CN107012259A - 一种检测鉴定猪圆环病毒3型的pcr引物及检测方法与检测试剂盒 - Google Patents

一种检测鉴定猪圆环病毒3型的pcr引物及检测方法与检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测鉴定猪圆环病毒3型（PCV3）的PCR引物及检测方法与检测试剂盒。本发明通过参考比对猪圆环病毒3型的基因组序列，根据猪圆环病毒3型cap蛋白上的保守序列，设计了一对检测猪圆环病毒3型的PCR引物，所述PCR上下游所述引物PCV3‑F/R的序列依次如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.2所示；并提供了一种猪圆环病毒3型PCR检测方法及试剂盒。本发明的引物和检测方法能快速、方便、高效地检测鉴定猪圆环病毒3型，特异性好，灵敏度高且检测方法操作简便高效，便于临床检测和方便开展流行病学调查，具有较大的应用前景。

Description

一种检测鉴定猪圆环病毒3型的PCR引物及检测方法与检测试 剂盒
技术领域
本发明属于动物疾病卫生检验技术领域，具体地，涉及一种检测鉴定猪圆环病毒3型的PCR引物及检测方法与检测试剂盒。
背景技术
猪圆环病毒属于圆环病毒科，是猪病原体中最小的一种病毒。目前已知有两种圆环病毒能够感染猪，包括：猪圆环病毒1型和猪圆环病毒2型。其中，猪圆环病毒2型（PCV2）感染能导致各种临床疾病，从而导致世界猪肉业巨大的经济损失，而相反，猪圆环病毒1型（PCV1）则不致病。猪圆环病毒感染后的潜伏期均较长，即使是胚胎期或出生后早期感染，也多在断奶后陆续出现临诊症状。研究发现，PCV2可引起以下疾病，包括猪断奶后多系统衰弱综合征（PMWS），皮炎与肾病综合征（DNS），仔猪先天性震颤（CT），增生性坏死性间质性肺炎以及繁殖障碍等。
2015年，Phan，Palinski等通过宏基因组测序在美国检测到一种新的猪圆环病毒：猪圆环病毒3型（PCV3）。感染这种病毒的猪常伴有猪皮炎肾病综合征，生殖衰竭，心脏和多系统炎症等症状。而目前，我国尚未有相关PCV3研究进展的报道，也未曾有检测鉴定猪圆环病毒3型的方法或试剂盒。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有猪圆环病毒3型检测鉴定方面存的缺陷和不足，通过参考比对猪圆环病毒3型的基因组序列，选择保守的核甘酸序列作为扩增区域，设计了一对检测猪圆环病毒3型的PCR|引物，所述引物能快速、方便、高效地检测鉴定猪圆环病毒3型，特异性好，灵敏度高。
本发明的目的是提供一种鉴定检测猪圆环病毒3型的PCR引物。
本发明另一目的是提供利用上述PCR引物来检测鉴定猪圆环病毒3型的方法。
本发明的再一目的是提供一种检测鉴定猪圆环病毒3型的试剂盒。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
一对检测鉴定猪圆环病毒3型的PCR引物，所述PCR上下游引物PCV3-F/R的序列依次如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.2所示：
上游引物PCV3-F：5’-GGGCACACAGCCATAGAT-3’（SEQ ID NO.1）；
下游引物PCV3-R：5’-TTCCGGGACATAAATGCT-3’（SEQ ID NO.2）。
本发明发现猪圆环病毒3型编码两个主要的开放阅读框：rep和cap，两者处在DNA链上相反的方向。通过参考与比对GenBank中所有PCV3 cap基因序列，选择保守的核甘酸序列作为扩增区域，设计了一对检测猪圆环病毒3型的PCR引物，通过对该引物的特异性、敏感性和重复性进行试验，证实此引物能用于快速、方便、高效地检测猪圆环病毒3型，且特异性好，灵敏度高。
所述引物PCR引物可用于检测和/或鉴定猪病样组织中是否含有猪圆环病毒3型；或用于检测和/或鉴定猪圆环病毒3型。
一种利用上述PCR引物检测鉴定猪圆环病毒3型的方法，包括如下步骤：
S1.提取待测样品DNA；
S2.以步骤S1所述DNA为模板，以权利要求1所述引物进行PCR反应；
S3.将扩增产物电泳检测，根据电泳结果判断待测样品中是否含有猪圆环病毒3型；
优选地，所述PCR的反应体系为：2×Taq Master Mix 10µL，DNA模板2µL，10µmol/LPCV3-F 1µL，10µmol/L PCV3-R 1µL，ddH2O加至20.0µL。
更优选地，所述2×Taq Master Mix 所含成分浓度为：Taq DNA Polymerase(recombinant) 0.05 units/µL，MgCl2 4mM，dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 0.4mM。
优选地，所述PCR反应程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30s，49℃退火30s，72℃延伸30s，共33个循环；72℃终延伸10 min。
优选地，所述电泳检测为取8μL PCR扩增产物，加入含溴化乙锭的1%琼脂糖凝胶中进行电泳，条件为130V，25min。
优选地，所述结果判断的标准为：当PCR产物在267 bp处有明显发亮条带，且阴性对照无条带，则表明待测样品中含有猪圆环病毒3型。
上述检测方法在检测和/或鉴定猪病样组织中是否含有猪圆环病毒3型方面的应用；或在检测和/或鉴定猪圆环病毒3型方面的应用均在本发明保护范围内。
同时，本发明还提供一种检测鉴定猪圆环病毒3型的试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1所述PCR引物。
优选地，所述试剂盒还包含待测样品DNA提取所需试剂与PCR扩增所需试剂。
更优选地，所述试剂包括PCR缓冲液，Taq DNA Polymerase (recombinant)，MgCl2，dNTPs (dATP，dCTP，dGTP，dTTP)，ddH2O。
优选地，所述试剂盒中还包含猪圆环病毒3型的核酸模板，即阳性对照。
优选地，所述试剂盒还包括阴性对照；所述阴性对照为除去猪圆环病毒3型之外的其他种类的猪病毒的DNA或cDNA。
更优选地，所述阴性对照为猪流行性腹泻病毒，猪塞内加谷病毒，口蹄疫病毒，猪德尔塔冠状病毒，猪库布病毒，猪博卡病毒或猪萨佩罗病毒中的一种或多种的DNA或cDNA。
作为一种可选择的实施方式，所述检测试剂盒的使用方法具体如下：
（1）用DNA抽提试剂对待测样品进行DNA抽提；
（2）以步骤（1）的DNA为模板，以本发明所提供的猪圆环病毒3型PCR引物进行扩增，所述PCR扩增引物为：
上游引物PCV3-F：5’-GGGCACACAGCCATAGAT-3’
下游引物PCV3-R：5’-TTCCGGGACATAAATGCT-3’
所述PCR扩增反应体系为：扩增反应的总体积为20.0µL，其各种成分分别为：2×TaqMaster Mix 10µL，DNA模板2µL，10µmol/L PCV3-F 1µL，10µmol/L PCV3-R 1µL，ddH2O加至20.0µL。
所述PCR扩增反应过程为：94℃预变性5 min；94℃变性30s，49℃退火30s，72℃延伸30s，共33个循环；72℃终延伸10 min。
（3）扩增产物的鉴定：取8μL PCR扩增产物，加入含溴化乙锭的1%琼脂糖凝胶中进行电泳，条件为130V，25min。。紫外灯下观察PCR产物，若PCR产物在267 bp处有明显发亮条带且阴性对照无条带，则显示为对猪圆环病毒3型呈阳性反应，即待测样品中含有猪圆环病毒3型。
本发明所提供的猪圆环病毒3型的检测方法操作简便高效、PCR引物特异性高，便于临床检测和方便开展流行病学调查。所开展的收集广东地区26份疑似仔猪CT病料，进行检测后发现其中2份为阳性，表明该毒在我国广东地区已有所传播。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供的猪圆环病毒3型检测引物及方法，操作简便、高效、PCR扩增特异性好、灵敏度好，应用于猪圆环病毒3型的PCR检测中的最低检测浓度限值可达到11.958 ng/µL，便于临床检测和方便开展流行病学调查，具有较大的应用前景。
附图说明
图1为猪圆环病毒3型 PCR电泳结果图，泳道从左到右分别为M：2000 DL DNAMarker；1：猪圆环病毒3型阳性样品，2：空白对照。
图2为猪圆环病毒3型特异性检测电泳结果图，泳道从左到右分别为M：2000 DLDNA Marker；1：猪圆环病毒3型；2：猪水泡病毒，3：口蹄疫病毒；4：猪流行性腹泻病毒；5：猪塞内加谷病毒；6：猪德尔塔冠状病毒；7：猪库布病毒；8：猪博卡病毒；9：猪萨佩罗病毒。
图3为猪圆环病毒3型敏感性检测电泳结果图，泳道从左到右分别为M：2000 DLDNA Marker；1～7代表10-1至10-7的模板稀释度。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施实例1 猪圆环病毒3型PCR引物的设计
1、本发明发现猪圆环病毒3型编码两个主要的开放阅读框：rep和cap，两者处在DNA链上相反的方向。通过参考与比对GenBank中所有PCV3 cap基因序列，选择保守的核甘酸序列作为扩增区域，设计了一对检测猪圆环病毒3型的PCR引物；所述PCR引物如下所示：
上游引物PCV3-F：5’-GGGCACACAGCCATAGAT-3’；
下游引物PCV3-R：5’-TTCCGGGACATAAATGCT-3’。
2、经过验证，以猪圆环病毒3型的DNA为模板进行扩增，结果显示，该引物组能够特异性的扩增检测猪圆环病毒3型。
实施例2 PCR引物检测猪圆环病毒3型样本
1、DNA抽提
（1）取猪病料组织30mg，将组织尽量剪碎，分别装入1.5ml 的离心管中。
（2）每管中加入450µL的裂解缓冲液(10mM Tris-HCl pH8.0; 100mM EDTA,pH8.0)。
（3）每管加入10% SDS 50～100µL ,再加入2.5～5µL蛋白酶K (20mg/ml),使其终浓度达100 µg/mL，混匀，55℃ 3h至过夜（期间将管子颠倒几次）。
（4）样品中加入150µL NaCl，室温8000rpm离心20min，去沉淀，然后在上清液中加入等体积（500µL）预冷异丙醇，混匀，20℃处理30min，14000rpm离心10min，去上清液。沉淀加70%ALC洗涤离心去ALC，室温挥发ALC 5～10min，加TE 500µL，加10µL RNAase (终浓度4mg/µL)，即2.5µL。37℃ 30min 或65℃ 15min。
（5）加等体积酸液（提取DNA中的蛋白质）缓慢来回颠倒离心管10min，13000～15000rpm离心10min。用移液管小心取出上层相至另外干净的离心管中，不要触到两相之间的白色蛋白层（可视情况重复操作）。
（6）加入等体积酚：氯仿(1:1)，轻摇，缓慢颠倒混匀10min 13000～15000rpm 离心5-10分钟，取上层清液于干净离心管中。
（7）加入等体积氯仿（氯仿：异戊醇=24:1），轻摇，缓慢颠倒混匀10min， 13000～15000rpm离心5～10 min。取上清液加入1/10体积2M NaCl和等体积-20℃保存的无水乙醇沉淀DNA 10min，13000rpm离心5min，去上清。
（8）加入100～150 µL70%ALC，离心，小心倒掉ALC，用70%ALC再洗一次，然后去ALC。45℃烘箱烘干15～30min，用双蒸水沿管壁沿四周冲洗（TE量视DNA沉淀量而定，在80～250µL之间），溶解，-20℃保存备用。
2、使用本发明所提供猪圆环病毒3型的PCR扩增引物进行扩增：
上游引物PCV3-F：5’-GGGCACACAGCCATAGAT-3’，
下游引物PCV3-R：5’-TTCCGGGACATAAATGCT-3’；
扩增反应体系为：扩增反应的总体积为20.0µL，其各种成分分别为：2×Taq MasterMix 10µL，DNA模板2µL，10µmol/L上游引物PCV3-F 1µL，10µmol/L下游引物PCV3-R1µL；ddH2O加至20.0µL。
PCR反应过程为：94℃预变性5 min；94℃变性30s，49℃退火30s，72℃延伸30s，共33个循环；72℃延伸10 min，4℃下保存。
其中所提供的2×Taq Master Mix 所含成分浓度为：
Taq DNA Polymerase (recombinant)：0.05 units/µL；
MgCl2：4mM；
dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)：0.4mM。
3、扩增产物的鉴定：取8μL PCR扩增产物，加入含溴化乙锭的1%琼脂糖凝胶中进行电泳，条件为130V，25min。紫外灯下观察PCR产物在267 bp处有明显发亮条带，且阴性对照无条带，则显示为对猪圆环病毒3型呈阳性反应。
4、回收阳性条带后将样品送至基因测序公司进行产物基因测序，根据测序反馈结果与NCBI上的序列进行BLAST分析比对，确定样品中含猪圆环病毒3型。
实施实例3 猪圆环病毒3型PCR引物的特异性检测
参考实施实例2中步骤1至步骤3，利用实施例1所述PCR引物对猪圆环病毒3型、口蹄疫病毒、猪流行性腹泻病毒、猪塞内加谷病毒、猪德尔塔冠状病毒、猪库布病毒、猪博卡病毒和猪萨佩罗病毒分别进行PCR检测。所述病毒毒株均由广东温氏集团惠赠。
电泳结果如图2所示，本发明的PCR引物对猪圆环病毒3型呈阳性反应，而对猪水泡病毒、口蹄疫病毒、猪流行性腹泻病毒、猪塞内加谷病毒、猪德尔塔冠状病毒、猪库布病毒、猪博卡病毒和猪萨佩罗病毒呈阴性反应，说明该引物对猪圆环病毒3型有着较强的特异性。
实施实例4 猪圆环病毒3型的敏感性试验
参考实施实例2中步骤1抽提猪圆环病毒3型DNA后，用ddH2O将样品DNA模板按照10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7稀释浓度进行稀释，按照实施例2步骤2进行PCR检测。
电泳结果图3所示，本发明的PCR引物在10-4的模板稀释度上仍然呈阳性反应，表明其敏感性较高。同时，本发明引物最低检测模板浓度为11.958 ng/µL。
实施实例5 猪圆环病毒3型PCR引物及检测方法的应用
本实例收集了来自广东省7个猪场共26份疑似病猪样品，采用实施实例2的方法进行猪圆环病毒3型PCR检测。
采用实施实例2的扩增方法，试验结果表明，26份样品中有2份呈阳性反应，说明我国国内已发现疑似猪圆环病毒3型疑似感染病例，该毒在我国广东地区已有所传播，这以便于进一步开展后续研究工作。

Claims (10)

1.一对检测鉴定猪圆环病毒3型的PCR引物，其特征在于，PCR上下游引物PCV3-F/R的序列依次如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.2所示。
2.一种利用权利要求1所述PCR引物检测鉴定猪圆环病毒3型的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.提取待测样品DNA；
S2.以步骤S1所述DNA为模板，以权利要求1所述引物进行PCR反应；
S3.将扩增产物电泳检测，根据电泳结果判断待测样品中是否含有猪圆环病毒3型。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述PCR的反应体系为：2×Taq MasterMix 10µL，DNA模板2µL，10µmol/L PCV3-F 1µL，10µmol/L PCV3-R 1µL，ddH2O加至20.0µL。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述PCR反应程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30s，49℃退火30s，72℃延伸30s，共33个循环；72℃终延伸10 min。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，结果判断标准为：当PCR产物在267 bp处有明显发亮条带，且阴性对照无条带，则表明待测样品中含有猪圆环病毒3型。
6.权利要求2～5任一所述方法在检测和/或鉴定猪圆环病毒3型，或检测和/或鉴定猪病样组织中是否含有猪圆环病毒3型方面的应用。
7.权利要求2～5任一所述的方法在制备检测和/或鉴定猪圆环病毒3型的试剂盒方面的应用。
8.一种检测鉴定猪圆环病毒3型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述PCR引物。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含待测样品DNA提取所需试剂与PCR扩增所需试剂。
10.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性对照；所述阴性对照为猪流行性腹泻病毒，猪塞内加谷病毒，口蹄疫病毒，猪德尔塔冠状病毒，猪库布病毒，猪博卡病毒或猪萨佩罗病毒中的一种或多种的DNA或cDNA。
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