CN117487940A - 一种马铃薯黑胫病的lamp检测引物组合及其可视化检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种马铃薯黑胫病的LAMP检测引物组合及其可视化检测方法，属于植物病害检测技术领域，所述LAMP检测引物组合包括：SEQ ID NO.1所示正向外引物F3、SEQ ID NO.2所示反向外引物B3、SEQ ID NO.3所示正向内引物FIP、SEQ ID NO.4所示反向内引物BIP、SEQ ID NO.5所示正向环引物LF和SEQ ID NO.6所示反向环引物LB。所述可视化检测方法，包括以下步骤：提取待测样本DNA；进行LAMP扩增反应；显色反应，若呈现黄绿色，则患有马铃薯黑胫病。本发明检测引物组合适用于LAMP可视化快速检测，可用于快速、准确的检测马铃薯黑胫病，且灵敏度高。
Description
技术领域
本发明属于植物病害检测技术领域，尤其涉及一种马铃薯黑胫病的LAMP检测引物组合及其可视化检测方法。
背景技术
马铃薯是仅次于水稻和小麦的全球第三大粮食作物，我国马铃薯的种植面积居世界前列，随着马铃薯主粮化的发展，其在粮食作物中的地位逐步增长。马铃薯为无性繁殖作物，在生长过程中，马铃薯黑胫病是危害马铃薯生产的重要种传和土传病害之一，在马铃薯各生育期和贮藏期都可发生，被世界各国列为检疫性病害，其寄主范围极广，除危害马铃薯外，还能侵染茄科、葫芦科、豆科和藜科等多种植物。马铃薯黑胫病的出现导致近年来尤其是生产田发病现象发生严重，病菌通过带菌种薯扩大发病面积，最终造成薯块大量腐烂变质，商品薯减产现象严重，直接造成严重经济损失，马铃薯黑胫病的主要特征种薯带菌，发病早、发病快、死亡率高，防治困难。
黑腐果胶杆菌(Pectobacterium atroseptica，Pa)是马铃薯黑胫病主要病原菌之一，在我国各马铃薯产区均有报道，严重危害马铃薯生产它是一种革兰氏染色阴性致病菌，菌体短杆状，单细胞，极少双连，周生鞭毛，具荚膜，大小1.3～1.9×0.53～0.6(μm)，能发酵葡萄糖产出气体，菌落微凸乳白色，边缘齐整圆形，半透明反光，质粘稠。20世纪50年代，该病菌首先在黑龙江被发现，后逐渐传入马铃薯主产区。现主要分布于西北、东北、华北地区(宁夏、青海、内蒙古、广东、黑龙江)，南方地区如福建也有分布。
目前对马铃薯黑胫病的检测，常用的方法有传统分离培养、免疫学和分子检测等。杨松建立的马铃薯黑胫病荧光定量PCR检测体系，对菌液的检测限为3.6-3.9cfu/μL，检测下线较低。De Boer等开发的黑胫病菌特异性引物ECA1f/ECA2r是马铃薯黑胫病菌PCR检测技术中最常用的，它的特异性好、灵敏度高，达5×102CFU·mL-1。李华伟根据马铃薯黑胫病基因的保守片段设计RPA引物，经筛选得到1对扩增效果好的引物，建立RPA检测体系发现特异性强、灵敏度高，灵敏度为10pg/μL。
环介导等温扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification)即LAMP检测是一种可取代PCR的新型基因扩增技术，其具有简便、快速、准确等突出性优点。赵玉强等针对Aave_4063和Aave_4064序列设计了2对特异性引物，建立了西瓜嗜酸菌的LAMP检测体系，可用于西甜瓜种子的带菌检测；木薯细菌性萎蔫病菌是我国的检疫性有害生物，可随带菌的种茎进行远距离传播，封立平等基于该菌的TAL效应器蛋白质序列，建立LAMP检测技术，用于对进境木薯繁殖材料进行检疫；Okuda等于2005年基于nusG-rpIKAJL-rpoB基因簇建立了黄龙病菌亚洲种的LAMP检测方法；2012年，黄丽等以外膜蛋白基因为靶标，建立并优化了黄龙病菌亚洲种的LAMP检测技术，灵敏度比常规PCR高100倍；2014年，王贤达等针对柑橘黄龙病菌16S rDNA靶序列设计引物，建立了可视化LAMP检测体系。本发明利用实时荧光和可视化方法，构建马铃薯黑胫病快速、准确、特异性强和灵敏度高的LAMP检测体系，并验证体系的准确性，实现马铃薯黑胫病的早期诊断，减少病害的发生，为马铃薯病害及时有效防治提供科学依据。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提出了一种马铃薯黑胫病的LAMP检测引物组合及其可视化检测方法，以解决上述现有技术存在的问题。本发明提供了一种马铃薯黑胫病的LAMP检测引物组合，适用于LAMP可视化快速检测，可用于快速、准确的检测马铃薯黑胫病，且灵敏度高。
为实现上述目的，本发明提供了一种马铃薯黑胫病的LAMP检测引物组合，所述LAMP检测引物组合包括：SEQ ID NO.1所示正向外引物F3、SEQ ID NO.2所示反向外引物B3、SEQ ID NO.3所示正向内引物FIP、SEQ ID NO.4所示反向内引物BIP、SEQ ID NO.5所示正向环引物LF和SEQ ID NO.6所示反向环引物LB。
本发明还提供了一种马铃薯黑胫病的LAMP检测试剂，包括所述的LAMP检测引物组合。
本发明还提供了一种马铃薯黑胫病的LAMP检测试剂盒，包括所述的LAMP检测引物组合。
本发明还提供了一种马铃薯黑胫病的LAMP可视化检测方法，包括采用所述的LAMP检测引物组合、所述的LAMP检测试剂或所述的LAMP检测试剂盒对马铃薯黑胫病进行LAMP检测的步骤。
优选的，具体包括以下步骤：
1)提取待测样本DNA；
2)以步骤1)所述待测样本DNA为模板，采用所述的LAMP检测引物组合进行LAMP扩增反应；
3)步骤2)所述LAMP扩增反应结束后，进行SYBRGreen1显色反应，若呈现黄绿色，则所述待测样本患有马铃薯黑胫病；若呈现橙红色，则所述待测样本未患马铃薯黑胫病。
优选的，在步骤2)中，所述LAMP扩增反应的反应体系为：10×Bst DNA聚合酶反应缓冲液2.5μL、100mM Mg2+1.5μL、10mM dNTP 3.5μL、10μmol/L内引物FIP和BIP各4.0μL、10μmol/L外引物F3和B3各0.5μL、10μmol/L环引物LF和LB各0.5μL、8000U/mLBst2.0 DNA聚合酶1μL、模板DNA 1μL、ddH2O 5.5μL。
优选的，在步骤2)中，所述LAMP扩增反应的反应条件为：65℃，40min。
优选的，在步骤3)中，所述SYBRGreen1显色反应为在扩增结束后，向其产物中加入0.5μL SYBRGreen1试剂。
优选的，所述马铃薯黑胫病病原菌为黑腐果胶杆菌(Pectobacteriumatroseptica)。
本发明还提供了所述的LAMP检测引物组合、所述的LAMP检测试剂或所述的LAMP检测试剂盒在检测黑腐果胶杆菌中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和技术效果：
1、本发明所述的LAMP检测引物组合用于马铃薯黑胫病的现场快速检测，可实现快速便捷的检测大田样品的目的，检测过程时间短，加入指示剂即可用肉眼直接观察反应结果，满足了田间现场检测的适用性；
2、本发明所述的LAMP检测引物组合具有特异性，仅针对于检测鉴定马铃薯黑胫病，针对性检测黑腐果胶杆菌；
3、本发明所述的LAMP可视化检测方法，对反应体系中引物、Mg2+、dNTP、Bst 2.0DNA聚合酶以及是否需要添加甜菜碱进行优化选择，对反应温度和反应时间进行针对性调整，提升了扩增反应的效率，节约了扩增时间；
4、本发明所述的LAMP可视化检测方法，提升了灵敏度，可检测Pa cDNA浓度的检测极限为6.4pg/μL；
5、本发明所述的LAMP可视化检测方法，准确性高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为基因组序列多序列比对分析；
图2为马铃薯黑胫病菌Pa特异性检测；其中，a为S荧光曲线图，1代表阳性对照，2代表阴性对照和空白对照；b为可视化检测结果，1、2和3代表阳性三次重复，4、5和6代表环腐棒状杆菌阴性三次重复，7、8和9代表青枯假单胞菌阴性三次重复，10、11和12代表胡萝卜软腐果胶杆菌阴性三次重复、13、14和15代表山葵果胶杆菌阴性三次重复，16代表ddH2O空白对照；
图3为可视化LAMP检测体系不同引物浓度检测结果；其中，a为内外引物浓度比优化实时荧光LAMP扩增曲线，1代表外内引物的浓度比1:4，2代表外内引物的浓度比1:6，3代表外内引物的浓度比1:8，4代表外内引物的浓度比1:10，5代表外内引物的浓度比1:12，6代表外内引物的浓度比1:14，7和8代表NTC(对照)；c为内外引物浓度比优化可视化检测结果，1代表外内引物的浓度比1:4，2代表外内引物的浓度比1:6，3代表外内引物的浓度比1:8，4代表外内引物的浓度比1:10，5代表外内引物的浓度比1:12，6代表外内引物的浓度比1:14，7和8代表NTC(对照)；b为环形引物浓度优化实时荧光LAMP扩增曲线，1代表环引物浓度0μmol/L，2代表环引物浓度0.2μmol/L，3代表环引物浓度0.4μmol/L，4代表环引物浓度0.6μmol/L，5代表环引物浓度0.8μmol/L，6代表环引物浓度1.0μmol/L，7和8代表NTC(对照)；d为环形引物浓度优化可视化检测结果，1代表环引物浓度0μmol/L，2代表环引物浓度0.2μmol/L，3代表环引物浓度0.4μmol/L，4代表环引物浓度0.6μmol/L，5代表环引物浓度0.8μmol/L，6代表环引物浓度1.0μmol/L，7和8代表NTC(对照)；
图4为LAMP可视化检测体系各主要组分浓度优化检测；其中，a为Mg2+浓度优化，1代表0mmol/L，0min；2代表2mmol/L，0min；3代表4mmol/L，0min；4代表6mmol/L，16min；5代表8mmol/L，19min，6代表10mmol/L，20min；b为dNTP浓度优化，1代表0.8mmol/L，0min(1)；2代表1.0mmol/L，11min；3代表1.2mmol/L，18min；4代表1.4mmol/L，0min；5代表1.6mmol/L，0min；6代表1.8mmol/L，0min；c为Bst 2.0DNA浓度优化，1代表4.8U/mL，14min；2代表6.4U/mL，11min；3代表8.0U/mL，16min；4代表9.6U/mL，18min；5代表11.2U/mL、21min；6代表12.8U/mL，24min；d为甜菜碱浓度优化，1代表0mol/L，8min；2代表0.1mol/L，12min；3代表0.2mol/L，18min；4代表0.3mol/L，22min；5代表0.4mol/L，0min；6代表0.5mol/L，0min；7代表NTC，0min；8代表NRT，0min；
图5为LAMP检测灵敏性分析；其中，a为实时荧光LAMP扩增曲线，b为可视化检测结果，a和b中，1代表DNA浓度为500ng/μL，2代表DNA浓度为100ng/μL，3代表DNA浓度为20ng/μL，4代表DNA浓度为4ng/μL，5代表DNA浓度为0.8ng/μL，6代表DNA浓度为0.16ng/μL，7代表DNA浓度为32pg/μL，8代表DNA浓度为6.4pg/μL，9代表DNA浓度为1.28pg/μL，10代表DNA浓度为ddH2O；
图6为qPCR特异性和灵敏性分析；其中，a为qPCR特异性检测实时荧光LAMP扩增曲线，1代表阳性对照三次重复，2代表阴性对照的阳性材料环腐棒状杆菌、青枯假单胞菌、胡萝卜软腐果胶杆菌和山葵果胶杆菌三次重复，3代表阴性对照和空白对照；b为qPCR灵敏性检测实时荧光LAMP扩增曲线，1代表DNA浓度为500ng/μL，2代表DNA浓度为100ng/μL，3代表DNA浓度为20ng/μL，4代表DNA浓度为4ng/μL，5代表DNA浓度为0.8ng/μL，6代表DNA浓度为0.16ng/μL，7代表DNA浓度为32pg/μL，8代表DNA浓度为6.4pg/μL，9代表DNA浓度为1.28pg/μL，10代表ddH2O。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1
1材料与方法
1.1样品处理
供试菌株在LB培养基上活化后，挑取单菌落接种于LB液体培养基中28℃，150rpm摇培12h。采用细菌基因组DNA快速抽提试剂盒(上海生工生物工程有限公司)提取DNA，用核酸微量检测仪根据260/280和260/230的吸光度比值来判断所获得DNA提取物的质量。
1.2LAMP引物设计与合成
根据GenBank中黑腐果胶杆菌gyrB基因(GenBank登录号JF311591.1)种内保守、种间变异序列，在线PrimerExplorerV5(https://primerexplorer.jp/lamp5.0.0/index.html)进行LAMP引物设计，引物序列(见表1)均由生工生物工程(上海)技术服务有限公司合成。
表1 LAMP引物序列
1.3马铃薯黑胫病菌实时荧光LAMP检测和特异性分析
在25μL反应体系中进行荧光LAMP，包括10×Bst DNA聚合酶反应缓冲液2.5μL、Mg2+1.5μL、dNTP 3.5μL、LAMP引物混合液9μL(其中内引物FIP和BIP 8μL、外引物F3和B31μL)、Bst2.0 DNA聚合酶1μL、模板DNA 1μL、LAMP荧光染料0.5μL、ddH2O 6μL。在ABI 7500实时荧光定量PCR仪上进行RT-LAMP。反应程序为：64℃，15s；65℃，45s；90个循环。在65℃下收集荧光信号。在该反应中，设置了黑腐果胶杆菌(Pa)的阳性对照，环腐棒状杆菌、青枯假单胞菌、胡萝卜软腐果胶杆菌、山葵果胶杆菌的阳性材料为阴性对照。各设3个重复，空白对照为ddH2O。
1.4马铃薯黑胫病菌可视化LAMP检测体系的建立及优化
实时LAMP方法可以直观、实时地检测反应进度，但仍需要实时荧光扩增仪的帮助，不适用于资源缺乏地区的应用和现场快速检测。而基于比色法的LAMP可视化检测可以消除仪器的局限性，只需要水浴即可完成检测。
扩增反应总体积为25μL，包括10×Bst DNA聚合酶反应缓冲液2.5μL、Mg2+1.5μL、dNTP 3.5μL、LAMP引物混合液9μL(其中内引物FIP和BIP 8μL、外引物F3和B31μL)、环引物LF和LB 1μL、Bst2.0 DNA聚合酶1μL、模板DNA 1μL、ddH2O 5.5μL。
在65℃下在PCR仪上进行扩增40min，与荧光LAMP相同，设置3个重复阳性对照、4个阴性对照和1个空白对照。
在可视化LAMP检测中，为了确定Mg2+、dNTP、Bst2.0和甜菜碱的最佳浓度，绘制荧光阈值时间(Tt)与可视化相结合，通过凝胶电泳验证扩增结果。扩增阶段结束后，将所有反应管放在一张黑色吸光布上，用肉眼可以观察到反应管的颜色变化。阳性管的颜色由橙色变成绿色，而阴性管和空白管仍为橙色。
以初反应体系为基础，分别对内外引物浓度比、环引物浓度、Mg2+浓度、dNTP浓度、Bst2.0浓度和甜菜碱浓度进行单因素试验，不同梯度设置如表2所示。
表2 LAMP检测体系各主要组分梯度设置
注：*将外引物(10μmol/L)的添加量固定，外引物与内引物(10μmol/L)初反应浓度比为1:8。
1.5LAMP灵敏度检测
检测灵敏度，将提取的基因组DNA浓度进行五倍稀释，将浓度从500ng/μL稀释到32pg/μL进行灵敏度检测，分析实时荧光和可视化LAMP检测法的灵敏度，并与qPCR灵敏度结果进行比对分析。
1.6马铃薯黑胫病菌qPCR检测
用设计的LAMP外引物建立实时荧光PCR检测体系，并与LAMP检测体系进行特异性和灵敏度比较。
RT-PCR扩增总体系为20μL，包括10μL的2SG Fast Qpcr Master Mix 10μMForward Primer(Sangon Biotech,上海)、0.4μLF3(10μM)、0.4μLB3(10μM)、1μL的TemplateDNA、2μL的DNF Buffer(Optional)和6.2μL的ddH2O。使用ABI 7500实时荧光PCR进行扩增反应，反应程序为95℃，3min；95℃，3s；60℃，30s；72℃，3min，40个循环。特异性实验中，每个反应包括3个阳性对照、4个阴性对照和1个空白对照。
2结果分析
2.1马铃薯黑胫病菌实时荧光LAMP检测和特异性验证
根据Genbank数据库中登陆的gyrB基因序列设计Pa的LAMP引物的特异性引物，利用实时荧光LAMP检测对已提取Pa的DNA和环腐棒状杆菌、青枯假单胞菌、胡萝卜软腐果胶杆菌、山葵果胶杆菌四种病害的DNA(各设3个重复)及ddH2O，检测分析，验证引物的特异性。
结果如图2所示，所有阳性对照均成功扩增并产生S荧光曲线。阳性对照的平均CT值为55.64，扩增反应的荧光值在65min内呈指数线性增加。在扩增90min内，所有阴性和空白对照均未检测到导致假阳性的交叉反应。以上结果表明，本发明利用的用于鉴定马铃薯黑胫病菌Pa的LAMP引物具有特异性。
2.2马铃薯黑胫病菌LAMP可视化检测体系的建立及优化
在确定内外引物浓度的最佳比例时，将外引物浓度固定为10μmol/L，按实时荧光LAMP检测初反应体系，反应结束后在其产物中加入SYBR Green I(10000×)0.5μL观察其颜色变化并拍照。
根据可视化结果和不同荧光信号强度判断可知，不同外内引物浓度比主要影响反应的扩增效率，而可视化检测结果不受影响(如图3中a和c所示)，而当外内引物浓度比为1:8时，实时荧光扩增效率最佳。因此，体系中外内引物最优浓度比为1:8，在所有下一步实验中都使用该浓度比的内外引物。
此外，不同环引物浓度对反应的扩增效率影响较明显(如图3中b和d所示)，由实时荧光LAMP扩增曲线可知(如图3中b所示)，不添加环引物与添加0.4μmol/L的浓度的环引物相比，反应效率有显著差异，随着环引物浓度的增加反应效率有所降低，当引物浓度为0.4μmol/L，扩增反应效率最佳。因此，体系中添加0.4μmol/L浓度的环引物最优。
在可视化LAMP检测中，为了确定Mg2+、dNTP、Bst 2.0和甜菜碱的最佳浓度，绘制荧光阈值时间(Tt)与可视化结果相结合，通过凝胶电泳验证结果。设置Mg2+浓度为0～10mmol/L，从图4中a可见，可视化颜色在2mmol/L、4mmol/L、6mmol/L、8mmol/L中从橙色变成绿色，在4mmol/LMgSO4的浓度下观察到显著的低阈值时间，故Mg2+使用量最佳浓度为4mmol/L。
设置dNTP浓度为0.8～1.8mmol/L，从图4中b可见，可视化颜色在1.2mmol/L、1.4mmol/L、
1.6mmol/L、1.8mmol/L中从橙色变为绿色，在1.6mmol/L dNTP的浓度下观察到显著的低阈值时间，可确定dNTP最佳使用浓度为1.6mmol/L。
设置Bst 2.0浓度为4.8～12.8U/mL，从图4中c可见，可视化颜色在4.8U/mL、6.4U/mL、8.0U/mL、9.6U/mL、12.8U/mL中从橙色变为绿色，在6.4U/mL Bst 2.0浓度下观察到显著的低阈值时间，可确定Bst 2.0最佳浓度为6.4U/mL。
设置甜菜碱浓度为0～0.5mol/L，从图4中d可见，可视化颜色在0.1mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L、0.4mol/L、0.5mol/L中从橙色变为绿色，在0.3mol/L浓度下观察到显著的低阈值时间，故甜菜碱使用量最佳浓度为0.3mol/L。
2.3马铃薯黑胫病菌LAMP检测的灵敏度
通过对Pa基因组DNA进行5倍稀释来评估所建立的LAMP检测方法的检测限度，马铃薯黑胫病菌DNA浓度依次为500ng/μL、100ng/μL、20ng/μL、4ng/μL、0.8ng/μL、0.16ng/μL、32pg/μL、6.4pg/μL、1.28pg/μL；ddH2O为空白对照组。
实时LAMP扩增曲线显示Pa基因组检测限度为6.4pg，对于可视化LAMP，使用所述的反应体系进行灵敏度检测。如图5中b所示，在有模板的反应管中观察到从橙色到黄色的颜色变化，最低检测浓度为6.4pg，与本发明建立的实时LAMP方法的检测限度一致。
2.4LAMP检测与qPCR方法的比较
为了对LAMP检测方法进行全面地评价，以LAMP的外引物作为正、反向引物，通过实时荧光PCR检测其特异性和灵敏度。阳性对照设置3个重复，与LAMP方法相比，荧光定量PCR特异性较差。阳性均出现扩增曲线，空白对照无扩增曲线，但是也有部分阴性对照出现了扩增曲线(如图6中a所示)。
灵敏性检测试验中，图6b中1～9马铃薯黑腐果胶杆菌DNA浓度依次为500ng/μL、100ng/μL、20ng/μL、4ng/μL、0.8ng/μL、0.16ng/μL、32pg/μL、6.4pg/μL、1.28pg/μL，实时荧光PCR最低检测限度为0.16ng/μL(如图6中b所示)，高于LAMP检测体系的6.4pg，LAMP的检测限度普遍高于实时荧光PCR。
在反应时间方面，可视化LAMP方法可以在45min内完成扩增，根据该方法的检测极限6.4pg，在60个周期后基本达到平台期(如图5中a所示)。
实时荧光LAMP可以设置为60个周期，即扩增反应可在1h内完成。实时荧光PCR反应需要变性、退火、延伸三个步骤连续循环。因此实时荧光PCR需要相对较长的时间，需要105min才能完成40个周期的扩增。因此，与实时荧光PCR相比，LAMP可视化检测具有更高的特异性和灵敏度，不需要大型仪器，并且节省了时间，更适合现场快速检测。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种马铃薯黑胫病的LAMP检测引物组合，其特征在于，所述LAMP检测引物组合包括：SEQ ID NO.1所示正向外引物F3、SEQ ID NO.2所示反向外引物B3、SEQ ID NO.3所示正向内引物FIP、SEQ ID NO.4所示反向内引物BIP、SEQ ID NO.5所示正向环引物LF和SEQ ID NO.6所示反向环引物LB。
2.一种马铃薯黑胫病的LAMP检测试剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的LAMP检测引物组合。
3.一种马铃薯黑胫病的LAMP检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的LAMP检测引物组合。
4.一种马铃薯黑胫病的LAMP可视化检测方法，其特征在于，包括采用如权利要求1所述的LAMP检测引物组合、如权利要求2所述的LAMP检测试剂或如权利要求3所述的LAMP检测试剂盒对马铃薯黑胫病进行LAMP检测的步骤。
5.根据权利要求4所述的LAMP可视化检测方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
1)提取待测样本DNA；
2)以步骤1)所述待测样本DNA为模板，采用权利要求1所述的LAMP检测引物组合进行LAMP扩增反应；
3)步骤2)所述LAMP扩增反应结束后，进行SYBRGreen1显色反应，若呈现黄绿色，则所述待测样本患有马铃薯黑胫病；若呈现橙红色，则所述待测样本未患马铃薯黑胫病。
6.根据权利要求5所述的LAMP可视化检测方法，其特征在于，在步骤2)中，所述LAMP扩增反应的反应体系为：10×Bst DNA聚合酶反应缓冲液2.5μL、100mM Mg2+1.5μL、10mM dNTP3.5μL、10μmol/L内引物FIP和BIP各4.0μL、10μmol/L外引物F3和B3各0.5μL、10μmol/L环引物LF和LB各0.5μL、8000U/mLBst2.0 DNA聚合酶1μL、模板DNA 1μL、ddH2O5.5μL。
7.根据权利要求5所述的LAMP可视化检测方法，其特征在于，在步骤2)中，所述LAMP扩增反应的反应条件为：65℃，40min。
8.根据权利要求5所述的LAMP可视化检测方法，其特征在于，在步骤3)中，所述SYBRGreen1显色反应为在扩增结束后，向其产物中加入0.5μL SYBRGreen1试剂。
9.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述马铃薯黑胫病病原菌为黑腐果胶杆菌(Pectobacterium atroseptica)。
10.如权利要求1所述的LAMP检测引物组合、权利要求2所述的LAMP检测试剂或如权利要求3所述的LAMP检测试剂盒在检测黑腐果胶杆菌中的应用。
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