CN109239349A - 人附睾蛋白4作为类风湿关节炎诊断标志物的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医学技术领域，公开了人附睾蛋白4（HE4）作为类风湿关节炎诊断标志物的应用。本发明首次研究发现HE4基因在类风湿关节炎患者中异常高表达，人附睾蛋白4也高表达，其可分泌到血清中，在患者血清中特异性显著高表达，能够作为类风湿关节炎的诊断标记物；利用ROC曲线对血清中HE4蛋白进行分析显示诊断价值好，且敏感性和特异性均达80.0%以上，具有很高的可靠性。本发明基于此所提供的类风湿关节炎诊断试剂盒检测快速方便、准确率高、特异性好、灵敏度高，可以实现对类风湿关节炎的准确诊断，能广泛应用于医疗行业类风湿关节炎的辅助诊断和治疗。

Description

人附睾蛋白4作为类风湿关节炎诊断标志物的应用
技术领域
本发明属于生物医学技术领域。更具体地，涉及人附睾蛋白4在作为类风湿关节炎诊断标志物的应用。
背景技术
类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一种自身免疫性疾病，其病理特征为炎症反应和炎症细胞因子分泌增多，临床表现为长期慢性炎症浸润、关节疼痛、关节肿大和关节畸形，对人类健康和生活带来极大伤害。流行病学研究发现世界女性类风湿关节炎发病率约为1.16％，男性为0.44％，类风湿关节炎已成为亟待解决的公共卫生问题，也是临床研究的热点。已有研究表明，早期诊断和治疗类风湿关节炎可有效地改善病人生活质量和预后，类风湿关节炎发病过程缓慢，病程久，长达十几年。类风湿关节炎发展到后期导致关节畸形和破坏，严重影响患者的生活和健康，给社会和家庭带来巨大的经济压力。
目前类风湿关节炎的诊断包括血清学、影像学和临床症状，但是这些指标往往在疾病发展到一定阶段才出现，影响疾病的诊断。血清学检测对类风湿关节炎至关重要，比如，类风湿因子RF和抗环瓜氨酸抗体ACPA，但这两个指标特异性和敏感性存在一定的缺陷。因此，寻找特异性好、灵敏度高的血清标志物对诊断类风湿关节炎尤为重要。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有类风湿关节炎血清学检测标志物的特异性和敏感性不好的缺陷和不足，提供一种新的类风湿关节炎的诊断标志物，即人附睾蛋白4(HE4)。
本发明的目的是提供人附睾蛋白4在作为类风湿关节炎诊断标志物的应用。
本发明另一目的是提供一组诊断类风湿关节炎的荧光定量PCR引物对。
本发明的再一目的是提供一种类风湿关节炎的诊断试剂盒。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明利用RT-PCR法检测骨关节置换病人和类风湿关节炎患者HE4基因表达时意外发现，类风湿关节炎患者HE4基因水平明显高于骨关节置换手术患者。随后用Westernblot检测类风湿关节炎患者HE4蛋白的表达，发现HE4蛋白在类风湿关节炎患者含量增加；接着用酶联免疫法验证检测类风湿关节炎患者血清中HE4蛋白含量，发现HE4蛋白含量明显增高。更进一步的，本发明人利用ROC曲线对血清中HE4蛋白进行分析，结果显示其AUC面积为0.883，诊断价值较好，表明：血清HE4蛋白作为标记物能对类风湿关节炎做出准确诊断，其敏感性和特异性分别为80.0％和83.3％；95％置信区间为0.762～1.004，具有特异性好，灵敏度高特点。因此，本发明提供了HE4作为类风湿关节炎病的诊断标志物的新应用。
基于上述发现成果，以下应用均应在本发明的保护范围之内：
本发明请求保护人附睾蛋白4在作为类风湿关节炎诊断标记物方面的应用。
本发明还请求保护人附睾蛋白4在制备类风湿关节炎诊断试剂或试剂盒中的应用。
本发明还请求保护一种检测HE4基因转录水平的的荧光定量PCR引物对，也即为诊断类风湿关节炎的荧光定量PCR引物对，包括RT-PCR正向引物、反向引物，核苷酸序列依次如SEQ ID NO:1～2所示。
HE4-F(SEQ ID NO:1)：5’-TAGCACCATGCCTGCTTGTC-3’；
HE4-R(SEQ ID NO:1)：5’-TCCTGTGCCTGAGACTAGGG-3’。
另外，所述引物对在制备类风湿关节炎诊断制剂和/或试剂盒中的应用。
本发明还请求保护一种类风湿关节炎诊断试剂盒，所述试剂盒包含检测HE4基因表达水平或血清中HE4蛋白含量的试剂。
优选地，所述试剂盒中的试剂包括所述引物对。
更优选地，所述试剂盒还包括内参基因GAPDH，包括正向引物和反向引物，核苷酸序列依次如SEQ ID NO:3～4所示。
GAPDH-F(SEQ ID NO:3)：5’-ACCATCTTCCAGGAGCGAGA-3’；
GAPDH-R(SEQ ID NO:4)：5’-GACTCCACGACGTACTCAGC-3’。
优选地，所述试剂盒是荧光定量PCR检测试剂盒，其反应体系包括：Premix Ex Taq 10.0μL，10μmol/L PCR上游引物0.4μL，10μmol/L PCR下游引物0.4μL，cDNA模板2.0μL，加dH2O至总体积20.0μL。
优选地，所述荧光定量PCR的反应条件为：96℃30s，1个循环；96℃5s，60℃15s，45个循环；溶解，96℃15s，65℃20s，96℃15s，1个循环。
本发明具有以下有益效果：
本发明首先鉴定发现了HE4基因和蛋白在类内风湿关节炎患者中高表达，类风湿关节炎患者HE4蛋白表达增高，血清中HE4蛋白含量也增高，因此可作为类风湿关节炎病的诊断标志物，克服了现在类风湿关节炎诊断标志物特异性差、灵敏度不够的缺点；具有特异性好、灵敏度高特点，对类风湿关节炎具有较好的诊断价值。
而且，所述HE4在类风湿关节炎患者血清中特异性显著高表达，能够作为类风湿关节炎诊断标记物，利用ROC曲线对血清中HE4蛋白进行分析，结果显示其AUC面积为0.883，诊断价值较好，其敏感性和特异性分别为80.0％和83.3％，具有较高的可靠性。
基于上述发现，本发明构建了类风湿关节炎诊断试剂盒，检测快速方便、准确率高、特异性好、灵敏度高，可以实现对类风湿关节炎的准确诊断，能广泛应用于医疗行业类风湿关节炎的辅助诊断和治疗。
附图说明
图1为骨关节置换手术患者和类风湿关节炎患者中HE4蛋白表达对比；1、2、3分别为3例骨关节置换病人和3例类风湿关节炎病人的滑膜组织；β-actin为内参蛋白。
图2为ROC曲线分析血清HE4对类风湿关节炎诊断价值和相关指标；(A)ROC曲线分析血清HE4对类风湿关节炎的诊断价值；(B)ROC曲线分析血清HE4对类风湿关节炎诊断的相关指标。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1RT-PCR检测类风湿关节炎患者中HE4基因转录水平
1、实验方法
(1)制备cDNA
类风湿关节炎患者和骨关节置换病人的滑膜组织来源于广州医科大学附属第三医院和广州市增城区新塘医院。关节滑膜组织采用无菌收集，手术后取关节滑膜组织于干净无菌的50mL离心管中，置于冰上，于无菌操作台剥除脂肪组织、骨头、血管等后，用PBS洗3遍，提取RNA，逆转录制备cDNA。
(2)PCR
RT-PCR引物如表1。
表1 RT-PCR引物
以制备的cDNA为模板，用SYBER green试剂盒进行实时荧光PCR实验，其PCR反应体系如下表2。
表2荧光定量PCR反应体系
PCR反应条件为：96℃30s，1个循环；96℃5s，60℃15s，45个循环；溶解，96℃15s，65℃20s，96℃15s，1个循环。
以上实验重复三次，以GAPDH为内对照，通过2-△△CT法计算各组之间目标基因HE4表达水平的差异；按照下列公式计算样本的相对表达量：其中△△Ct＝△Ct处理组-△Ct对照组；△Ct＝CtHE4-CtGAPDH。
2、实验结果
如下表3所示，从表3可以看出：HE4在类风湿关节炎患者滑膜中的转录水平明显高于在骨关节置换病人滑膜组织中的表达水平。与骨关节置换手术患者相比，类风湿关节炎患者HE4基因转录水平明显高于骨关节置换手术患者。
表3骨关节置换手术患者和类风湿关节炎患者滑膜中HE4转录水平
实施例2Western blot检测类风湿关节炎患者中HE4蛋白水平
1、免疫印迹试验(Western blot)方法
Western blot试验用来检测类风湿关节炎患者和骨关节患者滑膜组织HE4蛋白水平。A为类风湿关节炎病人滑膜中HE4蛋白水平；1、2、3分别为3例骨关节置换病人和3例类风湿关节炎病人的滑膜组织；β-actin为内参蛋白。
具体方法如下：收集处理好的类风湿关节炎患者和骨关节患者滑膜组织，剪碎，均浆，然后进行蛋白定量，跑胶。加入HE4蛋白一抗，4℃过夜，收集一抗，加入二抗，然后加入化学发光显色液显色，拍照。
2、实验结果
从图1可知，与骨关节置换手术患者比较，类风湿关节炎患者滑膜中HE4蛋白水平明显高于骨关节置换手术病人。
实施例3酶联免疫法检测类风湿关节炎患者血清中HE4蛋白含量
1、实验方法
类风湿关节炎患者血清中HE4蛋白含量采用酶联免疫法检测，收集类风湿关节炎患者的新鲜血清，采用酶联免疫法检测，试剂盒采用北京普利莱公司产品。
具体步骤：制备标准品稀释液，收集类风湿关节炎病人血清，按照酶联免疫试剂盒说明书进行操作，最后利用酶标仪检测光密度(即OD值)。根据标准吸光值及对应的浓度技术标准曲线计算类风湿关节炎患者血清中HE4蛋白含量。
2、实验结果
表4骨关节置换手术患者类风湿关节炎患者血清中HE4水平
如表4所示，与骨关节置换手术患者比较，类风湿关节炎患者血清中HE4蛋白水平明显高于骨关节置换手术病人。
实施例4 ROC曲线分析血清中HE4蛋白含量在类风湿关节炎患者中的诊断价值
1、实验方法
采用SPSS17.0软件对血清HE4蛋白含量在类风湿关节炎患者中的诊断价值进行分析。
2、实验结果
如图2所示，ROC曲线分析结果显示AUC面积为0.883，表明血清HE4蛋白含量对类风湿关节炎的诊断具有较好价值；同时ROC曲线分析表明HE4蛋白含量对类风湿关节炎诊断的诊断敏感性和特异性分别为80.0％和83.3％；95％置信区间为0.762～1.004，具有特异性好、灵敏度高特点。
实施例5类风湿关节炎诊断试剂盒
1、一种类风湿关节炎诊断试剂盒，包括以下组分：
(1)HE4基因检测引物对：RT-PCR正向引物、反向引物，核苷酸序列依次如SEQ IDNO:1～2所示。
HE4-F(SEQ ID NO:1)：5’-TAGCACCATGCCTGCTTGTC-3’；
HE4-R(SEQ ID NO:1)：5’-TCCTGTGCCTGAGACTAGGG-3’。
(2)内参基因GAPDH检测引物对：包括正向引物和反向引物，核苷酸序列依次如SEQID NO:3～4所示。
GAPDH-F(SEQ ID NO:3)：5’-ACCATCTTCCAGGAGCGAGA-3’；
GAPDH-R(SEQ ID NO:4)：5’-GACTCCACGACGTACTCAGC-3’。
(3)反应所需试剂：Premix Ex Taq 10.0μL，10μmol/L PCR上游引物0.4μL，10μmol/L PCR下游引物0.4μL，cDNA模板2.0μL，加dH2O至总体积20.0μL。
2、该试剂盒的使用方法如下：
提取待测样本DNA，以所述引物对进行荧光定量PCR检测。
反应体系包括：Premix Ex Taq 10.0μL，10μmol/L PCR上游引物0.4μL，10μmol/L PCR下游引物0.4μL，cDNA模板2.0μL，加dH2O至总体积20.0μL。
反应条件为：96℃30s，1个循环；96℃5s，60℃15s，45个循环；溶解，96℃15s，65℃20s，96℃15s，1个循环。
该试剂盒可以实现对类风湿关节炎的准确诊断，检测快速方便、准确率高、特异性好、灵敏度高，能广泛应用于医疗行业类风湿关节炎的辅助诊断和治疗。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.人附睾蛋白4在作为类风湿关节炎诊断标记物方面的应用。
2.人附睾蛋白4在制备类风湿关节炎诊断试剂或试剂盒中的应用。
3. 一种检测HE4基因转录水平的荧光定量PCR引物对，其特征在于，包括RT-PCR正向引物、反向引物，核苷酸序列依次如SEQ ID NO:1～2所示。
4. 一种诊断类风湿关节炎的荧光定量PCR引物对，其特征在于，包括RT-PCR正向引物、反向引物，核苷酸序列依次如SEQ ID NO:1～2所示。
5.权利要求3或4所述引物对在制备类风湿关节炎诊断制剂和/或试剂盒中的应用。
6.一种类风湿关节炎诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含检测HE4基因表达水平或血清中HE4蛋白含量的试剂。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂包括权利要求5所述的引物对。
8. 根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒是荧光定量PCR检测试剂盒，其反应体系包括：2×SYBR® Premix Ex Taq 10.0μL，10μmol/L PCR上游引物0.4μL，10μmol/L PCR下游引物0.4μL，cDNA模板2.0μL，加dH2O至总体积20.0μL。
9. 根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光定量PCR的反应条件为：96℃30s，1个循环；96℃ 5s，60℃ 15s，45个循环；溶解，96℃ 15s，65℃ 20s，96℃ 15s，1个循环。
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