3.5
<210>1
<211>28
<212>DNA
<213>Escherichiacoli
<400>1
caagcttgctcccccgccgtcgttcaat28
<210>2
<211>28
<212>DNA
<213>Escherichiacoli
<400>2
gtctagagctagcctgtccaccagtcat28
<210>3
<211>29
<212>DNA
<213>Escherichiacoli
<400>3
cgtcgacatgtctagattagataaaagta29
<210>4
<211>29
<212>DNA
<213>Escherichiacoli
<400>4
cggtaccttaagacccactttcacattta29
<210>5
<211>28
<212>DNA
<213>Escherichiacoli
<400>5
caagcttcatgaataaatgcaagaaaat28
<210>6
<211>259
<212>DNA
<213>Escherichiacoli
<400>6
gctcccccgccgtcgttcaatgagaatggataagaggctcgtgggattgacgtgaggggg60
cagggatggactctatcattgatagagtctatatttctgggagggagtctccctatcagt120
tccctatcagtgatagagagatagagagtctccctatcagtgatagagatcaccacaacg180
gtttcccactagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacatatggcaagcat240
gactggtggacaggctagc259
<210>7
<211>624
<212>DNA
<213>Escherichiacoli
<400>7
atgtctagattagataaaagtaaagtgattaacagcgcattagagctgcttaatgaggtc60
ggaatcgaaggtttaacaacccgtaaactcgcccagaagctaggtgtagagcagcctaca120
ttgtattggcatgtaaaaaataagcgggctttgctcgacgccttagccattgagatgtta180
gataggcaccatactcacttttgccctttagaaggggaaagctggcaaagattttttacg240
taataacgctaaaagttttagatgtgctttactaagtcatcgcgatggagcaaagtacat300
ttaggtacacggcctacagaaaaacagtatgaaactctcgaaaatcaattagccttttta360
tgccaacaaggtttttcactagagaatgcattatatgcactcagcgctgtggggcatttt420
actttaggttgcgtattggaagatcaagagcatcaagtcgctaaagaagaaagggaaaca480
cctactactgatagtatgccgccattattacgacaagctatcgaattatttgatcaccaa540
ggtgcagagccagccttcttattcggccttgaattgatcatatgcggattagaaaaacaa600
cttaaatgtgaaagtgggtcttaa624
Claims (1)
1.一种基于四环素调控系统检测叶绿体启动子活性的方法，其特征在于该方法的具体步骤如下：
a、查阅资料及在NCBI数据库中查得到四环素抗性操纵子的启动子区存在着两个基本相同的操纵序列，两区域能够特异性识别四环素蛋白因子；并根据本Bio3-GFP表达载体设计本发明中涉及的特异性引物：SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、及SEQIDNO:5，其中：SEQIDNO:1:和SEQIDNO:2用于扩增步骤b中的新合成prrnO1O2启动子序列，SEQIDNO:3:和SEQIDNO:4用于扩增TetR基因序列，SEQIDNO:1:和SEQIDNO:5启动子prrn，将Tet两个核心操纵区嵌入启动子prrn中，单下划线部分为操纵子O1，位于TATA-box方框标注的上游第2个碱基处；双下划线为部分为操纵子O2，位于prrn启动子转录起始位点A灰色底纹标注下游第3个碱基处；将该启动子送昆明硕阳生物公司全基因合成，上下分别游引入HindIII、XbaI酶切位点，以小写字母表示，命名该启动子为prrnO1O2；
b、用SEQIDNO:1和SEQIDNO:2引物对从新合成的基因序列上扩增prrnO1O2,使用TransFastFlyDNA聚合酶进行PCR扩增；PCR扩增体系含ddH2O14μL，5×PCR缓冲液(Mg2+)5μL，2.5mmolL–1dNTPs2.5μL，引物各1μL，DNA聚合酶0.5μL，稀释模板DNA1μL；PCR扩增参数为95℃2min，95℃20s，54℃30s，72℃30s；35个循环；将回收目的片段分别连接到pEASY-Bluntsimple克隆载体，并转化至大肠杆菌感受态细胞TransT1,经过常规纯化培养和蓝白斑筛选、PCR鉴定，取阳性克隆进行鉴定并测序；将该菌株进行扩大培养，并进行质粒纯化回收；
c、将带有启动子片段prrnO1O2的载体与Bio3-GFP载体均使用HindIII/XbaI双酶切，酶切反应体系为30μL，包括ddH2O12μL，10×Mbuffer3μL，HindIII1.5μL，XbaI1.5μL，质粒12μL；37℃反应3h，凝胶电泳观察后回收目的片段后，用T4连接酶连接，连接反应体系为10μL：包括ddH2O1μL，T4ligationbuffer1μL，T4ligation0.5μL，目的片段5.5μL，载体片段2μL；检测新合成的prrnO1O2启动子是否具有启动子活性；在60μg/mL的Amp培养基上能够正常生长且菌体呈现出绿色，表明该启动子能够在细菌中启动下游GFP基因的表达；
d、用SEQIDNO:3和SEQIDNO:4引物对从原有载体上扩增得到的TetR基因序列连接到pEasy-Blunt克隆载体上，PCR检测正确后，同时将该载体与Bio3-GFP用SalI/KpnI双酶切，回收目的条带，用T4连接酶连接，PCR及酶切检测表达载体的正确性，命名为Bio3-prrn-TetR，在60μg/mL的Amp抗生素的培养基上，同时设置四环素浓度梯度，分别0、1、2.5、5、10、15、20μg/mL，结果显示在四环素的浓度为5μg/mL是菌体正常生长，而10μg/mL时细菌没有生长，说明四环素的使用最高浓度为5μg/mL；
e、用SEQIDNO:1和SEQIDNO5引物对用于扩增prrn+TetR+psbA表达盒，构建四环素诱导下的GFP基因的表达载体，连接到pEasy-Blunt克隆载体上，PCR检测正确后，同时将该载体与Bio3-prrn-TetR均使用HindIII单酶切，回收目的条带，用T4连接酶连接，检测正确后，命名为Bio3-TetR-pO1O2-GFP；在60μg/mL的Amp培养基上，含有该表达质粒的大肠杆菌能够正常生长，但是GFP基因没有表达出绿色荧光蛋白，说明TetR蛋白表达后结合到prrnO1O2启动子的核心操纵区上，抑制了prrnO1O2启动子的功能；而后加入5μg/mL的盐酸四环素，GFP蛋白表达，显示出绿色的菌体，但表达量降低；
f、结果判定
带有核心操纵子的prrnO1O2启动子在原核细胞中能够启动下游GFP基因的表达；TetR蛋白表达后结合到prrnO1O2启动子的核心操纵区上，抑制了prrnO1O2启动子；而加入5μg/mL的盐酸四环素后，下游GFP蛋白表达；说明这是一种基于四环素调控系统检测叶绿体启动子活性的方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510941377 | 2015-12-16 | ||
| CN2015109413771 | 2015-12-16 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105734138A true CN105734138A (zh) | 2016-07-06 |
| CN105734138B CN105734138B (zh) | 2021-05-07 |
Family
ID=56252364
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201610182483.0A Expired - Fee Related CN105734138B (zh) | 2015-12-16 | 2016-03-28 | 基于四环素调控系统检测叶绿体启动子活性的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105734138B (zh) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106591347A (zh) * | 2017-01-18 | 2017-04-26 | 成都分子脉象生物科技有限公司 | 一种包含噬菌体溶菌酶的表达系统及其运用 |
| CN107523588A (zh) * | 2017-08-18 | 2017-12-29 | 深圳大学 | 一种四环素慢病毒诱导表达载体及其建立方法和应用 |
| CN108823208A (zh) * | 2018-06-29 | 2018-11-16 | 中国科学院过程工程研究所 | 一种四环素诱导启动子及其制备方法和应用 |
| CN109777863A (zh) * | 2019-02-14 | 2019-05-21 | 湖北大学 | 鉴定sRNA与靶mRNA编码区域的作用关系的方法及检测系统 |
| CN110656121A (zh) * | 2019-10-29 | 2020-01-07 | 江南大学 | 一种调控大肠杆菌细胞大小的方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012156535A1 (en) * | 2011-05-19 | 2012-11-22 | Fundación Progreso Y Salud | Highly inducible dual-promoter lentiviral tet-on system |
| CN103732751A (zh) * | 2011-03-09 | 2014-04-16 | 翁德克控股有限公司 | 在幽门螺杆菌中的基因表达和根除系统 |
-
2016
- 2016-03-28 CN CN201610182483.0A patent/CN105734138B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103732751A (zh) * | 2011-03-09 | 2014-04-16 | 翁德克控股有限公司 | 在幽门螺杆菌中的基因表达和根除系统 |
| WO2012156535A1 (en) * | 2011-05-19 | 2012-11-22 | Fundación Progreso Y Salud | Highly inducible dual-promoter lentiviral tet-on system |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| AGHA-MOHAMMADI S.等: "Second-generation tetracycline-regulatable promoter:repositoned tet operator elements optimize transactivator synergy while shorter minimal promoter offers tight basal leakiness", 《JOURNAL OF GENE MEDICINE》 * |
| WANG XF.等: "Effects of tetracycline operator element insertion on Plasmodium falciparum glycophorin binding protein 130 gene promoter activity", 《CHINESE JOURANL OF PARASITOLOGY&PARASITIC DISEASES》 * |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106591347A (zh) * | 2017-01-18 | 2017-04-26 | 成都分子脉象生物科技有限公司 | 一种包含噬菌体溶菌酶的表达系统及其运用 |
| CN107523588A (zh) * | 2017-08-18 | 2017-12-29 | 深圳大学 | 一种四环素慢病毒诱导表达载体及其建立方法和应用 |
| CN107523588B (zh) * | 2017-08-18 | 2020-08-07 | 深圳大学 | 一种四环素慢病毒诱导表达载体及其建立方法和应用 |
| CN108823208A (zh) * | 2018-06-29 | 2018-11-16 | 中国科学院过程工程研究所 | 一种四环素诱导启动子及其制备方法和应用 |
| CN108823208B (zh) * | 2018-06-29 | 2021-11-02 | 中国科学院过程工程研究所 | 一种四环素诱导启动子及其制备方法和应用 |
| CN109777863A (zh) * | 2019-02-14 | 2019-05-21 | 湖北大学 | 鉴定sRNA与靶mRNA编码区域的作用关系的方法及检测系统 |
| CN110656121A (zh) * | 2019-10-29 | 2020-01-07 | 江南大学 | 一种调控大肠杆菌细胞大小的方法 |
| CN110656121B (zh) * | 2019-10-29 | 2022-04-29 | 江南大学 | 一种调控大肠杆菌细胞大小的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105734138B (zh) | 2021-05-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105734138A (zh) | 基于四环素调控系统检测叶绿体启动子活性的方法 | |
| US10301636B2 (en) | Plant cell comprising mutation introduced in target DNA, and method for producing the plant cell | |
| El-Sheekh | Stable transformation of the intact cells of Chlorella kessleri with high velocity microprojectiles | |
| Jia et al. | Xcc-facilitated agroinfiltration of citrus leaves: a tool for rapid functional analysis of transgenes in citrus leaves | |
| Kubo et al. | System for stable β-estradiol-inducible gene expression in the moss Physcomitrella patens | |
| Bitrián et al. | BAC‐recombineering for studying plant gene regulation: developmental control and cellular localization of SnRK1 kinase subunits | |
| CN105543270A (zh) | 双抗性CRISPR/Cas9载体及应用 | |
| Yadav et al. | Strain specific Agrobacterium-mediated genetic transformation of Bacopa monnieri | |
| Gu et al. | Functional analysis of the 5′ regulatory region of the maize GALACTINOL SYNTHASE2 gene | |
| Sahoo et al. | pSiM24 is a novel versatile gene expression vector for transient assays as well as stable expression of foreign genes in plants | |
| Lapham et al. | Agrobacterium VirE2 protein modulates plant gene expression and mediates transformation from its location outside the nucleus | |
| Alimohammadi et al. | Agrobacterium-mediated transformation of plants: Basic principles and influencing factors | |
| XU et al. | OsPIN1a gene participates in regulating negative phototropism of rice roots | |
| CN110106171B (zh) | 长链非编码rna及其在调控植物耐低温中的应用 | |
| CN109762815B (zh) | 一种在水稻花药与花粉中特异表达的启动子pchf17及其应用 | |
| CN105018508A (zh) | Rna核滞留载体的构建及应用 | |
| CN114807138B (zh) | 一种植物环状rna过表达载体及其构建方法和应用 | |
| Lin et al. | Efficient CRISPR/Cas9‐mediated genome editing in sheepgrass (Leymus chinensis) | |
| Xin et al. | Salt stress tolerance analysis of SAIR6 long non-coding RNA in Tamarix hispida | |
| CN105316333A (zh) | 植物花药特异表达启动子pTaASG005的鉴定和应用 | |
| CN105543229A (zh) | 水稻几丁质激发子结合基因启动子及其应用 | |
| Puhan et al. | An efficient and universal Agrobacterium-mediated transformation protocol in rice | |
| Cao et al. | A toolbox for constructing a stable genetic transformation platform allowing foreign fragment integration in the genome of neopyropia yezoensis | |
| CN117363644B (zh) | Vigs沉默效率报告质粒、评价沉默效率的方法及应用 | |
| CN112852805B (zh) | 水稻miRNA纯合致死突变体的制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20210507 |