CN107475422A - 用于肺炎致病菌耐药基因快速检测的试剂盒 - Google Patents

用于肺炎致病菌耐药基因快速检测的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本申请涉及用于肺炎致病菌耐药基因快速检测的试剂盒，其包括能检测24个肺炎致病菌主要耐药基因的基因芯片和用于多重不对称PCR反应的反应体系。24个耐药基因来自氨基糖苷类、喹诺酮类、超广谱β内酰胺酶类(ESBLs)、头孢菌素类(AmpC)、碳青霉烯类、耐万古霉素、耐甲氧西林和导致膜通透性改变的耐药基因。该试剂盒可直接检测临床标本中肺炎致病菌的耐药基因，操作简单快捷，无需培养和药敏试验，在很大程度上为抗生素的合理使用争取了宝贵的时间，值得临床推广应用。

Description

用于肺炎致病菌耐药基因快速检测的试剂盒
技术领域
本发明涉及基因芯片技术，尤其涉及用于肺炎致病菌耐药基因快速检测的试剂盒。
背景技术
近年来，由于空气污染的加剧及公共卫生事件的发生，呼吸道疾病引起越来越多的关注。肺炎是指包括终末气道，肺泡和肺间质等在内的肺实质性炎症，是全球感染性疾病死亡的首要原因[1]。据世界卫生组织(WHO)统计，每年约有350万人死于下呼吸道感染，居所有死亡原因的第三位[2]。在美国,肺炎和流行性感冒位于所有死因的第九位，2010年和2011均有5万多人死于肺炎[3-5]，而且该统计没有将肺炎导致的败血症以及死于肺炎并发症的癌症、帕金森等病例纳入肺炎组，所以实际因肺炎死亡的人数比这个数还要高[2]。在我国，每年至少有250万人罹患肺炎，农村多于城市，其中5岁以下儿童肺炎死亡率为184/10万—1223万/10万[6]，老年肺炎病死率没有确切的数据，但据黄华瑞报道[7]老年肺炎明显高于其他年龄段。可见，肺炎严重威胁着人类的生命健康。
肺炎的致病原有很多，包括细菌、病毒、真菌、寄生虫等，其中最重要最常见的是细菌。众所周知，肺炎按照发病环境可分为社区获得性肺炎(CAP)和医院获得性肺炎(HAP)。大部分CAP患者只需要门诊就诊，但仍有大约20％的患者仍需住院治疗[8]。CAP致病菌以革兰氏阳性菌为主，其中又以肺炎链球菌为第一位，占35-80％，其次为流感嗜血杆菌，嗜肺军团菌，肺炎支原体，肺炎衣原体，金黄色葡萄球菌等[9]。HAP致病菌比较广泛，以革兰氏阴性菌为主，其中常见的是铜绿假单胞菌，大肠埃希菌，肺炎克雷伯菌，鲍曼不动杆菌，其它还有嗜麦芽窄食单胞菌，洋葱伯克霍尔德菌，粪肠球菌，屎肠球菌，阴沟肠杆菌等，此外革兰氏阳性菌金葡菌也见于HAP，尤其是耐甲氧西林金葡菌(MRSA)[10]。抗生素是治疗细菌性肺炎的最有效的方法。1941年青霉素的发现使感染性疾病得到了有效的控制，随后新的抗生素不断被发现和生产，并应用到很多领域，包括养殖业[11]和种植业[12]，人类迅速的进入了抗生素的黄金时代。随着抗生素广泛的应用，耐药菌株却不断涌现，并且不再局限于对一种抗生素耐药，而是可以同时抵抗多种抗生素，如一些临床菌株屎肠球菌、金葡菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌以及肠杆菌对大多数的抗生素均耐药[12]。多重耐药菌株和泛耐药菌株等超级耐药菌株，如耐青霉素的肺炎链球菌(PRSP)[13]，MRSA[14],耐万古霉素的肠球菌(VRE)[15]等的爆发流行，曾引起全世界的恐慌，耐药问题几乎陷入了失控状态[12]。抗生素治疗失败使感染患者病死率大幅增加，尤其病重的患者。据美国疾病控制和预防中心(CDC)分析每年有200万患者感染耐药菌，其中23000例患者因此死亡[16]。2008年，美国350亿美元医疗成本中有200亿美元用于控制和治疗细菌耐药而引起的感染[16]。因此，尽快明确致病菌的耐药特性，采用针对性的治疗措施，是降低肺炎病死率和死亡率的关键。
细菌耐药性问题伴随着抗生素的发现而产生，从单一耐药到多重耐药、多药耐药和泛耐药，有效的抗菌素越来越有限和昂贵。2014年5月WHO公布一项全球抗击耐药计划，同年6月英国政府预算1000万英镑欲解决细菌耐药性难题，9月美国政府要求相关部门制定出针对细菌耐药威胁的具体措施[12]，2015年3月一项为期5年的抗细菌耐药行动计划出台，并在2016年的财政预算中拨款12亿美元用于应对细菌耐药，可见细菌耐药问题是全球亟待解决的难题。
明确肺炎致病菌的种类及其耐药特性是肺炎早诊断、及时采取有效治疗措施、减少肺炎病死率的重要环节。检测耐药特性的药敏试验包括纸片扩散法(K-B法)、琼脂或肉汤稀释法、抗生素浓度梯度法(E-test法)，其中常用的金典方法是K-B法。K-B法需要培养和分离，大约48-72小时，而且影响因素多，如菌液的浓度、细菌接种量、培养基，药片的大小等[18]。药敏试验也有自动化的操作系统，是采用的一种不连续的稀释方法，减轻了操作者的负担，但自动化药敏分析系统不能灵活的选择抗生素的种类，仍然不能完全取代K-B法。美国传染病学会(IDSA)指南曾建议要在8小时内给予肺部感染患者抗生素治疗，而这一时间在2003年缩短到4小时[19,20]，可见，目前药敏试验不能达到临床快速诊断，及时采取针对性治疗措施的需求，肺炎早期的治疗只能依靠经验性治疗，这样又进一步加剧了耐药菌株的产生，因此，临床急需一种准确、快速检测肺炎致病菌的耐药特性的方法。
发明内容
鉴于上述问题，本发明旨在提出一种能够快速、准确地检测肺炎致病菌的耐药性的试剂盒。
本发明的用于肺炎致病菌耐药基因快速检测的试剂盒，其包括基因芯片和用于多重不对称PCR反应的反应体系；
所述基因芯片包括对应于肺炎致病菌耐药基因的探针；
其中，所述肺炎致病菌耐药基因至少包括金属β内酰胺类耐药基因，所述金属β内酰胺类耐药基因包括NDM1、IMP、VIM中的至少一种；
其中，对应于NDM1的探针的序列为：
ATGGAAACTGGCGACCAACGGTTTGGCGATCTTTTTTTTTTTT；
对应于IMP的探针的序列为：
AGATAACGTAGTGGTTTGGTTTTTTTTTTTT；
对应于VIM的探针的序列为：
TCTAGAAGGACTCTCATCGATTTTTTTTTTTT；
所述肺炎致病菌耐药基因还包括碳青霉烯类耐药基因，所述碳青霉烯类耐药基因包括OXA2、OXA10、OXA23、OXA48、KPC中的至少一种；
其中，对应于OXA2的探针的序列为：
TTGCAGGCCACAATCAAGACCAAGATTTTTTTTTTTTT；
对应于OXA10的探针的序列为：
TCAAATGGGACGGAAAGCCAAGAGCCATGAATTTTTTTTTTTT；
对应于OXA23的探针的序列为：
GAGAGTAATGGCTACAAAATTTTTTTTTTTTTTT；
对应于OXA48的探针的序列为：
AGTTTCTGGCTCGACGGTGGTATTCTTTTTTTTTTTT；
对应于KPC的探针的序列为：
TGACGGCCTTCATGCGCTCTATCGGCGATACTTTTTTTTTTTT；
所述肺炎致病菌耐药基因还包括氨基糖苷类耐药基因，所述氨基糖苷类耐药基因包括aac(3)-II、aac(6')-I、ant(2")-I、ant(3")-I中的至少一种；
其中，对应于aac(3)-II的探针的序列为：
GTGGGTTCGGCCTGCTGAATCAATTTCTGGTTTTTTTTTTTT；
对应于aac(6')-I的探针的序列为：
AGGTCACCAAGATCCAAACGGACTTTTTTTTTTTT；
对应于ant(2")-I的探针的序列为：
CACGCAAGCACGATGATATTGATCTGACGTTTTTTTTTTTT；
对应于ant(3")-I的探针的序列为：
TCTCCGCGCTGTAGAAGTCACCATTGTTTTTTTTTTTTTT；
所述肺炎致病菌耐药基因还包括喹诺酮类耐药基因，喹诺酮类耐药基因包括qnrA、qnrB、qnrS中的至少一种；
其中，对应于qnrA的探针的序列为：
ATGTACTTCTGCTCGGCTTATATCTCAGGTTTTTTTTTTTTT；
对应于qnrB的探针的序列为：
GTAGCGCATATATCACGAATACCAATCTAAGCTACGCCTTTTTTTTTTTT；
对应于qnrS的探针的序列为：
TCGCTGGATAGGAACGAACCTAGCTTTTTTTTTTTT；
所述肺炎致病菌耐药基因还包括ESBLs类耐药基因，所述ESBLs类耐药基因包括CTX-M-14、CTX-M-15、SHV、TEM中的至少一种；
其中，对应于CTX-M-14的探针的序列为：
CAGCCTGTCGAGATCAAGCCTGTTTTTTTTTTTT；
对应于CTX-M-15的探针的序列为：
AGACTGGGTGTGGCATTGATTATTTTTTTTTTTT；
对应于SHV的探针的序列为：
CTCCAGCTGTTCGTCACCGGCATTTTTTTTTTTT；
对应于TEM的探针的序列为：
GTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACTTTTTTTTTTTT；
所述肺炎致病菌耐药基因还包括头孢菌素类耐药基因，所述头孢菌素类耐药基因为DHA；
其中，对应于DHA的探针的序列为：
GCTTGATGCGGAATCTTACGGTTTTTTTTTTTT；
所述肺炎致病菌耐药基因还包括耐万古霉素类耐药基因，所述耐万古霉素类耐药基因包括vanA、vanB中的至少一种；
其中，对应于vanA的探针的序列为：
CCGCATTGTACTGAACGAAGTCTTTTTTTTTTTT；
对应于vanB的探针的序列为：
GCTTACCTACCCTGTCTTTGTGATTTTTTTTTTTT；
所述肺炎致病菌耐药基因还包括耐甲氧西林类耐药基因，所述耐甲氧西林类耐药基因为mecA；
其中，对应于mecA的探针的序列为：
GTAAGCACACCTTCATATGACGTCTATCCTTTTTTTTTTTT；
所述肺炎致病菌耐药基因还包括膜孔蛋白类耐药基因，所述膜孔蛋白类耐药基因为oprD2；
其中对应于oprD2的探针的序列为：
TGTTCCCGCAGACCGCGATTTTTTTTTTTT；
其中，所述用于多重不对称PCR反应的反应体系包括：
对应于NDM1的正向引物序列NDM1-F为：GCATTAGCCGCTGCATTGAT，反向引物序列NDM1-R为：CGGCATGTCGAGATAGGAAGT；
对应于IMP的正向引物序列IMP-F为：CCACGTATGCATCTGAAT，反向引物序列IMP-R：ACTTTGGCCAAGCTTCTA；
对应于VIM的正向引物序列VIM-F为：CAGTCTCCACGCACTTTCA，反向引物序列VIM-R为：GCAGCACCAGGATAGAAGA；
对应于OXA2的正向引物序列OXA2-F为：CGCTGTTCGTGATGAGTTC，反向引物序列OXA2-R为：GCTGCCTTCTATCCAGTAATC；
对应于OXA10的正向引物序列OXA10-F为：TCAATGGTGTCTTCGTGCT，反向引物序列OXA10-R为：CTTACTTCGCCAACTTCTCTG；
对应于OXA23的正向引物序列OXA23-F为：CAGTCTATCAGGAACTTGCG，反向引物序列OXA23-R为：CATTGCCCAACCAGTCTT；
对应于OXA48的正向引物序列OXA48-F为：TAAGTGGGATGGACAGACG，反向引物序列OXA48-R为：TTGACAATACGCTGGCTG；
对应于KPC的正向引物序列KPC-F为：GGCCGCCGTGCAATACAGTGATAAC，反向引物序列KPC-R为：CCTGGGATGGCGGAGTTCAGCT；
对应于aac(3)-II的正向引物序列aac(3)-II-F为：GCTCGGTTGGATGACAAA，反向引物序列aac(3)-II-R为：TGCGGTAACGGAGTTTAG；
对应于aac(6')-I的正向引物序列aac(6')-I-F为：TATGAGTGGCTAAATCGA，反向引物序列aac(6')-I-R为：CCCGCTTTCTCGTAGCA；
对应于ant(2")-I的正向引物序列ant(2")-I-F为：CACAACGCAGGTCACATT，反向引物序列ant(2")-I-R为：TCGCAGTCAAGTAACTCATCC；
对应于ant(3")-I的正向引物序列ant(3")-I-F为：GGTGACCGTAAGGCTTGAT，反向引物序列ant(3")-I-R为：GGCAACGCTATGTTCTCTTG；
对应于qnrA的正向引物序列qnrA-F为：TCACTTCAGCTATGCCGAT，反向序列qnrA-R为：ATCTGAGCCCATCAAGGAA；
对应于qnrB的正向引物序列qnrB-F为：GTGCGATGCTGAAAGATG，反向序列qnrB-R为：TGTGAAGTTTGCTGCTCG；
对应于qnrS的正向引物序列qnrS-F为：TAGAGTTCCGTGCGTGTGA，反向序列qnrS-R为：AGTTCGGCGTGGCATAAA；
对应于CTX-M-14的正向引物序列CTX-M-14-F为：GCTTTCCAATGTGCAGTACCAG，反向引物序列CTX-M-14-R为：ACCGAGCTGGGCAATCAAT；
对应于CTX-M-15的正向引物序列CTX-M-15-F为：ACGCTGTTGTTAGGAAGTGTG，反向引物序列CTX-M-15-R为：ACAGATTCGGTTCGCTTTCAC；
对应于SHV的正向引物序列SHV-F为：CTGGCGATAGTGGATCTT，反向引物序列SHV-R为：CGCGTAGGCATGATAGAA；
对应于TEM的正向引物序列TEM-F为：TCTTACGGATGGCATGACAG，反向引物序列TEM-R为：CTCGTCGTTTGGTATGGCTT；
对应于DHA的正向引物序列DHA-F为：TTATCTCACACCTTTATTACTG，反向引物序列DHA-R为：TATCTTTTGAGGCGGATT；
对应于vanA的正向引物序列vanA-F为：AGCGAGGACGGATACAGGAA，反向引物序列vanA-R为：GGTCAATCAGTTCGGGAAGT；
对应于vanB的正向引物序列vanB-F为：ACAAATCACTGGCCTACATTC，反向引物序列vanB-R为：CGCCGACAATCAAATCATC；
对应于mecA的正向引物序列mecA-F为：TGGCTATCGTGTCACAATCG，反向引物序列mecA-R为：CTGGAACTTGTTGAGCAGAG；
对应于oprD2的正向引物序列oprD2-F为：GCGCATCTCCAAGACCATG，反向引物序列oprD2-R为：GCCACGCGATTTGACGGTG；
其中，所述用于多重不对称PCR反应的反应体系分为4管，其中：
第一管多重不对称PCR反应体系包括：Gold StarBest MasterMix、qnrA-F、qnrA-R、qnrB-F、qnrB-R、qnrS-F、qnrS-R、mecA-F、mceA-R、vanA-F、vanA-R、vanB-F、vanB-R、ddH2O；
第二管多重不对称PCR反应体系包括：Gold StarBest MasterMix、IMP-F、IMP-R、VIM-F、VIM-R、OXA2-F、OXA2-R、OXA10-F、OXA10-R、OXA23-F、OXA23-R、OXA48-F、OXA48-R、ddH2O；
第三管多重不对称PCR反应体系包括：Gold Star Best Master Mix、ant(2")-I-F、ant(2")-I-R、ant(3")-I-F、ant(3")-I-R、aac(3)-II-F、aac(3)-II-R、aac(6')-I-F、aac(6')-I-R、TEM-F、TEM-R、oprD2-F、oprD2-R、ddH2O；
第四管多重不对称PCR反应体系包括：Gold StarBest MasterMix、KPC-R、KPC-F、NDM1-F、NDM1-R、DHA-F、DHA-R、SHV-F、SHV-R、CTX-M-14-F、CTX-M-14-R、CTX-M-15-F、CTX-M-15-R、ddH2O。
优选地，所述基因芯片进一步包括3条阴性探针；该三条阴性探针分别为：TCAGAGCCTGTGTTTCTACCAATTTTTTTTTTTT、CATCAATAGGGTCCGATATTTTTTTTTTTT、CGAACGCAAATCAATCTTTTTCCAGGTTTTTTTTTTTTT。
优选地，还包括：样品处理液，样品处理液包括：25mmol/LNaOH，0.1nmol/LEDTA，10mmol/LTris-HCl，1％NP-40，2％Chelex-100,1％Triton X-100。
优选地，还包括：杂交液，杂交液包括：0.6％SDS,8×SSC，10×Denhardt溶液，10％甲酰胺。
优选地，还包括：预洗液，预洗液为0.2％SDS。
优选地，还包括：洗液A、洗液B和洗液C；洗液A包括：1×SSC、0.2％SDS；洗液B包括0.2％SDS；洗液C包括0.1％SSC。
优选地，还包括：PBST溶液。
优选地，还包括：标记液，标记液包括辣根过氧化物酶标记链霉亲和素。
本申请从对氨基糖苷类、喹诺酮类、超广谱β内酰胺酶类(ESBLs)、头孢菌素类(AmpC)、碳青霉烯类、耐万古霉素、耐甲氧西林和导致膜通透性改变的基因中，选取了24个与临床关系最为密切的耐药基因作为靶基因，进行了用于肺炎致病菌耐药基因快速识别的试剂盒的研制。该试剂盒可直接检测临床标本中的肺炎致病菌耐药基因，操作简单快捷，不需要培养和药敏试验，在很大程度上为抗生素的合理使用争取了宝贵的时间，值得临床推广应用。
附图说明
图1为PCR产物切胶纯化回收操作流程图；
图2为质粒提取操作流程图；
图3为基因芯片杂交步骤；
图4为耐药基因琼脂糖凝胶电泳图；
图5为3个合成耐药基因片段Blast比对结果；
图6为21个耐药基因目的片段质粒构建序列图；
图7为部分探针灵敏度结果；
图8为耐药基因芯片特异度实验结果
图9为耐药基因芯片重复性实验。
具体实施方式
材料与方法
一、实验材料
1、耐药菌株
本实验所涉及的耐药菌株来自于本课题组前期收集的耐药菌株(包括21例肺炎克雷伯杆菌和铜绿假单胞菌、14例鲍曼不动杆菌和8例大肠杆菌)，另外由军事医学科学院放射与辐射医学研究所馈赠的灭活耐药菌株(包括产KPC的肺炎克雷伯菌株、产NDM1的肠杆菌、MRSA菌株和VRE菌株)
2、主要仪器和试剂
表1-2实验中使用仪器
实验试剂
LB培养基：液体培养基——10g蛋白胨(TRYPTONE)，10g NaCl，5g酵母提取物(YEAST EXTRACT)加蒸馏水至1L，高压后备用。固体培养基——10g蛋白胨(TRYPTONE)，10gNaCl，5g酵母提取物(YEAST EXTRACT)，15g琼脂(AGAR)加蒸馏水至1L，高压后备用。
样品处理液：25mmol/L NaOH，0.1nmol/L EDTA，10mmol/L Tris-HCl，1％NP-40，2％Chelex-100,1％TritonX-100；
电泳液：50×TAE储存液——冰乙酸28.5ml，Tris 121g，0.5ml/LNa2EDTA50ml混合，定容至500ml储存。1×TAE储存液——50×TAE储存液10ml，加蒸馏水定容至500ml，备用。
2％琼脂糖凝胶：称取1g琼脂糖粉，溶解在50ml的1×TAE溶液中，微波炉加热至完全熔化，取出摇匀，冷却片刻，加入5μl的EB溶液，摇匀，缓慢的倒入电泳槽中，待琼脂糖胶凝固。
点样液：0.1％SDS，6×SSC，5％甘油，2％(质量/体积)Ficoll400；
杂交液：0.6％SDS,8×SSC，10×Denhardt溶液，10％甲酰胺；
预洗液：0.2％SDS(25ml 50×SDS溶液+2475ml蒸馏水)；
洗液A：1×SSC，0.2％SDS(125ml 20×SSC溶液+50ml 50×SDS溶液+2325ml蒸馏水)；
洗液B：0.2％SDS(25ml 50×SDS溶液+2475ml蒸馏水)；
洗液C：0.1％SSC(12.5ml 20×SSC溶液+2487.5ml蒸馏水)；
PBST溶液：2500ml PBS溶液+5ml Tween-20，调节PH至7.0-7.2；
标记液：Streptavidin-horseradishperoxidase；
发光液A：MILLIPORE公司；
发光液B：MILLIPORE公司；
2×Gold StarBestMasterMix：北京康为世纪生物有限公司
Multiplex PCR 5×MasterMix：美国New England Biolabs(NEB)公司；
质粒小提试剂盒：北京天根生化科技有限公司；
琼脂糖凝胶回收试剂盒：北京天根生化科技有限公司；
DH5α感受态细胞：北京天根生化科技有限公司；
pMDTM18-TVector克隆试剂盒：TaKaRa公司；
DL2000DNAmarker：TaKaRa公司；
芯片片基：上海百傲科技有限公司。
二、实验方法
1、耐药基因的选择
通过查阅文献最终确定了24个耐药基因，分别是氨基糖苷类耐药基因ant(3")-I、aac(3)-II、aac(6')-I、ant(2")-I；喹诺酮类耐药基因qnrA、qnrB、qnrS；碳青霉烯类耐药基因OXA2、OXA10、OXA23、OXA48、KPC；ESBLs类耐药基因CTX-M-14、CTX-M-15、TEM、SHV；头孢菌素类耐药基因DHA；金属β-内酰胺酶类耐药基因NDM1、IMP、VIM；耐万古的vanA、vanB；耐甲氧西林的mecA和孔通道蛋白oprD2。其中oprD2在敏感菌株中正常表达，当其缺失时膜的结构发生改变，可产生耐药。
2、耐药基因引物与探针的设计与合成
先从NCBI数据库中搜索到每个耐药基因的序列，每个耐药基因至少下载3条不同ID号即GenBank序列号的序列，以防止耐药基因在不同菌株中个别碱基的变化，在设计引物和探针时尽量避免这些碱基。引物和探针的设计采用DNAMAN软件和Oligo7软件。具体设计原则如下：
引物设计原则：(1)GC含量在40％到60％之间；(2)长度为18-30bp；(3)3’末端不能出现3个或3个以上的连续碱基(如TTT或GGG)；(4)引物自身应避免发夹结构或二聚体；(5)产物应避免二级结构；(6)引物之间或自身不能有4个连续的碱基互补。PCR产物的长度最好在300bp以内，按照该原则设计好的引物还需在NCBI网站上通过BLAST分析，初步验证引物的特异性。
探针设计原则：(1)探针自身应避免产生二级结构；(2)探针长度一般在17-50nt；(3)探针序列在上下游引物之间的保守区域内，不包括上下游引物序列；(4)探针序列避免连续4个以上相同碱基的出现；(5)探针序列要具有特异性，不可与其他致病菌PCR产物之间有较长的连续的配对序列。每个基因可设计2-3条探针进行筛选，同样，这些按照原则设计好的探针需要进行BLAST分析，此外，还需利用DNAMAN软件比对探针与探针、探针与其他致病菌PCR产物之间是否存在配对现象，初步检测探针的特异性。
引物探针的合成
引物的筛选时，普通PCR引物的合成由中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所合成。筛选成功的引物由上海生工工程技术服务有限公司合成，合成时，在引物下游5’端标记生物素(Biotin)。探针的合成主要是：(1)在探针3’末端连接12个重复的T序列，目的是增加探针的空间柔性；(2)同时用氨基(-NH2)标记3’末端。
3、耐药基因质粒的构建与耐药基因引物的筛选
除了MRSA和VRE，其余菌株不清楚具体耐药基因携带情况，本实验每次在4种菌株中挑选3种耐药菌株进行目的基因的筛选，同时也是对引物的筛选。对于没有筛选出来的耐药基因，重新设计引物进行筛选。经过反复实验没有筛选出的耐药基因由北京博迈德基因技术有限公司进行片段合成，并将片段构建到大肠杆菌中，制备成质粒菌。
4、细菌DNA提取方法、普通PCR及其产物纯化、质粒参考品的制备和提取、芯片的制备、芯片杂交步骤如下。
细菌DNA提取方法
采用直接煮沸法，即将菌液取适量放入EP管中，盖紧盖子，沸水中煮10min，取出后迅速放置冰上，30min，然后12000转离心10min，取上清备用。
普通PCR及其产物纯化
普通PCR体系和条件，见表1-3与表1-4
表1-3普通PCR反应体系
表1-4普通PCR反应条件
将PCR产物加入到琼脂糖凝胶孔中，进行电泳，然后将含有单一的目的条带的琼脂糖凝胶切下，不要太大也不要太小，正好包含目的条带为宜，放入干净的EP离心管中，其回收采用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，根据说明书进行操作，主要步骤如图1。
质粒参考品的制备和提取
有标准菌株的致病菌通过普通PCR的方法对靶基因进行扩增，没有标准菌株的致病菌由北京博迈德公司直接合成靶基因序列。然后将目的基因序列通过pMDTM18-TVector克隆试剂盒进行T载体克隆，具体实验步骤如下：
将T载体和Solution I放在冰上融化，按照表1-5的加入连接体系，T载体和PCR切胶回收纯化产物DNA的摩尔比一般为：1:2-10，轻轻混匀，将PCR管置于16℃的恒温金属浴中过夜进行连接。
表1-5pMD18-T载体试剂盒克隆体系
将DH5α感受态细胞放在冰上溶解，溶解后，迅速将10μl连接产物加入其中，轻轻旋转离心管使混匀，冰上静置30min。
将离心管放进42℃水浴锅中，静置60-90s，然后将离心管移至冰浴中(此步骤要快)，目的是使细胞迅速冷去，时间为2-3min，该过程不能晃动离心管。
将不含抗生素的LB液体培养基900μl加入到离心管中，混匀后放入37℃摇床，150rpm培养45min。
将离心管内的液体混匀，吸取100μl已转化的感受态细胞到含氨苄青霉素(Amp，100μg/ml)的LB固体培养基上，用无菌的弯头玻棒轻轻的将细胞均匀涂开，盖上盖子，室温放置约1h，倒置平板，置于37℃培养箱内12-16h。
挑取培养基上单个的菌落，接种到5ml含有Amp(100μg/ml)的LB液体培养基中，置于37℃的摇床，200rpm振荡培养12-16h。
利用细菌靶基因的特异引物和pMD18-T载体的通用引物M13F(-47)/M13R(-48)进行菌液PCR，经琼脂凝胶电泳，选取条带位置正确的菌液进行测序和保存。测序由北京博迈德生物技术有限公司进行；保存时，取待保存的菌液500μl与等体积的30％甘油混匀，置于-70℃冰箱保存。
测序结果经序列比对，对含有目的片段的菌液进行质粒提取，操作按照质粒提取试剂盒的说明书进行，具体步骤如图2。
在260nm波长处，测定提取质粒DNA的浓度，根据公式：质粒拷贝数(Copies/μl)＝阿伏伽德罗常数×质粒浓度(ng/μl)×10-9/(660×质粒长度bp)g/mol，计算出质粒的拷贝数，然后进行10倍的梯度稀释，获得拷贝数分别为101,102,103,104,105,106copies/μl的质粒参考品，分装后-20℃冰箱保存，备用(避免反复冻融，以免影响质粒浓度)。
芯片的制备
先将芯片贴膜牢固的贴在片基上，不能有气泡，一张片基被分成10个微阵列反应区域；
利用ddH2O将合成的探针稀释成终浓度为100μM的溶液，振荡，混匀，在小型离心机上将挂壁的液体甩到底部，然后按1:1的比例，将5μl探针溶液和5μl芯片点样液加入到384孔板中，混匀，避免气泡的产生；
同时384孔板中还应加入标识列，即3’标记氨基的20个重复T序列，标识列的终浓度在1μM，不需要太明显，主要用于探针的定位和监测芯片杂交假阴性的出现。标识列与点样液的比例同样是1:1；
点样前，需将点样针超声10min左右，确保点样针的清洁；
点样时，点与点的距离≥7mm，然后根据微阵列的大小，探针的多少确定每条探针重复的次数，一般2-3次。另外还需要注意点样室的温度和湿度，温度室温即可，湿度在30％左右比较合适，湿度太大，点样探针不容易聚集，湿度太小，点样点小而不圆。
点样结束后，同样需要将点样针超声10min左右，保持点样针的清洁，防止点样孔阻塞和交叉污染。然后将芯片置于芯片盒内，连同芯片盒一起放进干燥器，24h后方可使用。
芯片杂交的步骤，如图3所示。
5、芯片灵敏度实验
5.1芯片探针阵列设计
选择特异性好，灵敏度高的探针作为最终的探针，并且选择3条分别来自人类、病毒和真菌基因序列的探针(其序列与所有探针序列不互补)，作为阴性探针，以监测杂交过程中假阳性的出现。
5.2芯片灵敏度实验
以前期梯度稀释的质粒参考品，浓度分别为102,103,104,105,106copies/μl的质粒作为模板，进行多重不对称PCR反应，杂交，然后根据芯片的结果确定探针的灵敏度。
6、芯片特异度实验
以浓度为104copies/μl的稀释质粒为模板，经过多重不对称PCR反应，芯片杂交，检测芯片的特异度。
结果
1、耐药基因的筛选
从所有耐药菌株中成功筛选出21个耐药基因，剩余3个耐药基因OXA48、OXA2和qnrA由北京博迈德基因技术有限公司合成，见表2-1。
表2-1耐药基因的来源
2、引物筛选结果
成功筛选出了24个耐药基因的引物，其序列见表2-2。24对引物筛选的琼脂糖凝胶电泳结果见图4。
表2-2耐药基因引物序列
注：F，正向引物；R，反向引物
3、质粒构建结果
引物筛选成功后，将片段位置正确的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳切胶纯化，通过pMD18载体转到大肠杆菌DH5α中，提取质粒用引物M13F(-47)和M13R(+48)进行测序，然后DNAMAN软件进行序列比对，选择测序正确的质粒进行参考品的制备和后续的实验。本实验共24个耐药基因，其中3个因缺乏模板由公司合成，序列比对结果见图5，另外21个耐药基因的目的片段均成功构建到大肠杆菌中，所有耐药基因目的片段测序结果正确，结果见图6。
4、多重不对称PCR的优化
本实验共有24对引物，经过引物间的搭配、引物间浓度的反复优化，最后确定分成4管PCR，每管6对引物。多重PCR反应试剂为北京康为世纪生物科技有限公司生产2×GoldStarBest MasterMix，具体反应条件见表2-3，反应体系见表2-4至表2-7。
表2-3多重不对称PCR反应条件
表2-4第一组多重PCR反应体系
表2-5第二组多重PCR反应体系
表2-6第三组多重PCR反应体
表2-7第四组多重PCR反应体系
5、探针筛选结果
每次针对耐药基因目的片段设计至少3条探针用于筛选，不合格的需要重新设计，最后选取探针信号最亮，与其他目的片段没有杂交反应的探针用于后续实验。在芯片灵敏度和特异度实验中，如果探针灵敏度低，特异性差，再重新进行探针筛选，通过反复的验证，最终确定了以下24条探针，见表2-8。
表2-8耐药基因探针筛选结果
6、耐药基因芯片阵列的确定
所有探针序列确定后，按照以下阵列图进行后续实验，见表2-9。根据芯片的大小和探针的数量，确定探针与探针之间的距离为0.075cm，每条探针重复2个点。
表2-9耐药基因芯片阵列图
7、耐药基因芯片灵敏度结果
根据前期肺炎致病菌菌种快速识别芯片灵敏度的结果，探针检测的最小质粒浓度在102copies/μl以上，因此针对该芯片我们选取质粒参考品的浓度为102、103、104、105、106copies/μl。芯片杂交结果显示，所有探针灵敏度均可达103copies/μl，部分结果见图7。
8、耐药基因芯片特异度结果
以24个耐药基因的质粒参考品104copies/μl为模板进行芯片特异度验证，结果显示每一条探针均能检测出各自的目的片段，并与其他目的片段没有非特异的杂交，结果见图8。
9、耐药基因芯片重复性结果
随机选取几个耐药基因探针进行重复性实验，模板为对应的104copies/μl质粒参考品。重复性实验有2种，一是同一批芯片，同一模板和反应体系与条件，重复3次PCR反应，其反应产物与芯片杂交；二是同一PCR反应与不同批次芯片杂交。
耐药基因芯片重复性实验结果见图9。
本申请中24个耐药基因有各自的流行趋势和耐药特点。
CTX-M耐药基因是ESBLs类耐药基因的一种，被认为是近20年在细菌耐药进展方面最重要的耐药基因[52]。该基因存在于三种克吕沃菌属或植物根部周围环境细菌的染色体上，一旦被诱导移动到带有插入序列ISEcp1和IS903的质粒上，便可以在肠杆菌属细菌间转移[53]。CTX-M是1989年在一位癌症患者的大肠杆菌分离株中发现，对第三代头孢菌素耐药[54]。CTX-M按照遗传性不同而基因型相同可分为4个主要型，即1、2、9和25，其中又以CTX-M-14与CTX-M-15基因型最常见。CTX-M-15主要在印度普遍存在，流行范围比CTX-M-14小。在我国1998年CTX-M-14首次在广州分离的肠杆菌科耐药株中发现，同时研究结果显示广州有超过35％的大肠杆菌产ESBLs，而当时头孢噻肟在广州很多医院广泛应用[55]。Hawkey等对旅行者携带的耐药菌株的调查显示，来自印度的旅行者携带CTX-M1型，其基因型大多数和CTX-M-15相似，来自中国的旅行者携带CTX-M9型，其基因型大多数和CTX-M-14相似，来自埃及和泰国的旅行者同时携带这两组基因，而卫生条件比较好的瑞士CTX-M携带率很低只有3％[56]。
TEM和SHV是最早发现由质粒和转座子介导传播的ESBLs类耐药基因，这两种基因同样也具有多种基因型，TEM有219种基因型，SHV有186种基因型，有基因型之间可能只有个别碱基的差异。TEM-1除了质粒介导外，铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌也具有产TEM-1的能力。TEM-1型ESBLs主要对青霉素类和头孢类抗生素耐药，但是耐药的强度不一致，对青霉素类表现很强的耐药性，但对头孢类抗生素，如头孢噻肟和头孢他啶的耐药性要弱一些[57]。大肠杆菌中TEM基因的检测率很高，达到85.4％，其中TEM-1基因比TEM-2基因常见[58]。SHV-1在肺炎克雷伯杆菌中普遍存在，其变异体是克雷伯菌属染色体上的基因，经过一些改变转移到质粒中，在各种肠杆菌中传递，在大肠杆菌中也高表达。SHV型ESBLs和TEM型ESBLs均对亚胺培南等碳青霉烯类药物敏感。
IMP和VIM是ESBLs类耐药基因中产金属超广谱β内酰胺酶(MBLs)的类型，由质粒介导传播，1990年IMP首次出现在日本[59]。像CTX-M型ESBLs一样，IMP和VIM也有很多基因型，这些基因型有的只有1个碱基的差别。本实验中的芯片可以同时检测到IMP1、IMP2、IMP4、IMP6、IMP10和VIM1、VIM4、VIM26、VIM33、VIM34、VIM35、VIM39、VIM42，这几种基因型的序列差别不太。VIM2是铜绿假单胞菌产MBLs的主要原因，有重要的临床意义。IMP1是最早在日本出现的基因型，随后在1995-2001年各种IMP基因型在不同的肠杆菌科-鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌中迅速蔓延。IMP4最初是在我国广东省杨氏柠檬酸杆菌中发现，由质粒1类整合子编码，可转移至大肠杆菌中。值得注意的是1类整合子介导的金属β内酰胺酶类耐药基因IMP和VIM不但可以在菌株与菌株之间，菌种与菌种之间转移，而且保持着很高的表达量[60]。在广东发现产生IMP4不久，表达IMP4的鲍曼不动杆菌在香港爆发流行[61]。2005年，携带IMP4的耐药菌株再次爆炸流行，这次主要在墨尔钵、澳大利亚和悉尼，并且耐药株不再只是鲍曼不动杆菌，还有铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯杆菌等所有肠杆菌属细菌。
2008年，一种新的ESBLs产生，即新德里金属β内酰胺酶NDM(New Delhi metallo-β-lactamase)，来自印度，明显不同于IMP和VIM金属β内酰胺酶，对碳青霉烯类药物耐药，被称为超级耐药基因。英国后来报道有一些散在的病例携带NDM1基因，而这些病例有超50％的患者在印度、孟加拉国或巴基斯坦住过院[62]。关于NDM在亚洲南部分布情况的数据还比较缺乏，但是可以推测NDM可能是在该地区分布最为广泛的碳青霉烯酶，常伴有OXA48基因的表达，因此很难通过耐药菌的表型来检测。NDM主要存在于耐碳青霉烯类抗生素的肺炎克雷伯杆菌和大肠杆菌中。目前虽然NDM局限在印度范围内扩散，在其他地区只是散在发生，但NDM在印度的传播扩散趋势并没有得到控制，而且逐年上升。Saleem等[63]报道2010年23％(6/26)的耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌从新生儿监护室中分离，2011年这一数据迅速上升到72％(13/18)。
KPC是肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶，1996年在美国首次报道，2000年纽约再次报道，并在美国的2个地区引起了爆发流行[64]。KPC1和KPC2是同一个基因，两者由于测序错误有一个碱基的差异，其中KPC2的序列是正确序列。KPC也有其他基因型，但都不如KPC2常见。KPC3对头孢他啶的耐药性比头孢噻肟的强。本实验能同时检测KPC2和KPC3。KPC都是依赖丝氨酸发挥作用的β内酰胺酶，除了高浓度的替莫西林，几乎对所有的β内酰胺类药物耐药，此外β内酰胺酶抑制剂对KPC也无效，但新的β内酰胺酶抑制剂阿维巴坦联合头孢他啶可以控制其产生。KPC不仅可以由肺炎克雷伯杆菌产生，而且其他类型的肠杆菌科也可产生，威胁着人类的生命健康。KPC在碳青霉烯类抗生素的滥用的地区明显传播迅速。在我国，KPC常伴随IMP4一起存在，但并不普遍存在，而对于单独表达KPC的临床分离株已经被鉴定。Qi等[65]收集我国5省13家医院的肺炎克雷伯杆菌共95株，检测显示所有分离株菌含有KPC-2基因，并且多数含有ST-11序列(ST-258一个位点的变异体)，其他的序列类型经脉冲场凝胶电泳鉴定来自不同的宿主细菌，提示质粒介导的KPC传递可能来自不同的背景。
OXA型碳青霉烯酶是D类β内酰胺酶，由革兰氏阴性菌产生，尤其是肠杆菌和铜绿假单胞菌。OXA型碳青霉烯酶能水解青霉素类抗生素，如苯唑西林、甲氧西林等。OXA同样有很多基因型，其中OXA2和OXA10主要在各种肠杆菌尤其是鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌中；OXA23基因型主要存在我国鲍曼不动杆菌中[66]，与碳青霉烯类抗生素耐药表型相关性最高；OXA48也是产碳青霉烯酶类的一种常见的耐药基因，主要引起交叉感染，特别是在ICU中容易产生交叉感染。可见，明确这四种OXA基因的表达情况，对指导临床用药，监测其流行情况等有重要的临床意义。
DHA是头孢菌素酶类的耐药基因，由质粒或染色体介导，容易传播或流行。有的医院DHA主要在肺炎克雷伯杆菌中表达，有的医院主要在大肠杆菌中表达，都属于肠杆菌属。DHA不能被克拉维酸抑制，因此对头孢菌素类、单环类等抗生素耐药，如氨苄西林、头孢类、氨曲南等耐药，在儿童中对第四代头孢类(头孢吡肟)、碳青霉烯类(亚胺培南)、喹诺酮类(环丙沙星)等敏感，其中喹诺酮类药物由于其对儿童骨关节的毒性作用，很少在儿童中使用，所以对DHA型AmpC酶引起的儿童感染，可选用头孢吡肟或亚胺培南[67]。在我国流行的DHA亚型是DHA1，本实验主要针对DHA1进行的引物和探针设计。
Qnr基因于1998年发现，由肺炎克雷伯菌产生，质粒介导传播和流行，qnr有5个亚型，包括qnrA、qnrB、qnrS、qnrC和qnrD，常见的是qnrA1、qnrB1、qnrS1。本实验正是针对这三种基因进行的芯片设计。Qnr蛋白是通过竞争性抑制对喹诺酮类药物产生的耐药。喹诺酮类药物降解细菌需要DNA旋转酶和拓扑异构酶Ⅳ与细菌靶DNA分子的结合，而qnr蛋白与该靶DNA分子结构相似，也可与这两种酶结合，从而减弱了喹诺酮类药对细菌的降解。由于竞争关系，携带qnr基因的菌株对氟喹诺酮类药物只是敏感性降低[68]。尽管如此，携带qnr基因的菌株引起的感染仍然可以导致患者住院时间延长、医疗费用增加、治疗失败等，因此由qnr基因所引起的氟喹诺酮类敏感性降低不容忽视，对qnr基因的检测是十分必要的。
氨基糖苷类抗生素修饰酶的产生被认为是鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌等耐药菌株对氨基糖苷类抗生素耐药的主要原因，这种酶可以对氨基糖苷类抗生素侧链上的氨基和羟基进行修饰，从而导致抗生素与靶基因的结合失败，抗生素不能发挥其抗菌活性。氨基糖苷类抗生素修饰酶包括氨基糖苷乙酰基转移酶和氨基糖苷核苷转移酶。aac(3)-II是氨基糖苷乙酰基转移酶的基因型，ant(2")-I和ant(3")-I是氨基糖苷核苷转移酶的基因型，均由质粒介导传播和转移。在伊朗，aac(6')-II(36％)主要在铜绿假单胞菌耐药株中，其次为ant(2")-I和aac(6')-I[69]，在我国ant(3")-I和aac(6')-I基因在鲍曼不动杆菌耐药株中高表达，ant(2")-I和aac(6')-I基因在铜绿假单胞菌耐药株中高表达，aac(3)-II在大肠杆菌中的检出率可高达88.5％，可见，不同的地区产生的耐药基因也不同，这可能与地区抗生素使用情况不同有关。
早在1986年，Quinn等[70]便发现对亚胺培南耐药的铜绿假单胞菌中，其外膜蛋白分子量明显减少，推测亚胺培南进入铜绿假单胞菌与外膜蛋白密切相关。Hancock等[71]将这种外膜蛋白划分到D类外膜蛋白，D类外膜蛋白有D1和D2两类。1990年，Trains等[72]证实与亚胺培南进入铜绿假单胞菌的特异通道是外膜蛋白D2类(outermembrane protein D2,oprD2)。与其他耐药基因不同，oprD2基因是外膜蛋白上正常表达的基因，当其缺失时产生耐药。oprD2基因缺失突变有2种，一种编码为395-405位之间11个碱基的缺失，另一种是启动子上游-519位到685位1204个碱基的缺失[73,74]，本实验在设计引物和探针时，参考了文献[74]中的引物，2中缺失均可以检测，但不能区分缺失片段的大小。
MRSA现在不但是医院感染的主要致病原，也是社区感染的一种致病原。mecA基因是MRSA的关键耐药基因，位于染色体上，编码青霉素结合蛋白PBP2a。PBP2a可以与β内酰胺类抗生素结合，从而阻止β内酰胺类抗生素与PBPs的正常结合，使β内酰胺类抗生素不能发挥作用，细菌正常生长，形成耐药。研究发现[75]社区感染MRSA(CA-MRSA)与医院感染MRSA(HA-MRSA)的抗生素抵抗力不一致，CA-MRSA主要对β内酰胺类抗生素耐药，而对很多非β内酰胺类抗生素敏感，不容易形成多重耐药，而HA-MRSA不但对β内酰胺类抗生素耐药，对很多其他类型的抗生素也耐药，常表现为多重耐药，可供选择的治疗药物很少。这种差异的产生主要与SCCmec基因盒有关，SCCmec基因盒由mec基因复合体和染色体盒重组酶基因复合体构成，分为5型，即Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型和Ⅴ型[76]，其中Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型主要存在于HA-MRSA中，Ⅳ型和Ⅴ型主要存在于CA-MRSA中，是引起MRSA耐药性不同的主要原因[77]。
vanA和vanB基因是VRE的两个主要耐药基因，两者把VRE分为3种，即vanA基因型显示vanA表现型、vanB基因型显示vanB表现型和vanA基因型显示vanB表现型[78]。这三种的耐药特性不一致，前一种对万古霉素和替考拉宁均高度耐药，后两种对万古霉素表现出不同程度的耐药，而对替考拉宁敏感。最新研究显示[79]，加拿大1927份肠球菌属分离株中，4.2％(80)是VRE，感染率从2007的1.6％上升到2013年的6％，并且所有VRE均为屎肠球菌，其中90％携带vanA，表现为多重耐药，但对多西环素、利奈唑胺和达托霉素不同程度敏感。在我国VRE也主要以vanA基因型屎肠球菌为主[80]。vanA和vanB基因也可以由质粒介导转移到其他革兰氏阳性菌种，如MRSA[81]，从而形成毒力更强的耐药菌株。
以上耐药基因中，有的每种具有很多基因型，本实验选取了其中最常见，在细菌耐药反应中起着重要作用的24个基因进行检测。肺炎致病菌耐药基因检测芯片敏感度高，特异度和重复性好。本申请针对24个耐药基因进行了研究，该耐药基因芯片最大的优势在于其检测时间短，能够弥补药敏实验结果出来前2-3天的空白期，为临床提供初步的抗生素使用指导。
英文缩略语表
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Claims (8)

1.一种用于肺炎致病菌耐药基因快速检测的试剂盒，其包括基因芯片和用于多重不对称PCR反应的反应体系；
所述基因芯片包括对应于肺炎致病菌耐药基因的探针；
其中，所述肺炎致病菌耐药基因至少包括金属β内酰胺类耐药基因，所述金属β内酰胺类耐药基因包括NDM1、IMP、VIM中的至少一种；
其中，对应于NDM1的探针的序列为：
ATGGAAACTGGCGACCAACGGTTTGGCGATCTTTTTTTTTTTT；
对应于IMP的探针的序列为：
AGATAACGTAGTGGTTTGGTTTTTTTTTTTT；
对应于VIM的探针的序列为：
TCTAGAAGGACTCTCATCGATTTTTTTTTTTT；
所述肺炎致病菌耐药基因还包括碳青霉烯类耐药基因，所述碳青霉烯类耐药基因包括OXA2、OXA10、OXA23、OXA48、KPC中的至少一种；
其中，对应于OXA2的探针的序列为：
TTGCAGGCCACAATCAAGACCAAGATTTTTTTTTTTTT；
对应于OXA10的探针的序列为：
TCAAATGGGACGGAAAGCCAAGAGCCATGAATTTTTTTTTTTT；
对应于OXA23的探针的序列为：
GAGAGTAATGGCTACAAAATTTTTTTTTTTTTTT；
对应于OXA48的探针的序列为：
AGTTTCTGGCTCGACGGTGGTATTCTTTTTTTTTTTT；
对应于KPC的探针的序列为：
TGACGGCCTTCATGCGCTCTATCGGCGATACTTTTTTTTTTTT；
所述肺炎致病菌耐药基因还包括氨基糖苷类耐药基因，所述氨基糖苷类耐药基因包括aac(3)-II、aac(6')-I、ant(2")-I、ant(3")-I中的至少一种；
其中，对应于aac(3)-II的探针的序列为：
GTGGGTTCGGCCTGCTGAATCAATTTCTGGTTTTTTTTTTTT；
对应于aac(6')-I的探针的序列为：
AGGTCACCAAGATCCAAACGGACTTTTTTTTTTTT；
对应于ant(2")-I的探针的序列为：
CACGCAAGCACGATGATATTGATCTGACGTTTTTTTTTTTT；
对应于ant(3")-I的探针的序列为：
TCTCCGCGCTGTAGAAGTCACCATTGTTTTTTTTTTTTTT；
所述肺炎致病菌耐药基因还包括喹诺酮类耐药基因，喹诺酮类耐药基因包括qnrA、qnrB、qnrS中的至少一种；
其中，对应于qnrA的探针的序列为：
ATGTACTTCTGCTCGGCTTATATCTCAGGTTTTTTTTTTTTT；
对应于qnrB的探针的序列为：
GTAGCGCATATATCACGAATACCAATCTAAGCTACGCCTTTTTTTTTTTT；
对应于qnrS的探针的序列为：
TCGCTGGATAGGAACGAACCTAGCTTTTTTTTTTTT；
所述肺炎致病菌耐药基因还包括ESBLs类耐药基因，所述ESBLs类耐药基因包括CTX-M-14、CTX-M-15、SHV、TEM中的至少一种；
其中，对应于CTX-M-14的探针的序列为：
CAGCCTGTCGAGATCAAGCCTGTTTTTTTTTTTT；
对应于CTX-M-15的探针的序列为：
AGACTGGGTGTGGCATTGATTATTTTTTTTTTTT；
对应于SHV的探针的序列为：
CTCCAGCTGTTCGTCACCGGCATTTTTTTTTTTT；
对应于TEM的探针的序列为：
GTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACTTTTTTTTTTTT；
所述肺炎致病菌耐药基因还包括头孢菌素类耐药基因，所述头孢菌素类耐药基因为DHA；
其中，对应于DHA的探针的序列为：
GCTTGATGCGGAATCTTACGGTTTTTTTTTTTT；
所述肺炎致病菌耐药基因还包括耐万古霉素类耐药基因，所述耐万古霉素类耐药基因包括vanA、vanB中的至少一种；
其中，对应于vanA的探针的序列为：
CCGCATTGTACTGAACGAAGTCTTTTTTTTTTTT；
对应于vanB的探针的序列为：
GCTTACCTACCCTGTCTTTGTGATTTTTTTTTTTT；
所述肺炎致病菌耐药基因还包括耐甲氧西林类耐药基因，所述耐甲氧西林类耐药基因为mecA；
其中，对应于mecA的探针的序列为：
GTAAGCACACCTTCATATGACGTCTATCCTTTTTTTTTTTT；
所述肺炎致病菌耐药基因还包括膜孔蛋白类耐药基因，所述膜孔蛋白类耐药基因为oprD2；
其中对应于oprD2的探针的序列为：
TGTTCCCGCAGACCGCGATTTTTTTTTTTT；
其中，所述用于多重不对称PCR反应的反应体系包括：
对应于NDM1的正向引物序列NDM1-F为：GCATTAGCCGCTGCATTGAT，反向引物序列NDM1-R为：CGGCATGTCGAGATAGGAAGT；
对应于IMP的正向引物序列IMP-F为：CCACGTATGCATCTGAAT，反向引物序列IMP-R：ACTTTGGCCAAGCTTCTA；
对应于VIM的正向引物序列VIM-F为：CAGTCTCCACGCACTTTCA，反向引物序列VIM-R为：GCAGCACCAGGATAGAAGA；
对应于OXA2的正向引物序列OXA2-F为：CGCTGTTCGTGATGAGTTC，反向引物序列OXA2-R为：GCTGCCTTCTATCCAGTAATC；
对应于OXA10的正向引物序列OXA10-F为：TCAATGGTGTCTTCGTGCT，反向引物序列OXA10-R为：CTTACTTCGCCAACTTCTCTG；
对应于OXA23的正向引物序列OXA23-F为：CAGTCTATCAGGAACTTGCG，反向引物序列OXA23-R为：CATTGCCCAACCAGTCTT；
对应于OXA48的正向引物序列OXA48-F为：TAAGTGGGATGGACAGACG，反向引物序列OXA48-R为：TTGACAATACGCTGGCTG；
对应于KPC的正向引物序列KPC-F为：GGCCGCCGTGCAATACAGTGATAAC，反向引物序列KPC-R为：CCTGGGATGGCGGAGTTCAGCT；
对应于aac(3)-II的正向引物序列aac(3)-II-F为：GCTCGGTTGGATGACAAA，反向引物序列aac(3)-II-R为：TGCGGTAACGGAGTTTAG；
对应于aac(6')-I的正向引物序列aac(6')-I-F为：TATGAGTGGCTAAATCGA，反向引物序列aac(6')-I-R为：CCCGCTTTCTCGTAGCA；
对应于ant(2")-I的正向引物序列ant(2")-I-F为：CACAACGCAGGTCACATT，反向引物序列ant(2")-I-R为：TCGCAGTCAAGTAACTCATCC；
对应于ant(3")-I的正向引物序列ant(3")-I-F为：GGTGACCGTAAGGCTTGAT，反向引物序列ant(3")-I-R为：GGCAACGCTATGTTCTCTTG；
对应于qnrA的正向引物序列qnrA-F为：TCACTTCAGCTATGCCGAT，反向序列qnrA-R为：ATCTGAGCCCATCAAGGAA；
对应于qnrB的正向引物序列qnrB-F为：GTGCGATGCTGAAAGATG，反向序列qnrB-R为：TGTGAAGTTTGCTGCTCG；
对应于qnrS的正向引物序列qnrS-F为：TAGAGTTCCGTGCGTGTGA，反向序列qnrS-R为：AGTTCGGCGTGGCATAAA；
对应于CTX-M-14的正向引物序列CTX-M-14-F为：GCTTTCCAATGTGCAGTACCAG，反向引物序列CTX-M-14-R为：ACCGAGCTGGGCAATCAAT；
对应于CTX-M-15的正向引物序列CTX-M-15-F为：ACGCTGTTGTTAGGAAGTGTG，反向引物序列CTX-M-15-R为：ACAGATTCGGTTCGCTTTCAC；
对应于SHV的正向引物序列SHV-F为：CTGGCGATAGTGGATCTT，反向引物序列SHV-R为：CGCGTAGGCATGATAGAA；
对应于TEM的正向引物序列TEM-F为：TCTTACGGATGGCATGACAG，反向引物序列TEM-R为：CTCGTCGTTTGGTATGGCTT；
对应于DHA的正向引物序列DHA-F为：TTATCTCACACCTTTATTACTG，反向引物序列DHA-R为：TATCTTTTGAGGCGGATT；
对应于vanA的正向引物序列vanA-F为：AGCGAGGACGGATACAGGAA，反向引物序列vanA-R为：GGTCAATCAGTTCGGGAAGT；
对应于vanB的正向引物序列vanB-F为：ACAAATCACTGGCCTACATTC，反向引物序列vanB-R为：CGCCGACAATCAAATCATC；
对应于mecA的正向引物序列mecA-F为：TGGCTATCGTGTCACAATCG，反向引物序列mecA-R为：CTGGAACTTGTTGAGCAGAG；
对应于oprD2的正向引物序列oprD2-F为：GCGCATCTCCAAGACCATG，反向引物序列oprD2-R为：GCCACGCGATTTGACGGTG；
其中，所述用于多重不对称PCR反应的反应体系分为4管，其中：
第一管多重不对称PCR反应体系包括：Gold Star Best Master Mix、qnrA-F、qnrA-R、qnrB-F、qnrB-R、qnrS-F、qnrS-R、mecA-F、mceA-R、vanA-F、vanA-R、vanB-F、vanB-R、ddH2O；
第二管多重不对称PCR反应体系包括：Gold Star Best Master Mix、IMP-F、IMP-R、VIM-F、VIM-R、OXA2-F、OXA2-R、OXA10-F、OXA10-R、OXA23-F、OXA23-R、OXA48-F、OXA48-R、ddH2O；
第三管多重不对称PCR反应体系包括：Gold Star Best Master Mix、ant(2")-I-F、ant(2")-I-R、ant(3")-I-F、ant(3")-I-R、aac(3)-II-F、aac(3)-II-R、aac(6')-I-F、aac(6')-I-R、TEM-F、TEM-R、oprD2-F、oprD2-R、ddH2O；
第四管多重不对称PCR反应体系包括：Gold Star Best Master Mix、KPC-R、KPC-F、NDM1-F、NDM1-R、DHA-F、DHA-R、SHV-F、SHV-R、CTX-M-14-F、CTX-M-14-R、CTX-M-15-F、CTX-M-15-R、ddH2O。
2.如权利要求1所述的用于肺炎致病菌耐药基因快速检测的试剂盒，其特征在于：所述基因芯片进一步包括3条阴性探针；该三条阴性探针分别为：TCAGAGCCTGTGTTTCTACCAATTTTTTTTTTTT、CATCAATAGGGTCCGATATTTTTTTTTTTT、CGAACGCAAATCAATCTTTTTCCAGGTTTTTTTTTTTTT。
3.如权利要求1或2所述的用于肺炎致病菌耐药基因快速检测的试剂盒，其特征在于还包括：样品处理液，样品处理液包括：25mmol/L NaOH，0.1nmol/L EDTA，10mmol/L Tris-HCl，1％NP-40，2％Chelex-100,1％Triton X-100。
4.如权利要求3所述的用于肺炎致病菌耐药基因快速检测的试剂盒，其特征在于还包括：杂交液，杂交液包括：0.6％SDS,8×SSC，10×Denhardt溶液，10％甲酰胺。
5.如权利要求4所述的用于肺炎致病菌耐药基因快速检测的试剂盒，其特征在于还包括：预洗液，预洗液为0.2％SDS。
6.如权利要求5所述的用于肺炎致病菌耐药基因快速检测的试剂盒，其特征在于还包括：洗液A、洗液B和洗液C；洗液A包括：1×SSC、0.2％SDS；洗液B包括0.2％SDS；洗液C包括0.1％SSC。
7.如权利要求6所述的用于肺炎致病菌耐药基因快速检测的试剂盒，其特征在于还包括：PBST溶液。
8.如权利要求7所述的用于肺炎致病菌耐药基因快速检测的试剂盒，其特征在于还包括：标记液，标记液包括辣根过氧化物酶标记链霉亲和素。
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