CN108823208A - 一种四环素诱导启动子及其制备方法和应用 - Google Patents

一种四环素诱导启动子及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种四环素诱导启动子及其制备方法和应用，所述启动子为将组成型启动子的间隔序列突变为四环素操纵基因；其中，所述间隔序列包括‑35区至‑10区之间的核酸序列、‑10区至转录起始位点之间的核酸序列或‑(55±3)bp至‑35区之间的核酸序列中的任意一种或至少两种的组合。本发明将组成型启动子的间隔序列突变为四环素操纵基因，并利用四环素操纵基因与四环素阻遏蛋白的特异性结合作用，使得组成型启动子受四环素诱导调控，实现了四环素对目的基因的表达调控；将包括四环素诱导启动子和目的基因的表达载体导入嗜盐嗜碱多能硫碱弧菌，高效启动了目的基因的表达，实现了对嗜盐嗜碱多能硫碱弧菌的改造。

Description

一种四环素诱导启动子及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种四环素诱导启动子及其制备方法和应用。
背景技术
嗜盐嗜碱多能硫碱弧菌是一种高GC含量的革兰氏阴性菌和好氧性光合硫细菌，可以在pH为7-11、Na+为0-4M的环境中生长。它是一种化能自养型微生物，以二氧化碳为碳源，硫化钠或硫代硫酸钠等硫物质为电子供体，在氧化硫物质的过程中产生单质硫或硫酸盐。相比于其他生物脱硫微生物，嗜盐嗜碱多能硫碱弧菌对高盐高碱环境具有耐受性，克服了传统脱硫微生物脱硫率低的缺陷，但是存在生长速度慢的缺点，增加氧气量可以加快嗜盐嗜碱多能硫碱弧菌的生长速率，但会降低单质硫的回收率，造成硫酸盐大量积累，形成二次污染。对硫氧化菌进行基因工程改造可以提高固定二氧化碳的速率，增加单质硫的回收量，增强硫化物的脱除效果。
目前，基因工程的改造方法主要包括诱变和筛选，然而这些方法工作量大，效率较低。CN 105087625A公开了一种嗜盐嗜碱硫碱弧菌的遗传转化方法，包括如下步骤：1)将分离纯化后的菌株接种在硫碱弧菌合成培养基中培养，培养时间为12～18h，OD600值在0.5～0.9之间时收集菌体；2)通过CaCl2-NaCl溶液处理的方法，制备具有吸附外源DNA能力的感受态细胞；3)通过热激反应，将外源的带有抗性的质粒导入步骤2)的感受态细胞中；4)将导入质粒的感受态细胞进行孵育，涂布在抗性平板上，筛选具有抗性的转化菌株。然而这种筛选的方法效率较低，得到的优良菌株的比例较低。
随着嗜盐嗜碱硫氧化菌基因组测序工作的完成，硫氧化菌的代谢网络图谱不断完善，对硫氧化菌进行定向基因编辑改造成为可能。发明人在前期的实验研究中，利用接合转移的方式，将携带有异源基因的表达质粒转化入菌体，增强了硫碱弧菌的生长速率和脱硫速率。然而，启动异源基因表达的启动子仅限于组成型启动子(例如Pgpx)，尚未构建得到诱导型启动子调控基因转录。此外，嗜盐嗜碱硫氧化菌细胞膜上缺乏糖类分子转运蛋白，因此传统的乳糖、半乳糖或木糖等诱导型启动子不能应用于菌株中。
因此，提供一种诱导剂毒性小、可自由扩散进入细胞的实用的诱导型启动子，在生物技术领域具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种四环素诱导启动子及其制备方法和应用，所述四环素诱导启动子在嗜盐嗜碱多能硫碱弧菌中作为严谨型诱导启动子，在转录水平高效调控基因表达，是搭建遗传改造平台不可或缺的元件。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种四环素诱导启动子，所述启动子为将组成型启动子的间隔序列突变为四环素操纵基因；
其中，所述间隔序列包括-35区至-10区之间的核酸序列、-10区至转录起始位点之间的核酸序列或-(55±3)bp至-35区之间的核酸序列中的任意一种或至少两种的组合。
本发明中，将组成型启动子的间隔序列突变为四环素操纵基因，使得组成型启动子受四环素诱导调控，实现了四环素对目的基因的表达调控。
优选地，所述组成型启动子包括谷氨酸过氧化物酶启动子。
本发明中，所述谷氨酸过氧化物酶启动子是嗜盐嗜碱多能硫碱弧菌D301基因组中第847671-847457位的自身组成型启动子。
优选地，所述谷氨酸过氧化物酶启动子的核酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述SEQ ID NO.1所示的核酸序列为：
ACCTTCGCGATTTTCGAGTTCCATATTTCGTACTCCTGTTTGGGTGTTAATTGCAGTAGACCAGAAAGAAGATTTTGGTTCGGTCGAGGCGATGCCCGACTGCTAGACTCAAGATAAGGGCTGGCCTCTCATTGATCCAGTTTTCGTTCTCTATACGGTTGTTAGTTTTGGGCTATCGTCAGTTCCGGCCCTTTGTGGTGTCTCAAGGTTGACGCCTTTCCTGGCTTTGCTTCCAGATGTATGCTCTCTCGAGATCGACTGCACGGTGCACCAATGCTTCTGGCGTCAGGCAGCCATCGGAAGCTGTGGTATGGCTGTGCAGGTCGTAAATCACTGCATAATTCGTGTCGCTCAAGGCGCACTCCCGTTCTGGATAATGTTTTTTGCGCCGACATCATAACGGTTCTGGCAAATATTCTGAAATGAGCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACACTGCAGGAGGATGTCTAGATTAGATAAAAGTAAAGTGATTAACAGCGCATTAGAGCTGCTTAATGAGGTCGGAATCGAAGGTTTAACAACCCGTAAACTCGCCCAGAAGCTAGGTGTAGAGCAGCCTACATTGTATTGGCATGTAAAAAATAAGCGGGCTTTGCTCGACGCCTTAGCCATTGAGATGTTAGATAGGCACCATACTCACTTTTGCCCTTTAGAAGGGGAAAGCTGGCAAGATTTTTTACGTAATAACGCTAAAAGTTTTAGATGTGCTTTACTAAGTCATCGCGATGGAGCAAAAGTACATTTAGGTACACGGCCTACAGAAAAACAGTATGAAACTCTCGAAAATCAATTAGCCTTTTTATGCCAACAAGGTTTTTCACTAGAGAATGCATTATATGCACTCAGCGCTGTGGGGCATTTTACCCACTTTCACATTTAAGTTGTTTTTTAGGTTGCGTATTGGAAGATCAAGAGCATCAAGTCGCTAAAGAAGAAAGGGAAACACCTACTACTGATAGTATGCCGCCATTATTACGACAAGCTATCGAATTATTTGATCACCAAGGTGCAGAGCCAGCCTTCTTATTCGGCCTTGAATTGATCATATGCGGATTAGAAAAACAACTTAAATGTGAAAGTGGGTCTTAAAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTCCTCAGGCATTTG.
优选地，所述四环素操纵基因的核酸序列如SEQ ID NO.2-3所示；
所述SEQ ID NO.2所示的核酸序列为：5’-ACTCTATCATTGATAGAGT-3’；
所述SEQ ID NO.3所示的核酸序列为：5’-TCCCTATCAGTGATAGAGA-3’.
优选地，所述启动子还包括tac启动子、四环素阻遏蛋白基因和rrnBT1终止子。
四环素操纵基因(TetO)和四环素阻遏蛋白(TetR)具有特异性结合作用，当不存在四环素时，TetR与TetO结合，阻断启动子的启动，目的基因不表达；当存在四环素时，四环素使TetR的构象发生改变，TetR与TetO分离，启动子作用恢复，目的基因表达。
本发明利用TetO和TetR的特异性结合作用，实现了目的基因的表达调控。
第二方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体包括如第一方面所述的四环素诱导启动子。
优选地，所述表达载体还包括目的基因。
第三方面，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括如第二方面所述的表达载体。
优选地，所述宿主细胞包括硫氧化菌。
优选地，所述硫氧化菌包括嗜盐嗜碱硫碱弧菌。
第四方面，本发明提供了一种目的蛋白的表达方法，所述方法包括以下步骤：
(1)构建第二方面所述的表达载体；
(2)将步骤(1)所述表达载体转入感受态细胞，培养后挑取单克隆细胞进行筛选；
(3)采用接合转移的方式，将筛选的表达载体转入宿主细胞，进行目的蛋白的表达。
优选地，步骤(1)所述构建的方法包括以下步骤：
(1’)构建包括组成型启动子的克隆载体；
(2’)利用四环素操纵基因突变步骤(1’)所述组成型启动子的间隔序列；
(3’)将tac启动子、四环素阻遏蛋白和rrnBT1终止子连接入克隆载体，得到包括四环素诱导启动子的克隆载体；
(4’)PCR扩增步骤(3’)所述克隆载体的四环素诱导启动子片段，连接入带有目的基因的表达载体，得到所述包括四环素诱导启动子的表达载体。
优选地，步骤(1’)所述组成型启动子包括谷氨酸过氧化物酶启动子。
优选地，步骤(2’)所述间隔序列包括-35区至-10区之间的核酸序列、-10区至转录起始位点之间的核酸序列或-(55±3)bp至-35区之间的核酸序列中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，步骤(1)所述构建的方法采用的引物如SEQ ID NO.4-16所示；
所述SEQ ID NO.4所示的核酸序列为：
GGGGTACCAGTTGCTACCGTTGCTCCCTTC；
所述SEQ ID NO.5所示的核酸序列为：
CGCGGATCCACCTTCGCGATTTTCGAGTTC；
所述SEQ ID NO.6所示的核酸序列为：
CATCGCCTCGACCTCCCTATCAGTGATAGATGGTCTACTGCAATTAACAC；
所述SEQ ID NO.7所示的核酸序列为：
CAGTAGACCATCTATCACTGATAGGGAGGTCGAGGCGATGCCCGACTGCT；
所述SEQ ID NO.8所示的核酸序列为：
GTGTCTCAAGGTTGACGCCTTTCCTGGCTTTGCTTCCAG；
所述SEQ ID NO.9所示的核酸序列为：
GTTAATCACTTTACTTTTATCTAATCTAGACATCCTCCTGCAGTGTTTCCTGTG；
所述SEQ ID NO.10所示的核酸序列为：
CACAGGAAACACTGCAGGAGGATGTCTAGATTAGATAAAAGTAAAGTGATTAAC；
所述SEQ ID NO.11所示的核酸序列为：
TGAGCCTTTCGTTTTATTTGATGCCTTTAAGACCCACTTTCACATTTAAG；
所述SEQ ID NO.12所示的核酸序列为：
CAAATGCCTGAGGACAACAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGATGCCT；
所述SEQ ID NO.13所示的核酸序列为：
ACCTTCGCGATTTTCGAGTTC；
所述SEQ ID NO.14所示的核酸序列为：
CTGGAAGCAAAGCCAGGAAAGGCGTCAACCTTGAGACAC；
所述SEQ ID NO.15所示的核酸序列为：
GGGGTACCAGTTGCTACCGTTGCTCCCTTC；
所述SEQ ID NO.16所示的核酸序列为：
CGCGGATCCCAAATGCCTGAG.
优选地，步骤(2)所述感受态细胞包括大肠杆菌。
作为优选技术方案，本发明提供了一种目的蛋白的表达方法，所述方法包括以下步骤：
(1)构建包括谷氨酸过氧化物酶启动子的克隆载体，利用四环素操纵基因突变谷氨酸过氧化物酶启动子的间隔序列，所述间隔序列包括-35区至-10区之间的核酸序列、-10区至转录起始位点之间的核酸序列或-(55±3)bp至-35区之间的核酸序列中的任意一种或至少两种的组合，将tac启动子、四环素阻遏蛋白和rrnBT1终止子连接入克隆载体，得到包括四环素诱导启动子的克隆载体，PCR扩增克隆载体的四环素诱导启动子片段，连接入带有目的基因的表达载体，得到包括四环素诱导启动子的表达载体；
(2)将步骤(1)所述表达载体转入感受态细胞，培养后挑取单克隆细胞进行筛选；
(3)采用接合转移的方式，将筛选的表达载体转入宿主细胞，进行目的蛋白的表达。
第五方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括如第一方面所述四环素诱导启动子、如第二方面所述表达载体或如第三方面所述宿主细胞中的任意一种或至少两种的组合。
第六方面，本发明提供了一种如第一方面所述四环素诱导启动子、如第二方面所述表达载体、如第三方面所述宿主细胞或如第五方面所述试剂盒中的任意一种或至少两种的组合在目的基因表达调控中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明将组成型启动子的间隔序列突变为四环素操纵基因，并利用四环素操纵基因与四环素阻遏蛋白的特异性结合作用，使得组成型启动子受四环素诱导调控，实现了四环素对目的基因的表达调控；
(2)本发明将包括四环素诱导启动子和目的基因的表达载体导入嗜盐嗜碱多能硫碱弧菌，高效启动了目的基因的表达，实现了对嗜盐嗜碱多能硫碱弧菌的改造。
附图说明
图1为Pgpx(tet)片段示意图；
图2(A)为pBBR1MCS-1-Pgpx(tetO)-smr示意图，图2(B)为pBBR1MCS-1-Pgpx(tetO)-mazF示意图；
图3为Pgpx(tet)调控基因组细胞分裂基因ftsZ的表达，其中，Spe-氨基糖苷腺苷酰转移酶，Cm-氯霉素乙酰转移酶，OriT-IncP复制子。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1四环素诱导启动子的制备
(1)利用如SEQ ID NO.4-5所示的引物扩增嗜盐嗜碱多能硫碱弧菌D301基因组，得到谷氨酸过氧化物酶启动子(Pgpx)，引入酶切位点KpnI/BamHI，电泳胶回收后，酶切2h，同时酶切广宿主载体pBBR1MCS-1，将两种酶切产物利用T4连接酶在16℃下连接过夜，连接产物pBBR-Pgpx-RFP转化入大肠杆菌T1中，涂布于氯霉素抗性平板上，培养16h后进行菌落PCR检测，得到阳性菌；
(2)如图1所示，结合BDGP和BPROM预测Pgpx的核心启动子区、-35区和-10区，利用如SEQ ID NO.6-7所示的引物对Pgpx的间隔序列进行多寡核苷酸突变，反向扩增克隆载体pBBR-Pgpx-RFP，将Pgpx的间隔序列突变为如SEQ ID NO.2-3所示的四环素操纵基因，得到含有Pgpx(tet)片段的克隆载体；
(3)利用如SEQ ID NO.8-9所示的引物扩增tac启动子，利用如SEQ ID NO.10-12所示的引物扩增TetR并加尾rrnBT1终止子，通过重叠PCR技术利用如SEQ ID NO.13-14所示的引物将Pgpx(tet)、tac启动子、TetR和rrnBT1终止子合成，得到四环素诱导启动子。
实施例2四环素诱导启动子调控链霉素抗性基因smr的表达
(1)利用如SEQ ID NO.15-16所示的引物扩增实施例1得到的四环素诱导启动子，分别在5’和3’端引入酶切位点KpnI/BamHI，酶切2h，同时酶切表达载体pBBR1MCS-1-smr，将两种酶切产物利用T4连接酶在16℃下连接过夜，连接产物转化入大肠杆菌Sm10中，得到的阳性菌通过接合转移的方式将如图2(A)所示的含有四环素诱导启动子的表达载体(pBBR1MCS-1-Pgpx(tetO)-smr)转入到嗜盐嗜碱多能硫碱弧菌D301中；
(2)培养含有pBBR1MCS-1-Pgpx(tetO)-smr的嗜盐嗜碱多能硫碱弧菌D30116h，分别在含有aTc+、sm+和aTc-、sm+的抗性平板上划线，其中，aTc为四环素，sm为链霉素。
结果发现，aTc+、sm+平板上长出了表面覆盖有S颗粒的黄色划线菌落，而aTc-、sm+平板上没有菌落生长，说明四环素诱导启动子可以在嗜盐嗜碱多能硫碱弧菌中高效启动链霉素抗性基因的表达，使嗜盐嗜碱多能硫碱弧菌获得了链霉素抗性。
实施例3四环素诱导启动子调控毒素蛋白mazF的表达
(1)利用如SEQ ID NO.15-16所示的引物扩增实施例1得到的四环素诱导启动子，分别在5’和3’端引入酶切位点KpnI/BamHI，酶切2h，同时酶切表达载体pBBR1MCS-1-mazF，将两种酶切产物利用T4连接酶在16℃下连接过夜，连接产物转化入大肠杆菌S17中，得到的阳性菌通过接合转移的方式将如图2(B)所示的含有四环素诱导启动子的表达载体(pBBR1MCS-1-Pgpx(tetO)-mazF)转入到嗜盐嗜碱多能硫碱弧菌D301中；
(2)培养含有pBBR1MCS-1-Pgpx(tetO)-mazF的嗜盐嗜碱多能硫碱弧菌D301 16h，分别在含有aTc+、cm+和aTc-、cm+的抗性平板上划线，其中aTc为四环素，cm为氯霉素。
结果发现，aTc-、cm+平板上长出了表面覆盖有S颗粒的黄色划线菌落，而aTc+、cm+平板上没有菌落生长，说明四环素诱导启动子可以在嗜盐嗜碱多能硫碱弧菌中高效启动mazF毒素蛋白基因的表达，使嗜盐嗜碱多能硫碱弧菌对mazF毒素蛋白敏感。
实施例4四环素诱导启动子调控细胞分裂蛋白ftsZ基因的表达
(1)利用如SEQ ID NO.17-18所示的引物扩增细胞分裂蛋白ftsZ基因起始密码子后1.5kb的一段序列，利用如SEQ ID NO.19-20所示的引物扩增四环素诱导启动子Pgpx(tetO)，将得到的两个片段通过重叠PCR连接在一起，并引入酶切位点BamHI/HindIII，酶切连接到自杀质粒pRE112MCS中，连接产物转化入大肠杆菌S17中，得到的S17阳性菌通过接合转移的方式将含有四环素诱导启动子的自杀质粒转入到嗜盐嗜碱多能硫碱弧菌中，由于Rγ6复制子不能在嗜盐嗜碱多能硫碱弧菌中复制，自杀质粒上的同源臂会与基因组上的同源序列发生单交换，使得自杀质粒整合于基因组上，四环素诱导启动子位于ftsZ上游；
(2)将整合有自杀质粒的嗜盐嗜碱硫碱弧菌分别在含有四环素和不含有四环素的矿质培养基中培养16h，8000rpm离心10min收集菌体，采用PBS缓冲液重悬后，在相位对比显微镜下观察细胞的形态。
SEQ ID NO.17所示的核酸序列为：
GAACTCGAAAATCGCGAAGGTATGACGTTCGAACTGATGGACAC；
SEQ ID NO.18所示的核酸序列为：
CCCAAGCTTGTCGAGGTCGACTTCGACATC；
SEQ ID NO.19所示的核酸序列为：
CGCGGATCCCAAATGCCTGAG；
SEQ ID NO.20所示的核酸序列为：
GTGTCCATCAGTTCGAACGTCATACCTTCGCGATTTTCGAGTT.
结果显示，在不含有四环素矿质培养基中培养的硫碱弧菌成“串联”状态，长度是普通菌体的3-4倍；在含有四环素矿质培养基中培养的硫碱弧菌形态正常，说明四环素诱导启动子能够在基因组水平上严谨地调控ftsZ基因的表达。
综上所述，本发明将组成型启动子的间隔序列突变为四环素操纵基因，并利用四环素操纵基因与四环素阻遏蛋白的特异性结合作用，使得组成型启动子受四环素诱导调控，实现了四环素对目的基因的表达调控；将包括四环素诱导启动子和目的基因的表达载体导入嗜盐嗜碱多能硫碱弧菌，高效启动了目的基因的表达，使嗜盐嗜碱多能硫碱弧菌获得了新的性能。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院过程工程研究所
<120> 一种四环素诱导启动子及其制备方法和应用
<130> 20180627
<160> 20
<170> PatentIn version 3.3
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<211> 1229
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<213> 人工合成
<400> 4
ggggtaccag ttgctaccgt tgctcccttc 30
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
cgcggatcca ccttcgcgat tttcgagttc 30
<210> 6
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
catcgcctcg acctccctat cagtgataga tggtctactg caattaacac 50
<210> 7
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
cagtagacca tctatcactg atagggaggt cgaggcgatg cccgactgct 50
<210> 8
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
gtgtctcaag gttgacgcct ttcctggctt tgcttccag 39
<210> 9
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
gttaatcact ttacttttat ctaatctaga catcctcctg cagtgtttcc tgtg 54
<210> 10
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 10
cacaggaaac actgcaggag gatgtctaga ttagataaaa gtaaagtgat taac 54
<210> 11
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<212> DNA
<213> 人工合成
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tgagcctttc gttttatttg atgcctttaa gacccacttt cacatttaag 50
<210> 12
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 12
caaatgcctg aggacaacag ataaaacgaa aggcccagtc tttcgactga gcctttcgtt 60
ttatttgatg cct 73
<210> 13
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<212> DNA
<213> 人工合成
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accttcgcga ttttcgagtt c 21
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<212> DNA
<213> 人工合成
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ctggaagcaa agccaggaaa ggcgtcaacc ttgagacac 39
<210> 15
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 15
ggggtaccag ttgctaccgt tgctcccttc 30
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<212> DNA
<213> 人工合成
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cgcggatccc aaatgcctga g 21
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<211> 44
<212> DNA
<213> 人工合成
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gaactcgaaa atcgcgaagg tatgacgttc gaactgatgg acac 44
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<212> DNA
<213> 人工合成
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cccaagcttg tcgaggtcga cttcgacatc 30
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<212> DNA
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cgcggatccc aaatgcctga g 21
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 20
gtgtccatca gttcgaacgt cataccttcg cgattttcga gtt 43

Claims (10)

1.一种四环素诱导启动子，其特征在于，所述启动子为将组成型启动子的间隔序列突变为四环素操纵基因；
其中，所述间隔序列包括-35区至-10区之间的核酸序列、-10区至转录起始位点之间的核酸序列或-(55±3)bp至-35区之间的核酸序列中的任意一种或至少两种的组合。
2.根据权利要求1所述的启动子，其特征在于，所述组成型启动子包括谷氨酸过氧化物酶启动子；
优选地，所述谷氨酸过氧化物酶启动子的核酸序列如SEQ ID NO.1所示；
优选地，所述四环素操纵基因的核酸序列如SEQ ID NO.2-3所示；
优选地，所述启动子还包括tac启动子、四环素阻遏蛋白基因和rrnBT1终止子。
3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括如权利要求1或2所述的四环素诱导启动子；
优选地，所述表达载体还包括目的基因。
4.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括如权利要求3所述的表达载体；
优选地，所述宿主细胞包括硫氧化菌；
优选地，所述硫氧化菌包括嗜盐嗜碱硫碱弧菌。
5.一种目的蛋白的表达方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)构建如权利要求3所述的表达载体；
(2)将步骤(1)所述表达载体转入感受态细胞，培养后挑取单克隆细胞进行筛选；
(3)采用接合转移的方式，将筛选的表达载体转入宿主细胞，进行目的蛋白的表达。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述构建的方法包括以下步骤：
(1’)构建包括组成型启动子的克隆载体；
(2’)利用四环素操纵基因突变步骤(1’)所述组成型启动子的间隔序列；
(3’)将tac启动子、四环素阻遏蛋白和rrnBT1终止子连接入克隆载体，得到包括四环素诱导启动子的克隆载体；
(4’)PCR扩增步骤(3’)所述克隆载体的四环素诱导启动子片段，连接入带有目的基因的表达载体，得到所述包括四环素诱导启动子的表达载体；
优选地，步骤(1’)所述组成型启动子包括谷氨酸过氧化物酶启动子；
优选地，步骤(2’)所述间隔序列包括-35区至-10区之间的核酸序列、-10区至转录起始位点之间的核酸序列或-(55±3)bp至-35区之前的核酸序列中的任意一种或至少两种的组合。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述构建的方法采用的引物如SEQ ID NO.4-16所示；
优选地，步骤(2)所述感受态细胞包括大肠杆菌。
8.根据权利要求5-7任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)构建包括谷氨酸过氧化物酶启动子的克隆载体，利用四环素操纵基因突变谷氨酸过氧化物酶启动子的间隔序列，所述间隔序列包括-35区至-10区之间的核酸序列、-10区至转录起始位点之间的核酸序列或-(55±3)bp至-35区之前的核酸序列中的任意一种或至少两种的组合，将tac启动子、四环素阻遏蛋白和rrnBT1终止子连接入克隆载体，得到包括四环素诱导启动子的克隆载体，PCR扩增克隆载体的四环素诱导启动子片段，连接入带有目的基因的表达载体，得到包括四环素诱导启动子的表达载体；
(2)将步骤(1)所述表达载体转入感受态细胞，培养后挑取单克隆细胞进行筛选；
(3)采用接合转移的方式，将筛选的表达载体转入宿主细胞，进行目的蛋白的表达。
9.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1或2所述四环素诱导启动子、如权利要求3所述表达载体或如权利要求4所述宿主细胞中的任意一种或至少两种的组合。
10.一种1或2所述四环素诱导启动子、如权利要求3所述表达载体、如权利要求4所述宿主细胞或如权利要求9所述试剂盒中的任意一种或至少两种的组合在目的基因表达调控中的应用。
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