CN107937619A - 一种用于检测猪圆环病毒3型的引物组合物及其应用 - Google Patents

一种用于检测猪圆环病毒3型的引物组合物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种用于检测猪圆环病毒3型的引物组合物及其应用，涉及生物技术领域。用于检测猪圆环病毒3型的引物组合物，包括上游引物和下游引物，所述上游引物的序列如SEQ ID NO:1所示，所述下游引物的序列如SEQ ID NO:2所示。本发明还提供以非诊断为目的的检测猪圆环病毒3型的方法，以待检样品中提取的总DNA为模板，采用权利要求1‑3之一所述引物组合物进行PCR扩增，从而确定待检样品中是否存在猪圆环病毒3型。采用本发明引物组合物及检测方法，能够快速、准确、灵敏的检测出样品中是否存PCV3。

Description

一种用于检测猪圆环病毒3型的引物组合物及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于检测猪圆环病毒3型的引物组合物及其应用。
背景技术
2015年6月，从美国北卡罗来纳州分离出一种新型猪圆环病毒，猪圆环病毒3型(PCV3)。猪圆环病毒3型属于圆环病毒科(Circinoviridae)、圆环病毒属，基因组长度为2000bp；同PCV2一样，PCV3可以引起猪皮炎肾病综合征(porcine dermatitis andnephropathy syndrome,PDNS)以及繁殖障碍(reproductive failure)等。回溯性流行病学调查结果表明，PCV3于2010-2016年间已经在美国猪场普遍存在。2017年，我国学者首次报道从我国的10个省市的样品中检测到PCV3感染，且中国PCV3/CN/Hubei-618/2016、PCV3-China/GD2016毒株与美国PCV3毒株的同源性分别为99.1-99.6％和97.4-98.5％；继而有了从我国部分省市猪场相继检测到PCV3感染的报道，PCV3在我国猪场已普遍存在。现有技术中检测PCV3的方法在准确性、灵敏度方面还不能满足要求。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测猪圆环病毒3型的引物组合物，采用该引物组合物，能够快速、准确、灵敏的检测出样品中是否存PCV3。
本发明的另一目的是提供用于检测猪圆环病毒3型的试剂盒。
本发明的再一目的是提供以非诊断为目的的检测猪圆环病毒3型的方法。
本发明的目的采用如下技术方案实现。
一种用于检测猪圆环病毒3型的引物组合物，包括上游引物和下游引物，所述上游引物的序列如SEQ ID NO:1所示，所述下游引物的序列如SEQ ID NO:2所示。
在本发明中，所述上游引物和下游引物的摩尔浓度之比为1:1。
在本发明中，所述上游引物的浓度为10μmol/L，下游引物的浓度为10μmol/L。
本发明还提供用于检测猪圆环病毒3型的试剂盒，含有所述引物组合物。
本发明还提供以非诊断为目的的检测猪圆环病毒3型的方法，以待检样品中提取的总DNA为模板，采用权利要求1-3之一所述引物组合物进行PCR扩增，从而确定待检样品中是否存在猪圆环病毒3型。
优选的技术方案中，PCR体系中上游引物1.0μL、下游引物1.0μL、模板1.0μL、2×mix 12.5μL、无菌ddH2O 9.5μL。
优选的技术方案中，PCR反应条件为：94℃预变性5min；95℃变性30s、53.6℃退火30s、72℃延伸65s，扩增35个循环；72℃延伸7min。
本发明用于检测猪圆环病毒3型的引物组合物或试剂盒，能够快速、准确、灵敏地检测出样品中是否存在PCV3。本发明以非诊断为目的的检测猪圆环病毒3型的方法，能够快速、准确、灵敏地检测出样品中是否存在PCV3。
附图说明
图1PCV3PCR扩增结果，M.2000bp DNA Marker；1.阴性对照；2.PCV3扩增产物。
图2PCR特异性检测结果，其中M.2000bp DNA Marker；1.PCV3；2.CSFV；3.PRRSV；4.PRV；5.PPV；6.PCV1；7.PCV2；8.阴性对照
图3PCR敏感性检测结果，其中M.2000bp DNA Marker；泳道1-6的PCR产物对应的模板浓度依次为：1×105、1×104、1×103、1×102、1×101、1×100copies/μL；7.阴性对照。
具体实施方式
实施例1采用本发明引物组合物检测PCV3
运用Primer 5.0软件，根据GenBank中已登录的PCV3全基因序列设计一对特异性引物：上游引物PCV3A2F和下游引物PCV3A2R。上游引物PCV3A2F(SEQ ID NO:1)的序列如下：5’-CAGCTGTGGGCCTCCTAATGAAT-3’；下游引物PCV3A2R(SEQ ID NO:2)的序列如下：
5’-CCCCCGTGGCTTGAAATACAG-3’。PCV3A2F和PCV3A2R由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，扩增的目的片段长度为932bp。
用TIANDZ柱式病毒DNAout试剂盒(北京天恩泽公司)，按说明书的方法提取PCV3的DNA。
以PCV3的DNA为模板，以PCV3A2F和PCV3A2R为引物进行PCR扩增。PCR反应体系为25.0μL：10μmol/L的上游引物1.0μL、10μmol/L的下游引物1.0μL、模板DNA1.0μL、2×mix12.5μL、无菌ddH2O 9.5μL。PCR反应条件为：94℃预变性5min；95℃变性30s、53.6℃退火30s、72℃延伸65s，扩增35个循环；72℃延伸7min。同时，以无菌ddH2O作为阴性对照。2×mix、2000bp DNA Marker购自广州东盛生物科技有限公司。取10μL PCR产物，用1％的琼脂糖凝胶进行核酸电泳检测。琼脂糖购自台湾生工生物工程服务有限公司。PCR扩增产物与理论值大小相符(932bp)，阴性对照成立(图1)。将样品的PCR扩增条带经TA克隆后进行测序，并将测序结果与GenBank中登录的PCV3美国毒株SD2016株及中国毒株Hubei-618株基因序列进行比较，结果显示样品的扩增条带为PCV3特异性条带，与美国毒株SD2016株的同源性为99％，与中国Hubei-618株的同源性为99.5％。
实施例2采用本发明引物组合物检测PCV3的特异性
采用上游引物PCV3A2F和下游引物PCV3A2R(序列同实施例1)，分别对下述样品进行检测：PCV3、PCV1、PCV2、猪瘟病毒、猪繁殖性呼吸障碍综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒。以ddH2O为阴性对照，以检测采用本发明引物组合物的PCR方法的特异性。
用TIANDZ柱式病毒DNAout试剂盒(北京天恩泽公司)，按说明书的方法分别提取PCV3、PCV1、PCV2、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖性呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)的DNA。以各病毒的DNA为模板，以PCV3A2F和PCV3A2R为引物进行PCR扩增。PCR体系和反应条件同实施例1。取各病毒的PCR产物，用1％的琼脂糖凝胶进行核酸电泳检测。结果如图2。可以看到采用本发明引物组合物能从PCV3中扩增出932bp的特异性目的片段，而对PCV1、PCV2、猪瘟病毒、猪繁殖性呼吸障碍综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒以及阴性对照均扩增不出目的片段。上述结果说明，采用本发明引物组合物检测PCV3具有较高的特异性。
实施例3采用本发明引物组合物检测PCV3的灵敏度
将实施例1中以PCV3的DNA为模板获得的PCR产物切胶回收，然后进行TA克隆，用胶回收试剂盒纯化扩增出的目的片段，并与pMD19-T Vector连接，转化至大肠杆菌感受态细胞DH5ɑ中，获得携带PCV3目的片段的重组质粒PCV3-TA。提取质粒，测质粒浓度。将重组质粒做10倍梯度连续稀释后，取1μL作为PCR反应模板。PCR反应体系及条件同实施例1。测定最低检出率，判断该PCR方法的敏感性。
取各浓度重组质粒的PCR产物，用1％的琼脂糖凝胶进行核酸电泳检测。由图3可以看出，采用本发明引物组合物可检测到的最低质粒浓度为1copy/μL，具有较高的敏感性。与现已报道的其他PCR方法相比，本发明方法检测出的PCV3阳性条带更清晰，且杂带少，灵敏度显著提高。
另外，申请人还设计了多对用于PCR鉴定PCV3的引物对，例如引物对1(上游引物GCCTTGTTTAGGAGGTTCAC、下游引物AATGGGAAACTGCGATTAGC)、引物对2(上游引物TTATTGCGTTGGGGTGGGGGTATT、下游引物GACGGCGGGAAATCTGACTGAA)等。分别采用上述引物对PCV3进行PCR检测，均扩增不出目的条带或非特异性条带较多。
实施例4采用本发明引物组合物检测PCV3的应用
对2014-2017年来源于不同脏器的1438份临床样品进行回顾性检测，并随机抽取阳性样品的PCR产物进行测序。
具体检测方法：(1)提取各临床样品的DNA：称量25.0mg病料组织，放入破碎管中，并加入1.0mL浓度为0.01mol/L的无菌PBS(pH7.2)及3颗钢珠，在均质破碎仪上破碎2-3次，反复冻融3次，4℃、10000rpm离心2min，收集上清，用TIANDZ柱式病毒DNAout试剂盒，按说明书的方法提取样品DNA模板。(2)以各样品的DNA为模板，使用本发明引物组合物进行PCR检测，具体方法同实施例1。
1.临床样品PCV3阳性检出率
在938份临床发病猪样品中，检出PCV3阳性样品65份，阳性检出率为6.93％；500份健康猪样品仅检出3份PCV3阳性，阳性检出率为0.6％，临床发病猪样品中PCV3的检出率明显高于健康猪(表1)。表明PCV3可能与这些疫病的发生有一定的关系。
表1临床样品PCV3阳性检出率
2.不同年份猪临床样品的PCV3阳性检测率
对我国江苏省2014-2017年的病猪及健康猪样品进行了回顾性检测。
在938份病猪临床样品中，2014年的PCV3阳性检出率为1.92％，2015年为3.08％，2016年为5.26％，2017年为12.67％(表2)。
表2 2014-2017年病猪临床样品PCV3检测统计表
结果表明，最近4年，PCV3在病猪中的阳性检出率成倍增长，从2014年起的1.92％一路逐年递增，已飙升至2017年的12.67％，流行趋势不容忽视，且近2年的增长加速度明显快于前2年。
3.不同年份PCV3猪场阳性检出率
在样品来源的267个猪场中，检出PCV3阳性猪场35个，猪场阳性率为13.11％。2014年和2015年猪场阳性率较低，2016年升高到12.09％，2017年达到25.00％(表3)。
表3 2014-2017年猪场PCV3阳性统计表
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏省农业科学院
<120> 一种用于检测猪圆环病毒3型的引物组合物及其应用
<130> 20171228
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 上游引物
<400> 1
cagctgtggg cctcctaatg aat 23
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 下游引物
<400> 2
cccccgtggc ttgaaataca g 21

Claims (7)

1.一种用于检测猪圆环病毒3型的引物组合物，包括上游引物和下游引物，所述上游引物的序列如SEQ ID NO:1所示，所述下游引物的序列如SEQ ID NO:2所示。
2.根据权利要求1所述用于检测猪圆环病毒3型的引物组合物，其特征在于所述上游引物和下游引物的摩尔浓度之比为1:1。
3.根据权利要求1或2所述用于检测猪圆环病毒3型的引物组合物，其特征在于所述上游引物的浓度为10 µmol/L，下游引物的浓度为10 µmol/L。
4.用于检测猪圆环病毒3型的试剂盒，其特征在于含有权利要求1-3之一所述引物组合物。
5.以非诊断为目的的检测猪圆环病毒3型的方法，其特征在于以待检样品中提取的总DNA为模板，采用权利要求1-3之一所述引物组合物进行PCR扩增，从而确定待检样品中是否存在猪圆环病毒3型。
6.根据权利要求5所述以非诊断为目的的检测猪圆环病毒3型的方法，其特征在于PCR体系中上游引物1.0μL、下游引物1.0μL、模板1.0μL、2×mix 12.5μL、无菌ddH2O 9.5μL。
7.根据权利要求6所述以非诊断为目的的检测猪圆环病毒3型的方法，其特征在于PCR反应条件为：94℃预变性5min；95℃变性30s、53.6℃退火30s、72℃延伸65s，扩增35个循环；72℃延伸7min。
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