CN110453007A - 一种用于红三叶遗传多样性分析的ssr引物组及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于红三叶遗传多样性分析的SSR引物组及其应用，属于分子标记技术领域。本发明提供了用于红三叶遗传多样性分析的SSR分子标记引物组，包括8对引物。本发明还提供了所述SSR分子标记引物组在红三叶遗传多样性分析和种质资源遗传系谱分析中的应用，所述引物组能有效对红三叶种质资源进行遗传多样性分析及群体聚类分析。本发明所述的8对引物具有多态性丰富、扩增稳定、重复性好、便于统计等优点，丰富了红三叶种质资源遗传多样性分析及品种系谱分析的方法。

Description

一种用于红三叶遗传多样性分析的SSR引物组及其应用
技术领域
本发明属于分子标记技术领域，具体涉及一种用于红三叶遗传多样性分析的SSR引物组及其应用。
背景技术
红三叶(Trifolium pretense L.)是豆科(Leguminosae)三叶草属(TrifoliumL.)多年生草本植物，起源于地中海小亚细亚地区东南欧，属于温性植物，主要分布在欧洲、俄罗斯、新西兰等海洋性气候地区，是世界上被广泛栽培的豆科牧草之一。在我国长江流域及西南地区成为草地建设的当家草种，在湖北、四川、贵州等地与玉米等作物间作，可改良土壤，提高作物产量，为当地草地畜牧业生产发展和增加农牧民经济收入发挥了重要作用。
红三叶在生产实践中具有很高的经济和生态价值，但由于其种质资源研究的落后，优良的种质材料得不到开发利用，培育的品种少，已成为制约红三叶利用和草地畜牧业发展的瓶颈。当前，分子标记技术如AFLP、ISSR、SRAP、SSR已经用于红三叶相关研究，但由于特异性引物少，研究中多为其他物种上的通用引物，已经限制了红三叶分子育种技术的发展。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种新的用于红三叶遗传多样性分析的SSR引物组及其应用，大大丰富红三叶遗传多样性分析的SSR引物，红三叶遗传多样性分析的SSR引物。
本发明提供了一种用于红三叶遗传多样性分析的SSR引物组，包括以下8对引物，具体见SEQ ID No.1～SEQ ID No.16。
本发明提供了所述引物组在红三叶遗传多样性分析及种质资源遗传系谱分析中的应用。
优选的，所述红三叶遗传多样性分析及种质资源遗传系谱分析的方法，包括以下步骤：
1)提取待测红三叶样品基因组DNA；
2)每对引物的正向引物分别加上通用M13接头序列，得到M13接头正向引物，在所述M13接头正向引物标记上荧光基团，得到荧光标记的M13接头正向引物和M13接头正向引物；
3)以所述步骤1)中提取的待测样品DNA为模板，以反向引物、所述步骤2)获得的M13接头正向引物和荧光标记的M13荧光接头正向引物使用三引物法进行PCR扩增，得到荧光PCR扩增产物；
4)将所述步骤3)得到的荧光PCR扩增产物进行毛细管荧光电泳检测，读取毛细管电泳数据，统计条带检测结果；
5)利用所述步骤4)中的统计条带检测结果进行红三叶遗传多样性分析和种质遗传系谱分析；所述步骤1)和步骤2)之间没有时间顺序的限制。
优选的，步骤5)中所述红三叶遗传多样性分析和种质遗传系谱分析的方法，包括以下步骤：
A.根据所述步骤4)中条带检测结果，建立原始矩阵；
B.根据所述步骤A中的原始矩阵，统计SSR标记扩增产物的条带总数和多态性条带数；根据每对引物原始矩阵，利用POPGEN v1.32软件计算各引物对的Shannon信息多样性指数、期望杂合度He和多态信息含量指数PIC；
C.根据所述步骤A中的原始矩阵利用软件NTSYSpc2.0计算遗传相似系数并利用UPGMA方法构建聚类树状图。
优选的，所述建立原始矩阵的方法如下：将所述步骤4)中的条带检测结果进行比对、校正，按照扩增条带的分子量从大到小编号和读取，有扩增条带出现记为“1”，无条带出现记为“0”。
优选的，所述步骤3)中PCR扩增体系如下：1μL模板DNA、5μL的2×TaqPCR MasterMix、0.1μL浓度为10pmol/μL的正向引物、0.4μL浓度为10pmol/μL的反向引物、0.4μL浓度为10pmol/μL的带荧光M13正向引物，ddH2O补充至10μL。
优选的，所述PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，57.5～60℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；接着95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，共8个循环；最后72℃末端延伸10min。
优选的，所述步骤2)中荧光基团为HEX荧光基团。
优选的，所述步骤2)通用M13接头序列如序列表中SEQ ID No.17所示的核苷酸序列。
优选的，所述步骤1)中红三叶样品为红三叶幼嫩叶片。
本发明提供了一种用于红三叶遗传多样性分析的SSR引物组，包括8对引物至少两对。所述SSR引物组具有多态性丰富、扩增稳定、重复性好、便于统计等优点，能有效对红三叶种质资源进行遗传多样性分析及群体聚类分析。
附图说明
图1为图1红三叶遗传多样性的UPGMA聚类图；
图2为红三叶材料以引物RW-1扩增得到的毛细管荧光电泳检测峰图，其中图2-a表示材料CF022176扩增图谱，图2-b表示材料CF022177扩增图谱，图2-c表示材料CF022180扩增图谱，图2-d表示材料CF022186扩增图谱，图2-e表示材料CF022195扩增图谱。
具体实施方式
本发明提供了一种用于红三叶遗传多样性分析的SSR引物组，包括以下8对引物，引物对核苷酸序列信息及扩增目标片段大小见表1：
表1 红三叶8对SSR引物信息
在本发明中，所述SSR引物组的设计方法，优选包括以下步骤：
基于物种间引物的可转移性，利用已有白三叶转录组序列，使用软件MicroSatellite(MISA)(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)进行SSR位点扫描筛选，获得大量SSR位点；利用Primer 5.0软件对所述位点进行引物设计。
在本发明中，所述筛选的标准为：单碱基至少重复10次，2个碱基至少重复6次，3-6个碱基至少重复5次才被识别为SSR位点。本发明利用Primer5.0软件对这些位点进行引物设计，参数设定为：引物长度18-25nt，最适长度为21nt；引物退火温度为55-65℃，最优退火温度为60℃；PCR产物长度范围在80bp至500bp之间；GC含量在40％至60％之间，最优GC含量为50％。
从获得的SSR位点中随机挑选20对引物，并利用30个样本研究引物的扩增效率及多态性。本发明对所述扩增效率及多态性的方法没有任何限制，采用本领域所熟知扩增效率及多态性的方案即可。所述筛选的标准为：扩增效率高于80％，且等位基因≥3个。按该标准最终从20对引物对中筛选出8对扩增效果及多态性良好的引物对。
本发明对上述8对引物对的合成方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的合成方法即可。在本发明实施例中，所述引物对委托武汉天一辉远生物科技有限公司合成。
本发明提供了所述引物组在红三叶遗传多样性分析及种质资源遗传系谱分析中的应用。
在本发明中，所述红三叶遗传多样性分析及种质资源遗传系谱分析的方法，优选包括以下步骤：
1)提取待测红三叶样品基因组DNA；
2)每对引物的正向引物分别加上通用M13接头序列，得到M13接头正向引物，在所述M13接头正向引物标记上荧光基团，得到荧光标记的M13接头正向引物和M13接头正向引物；
3)以所述步骤1)中提取的待测样品基因组DNA为模板，以反向引物、所述步骤2)获得的M13接头正向引物和荧光标记的M13荧光接头正向引物使用三引物法进行PCR扩增，得到荧光PCR扩增产物；
4)将所述步骤3)得到的荧光PCR扩增产物进行毛细管荧光电泳检测，读取毛细管电泳数据，统计条带检测结果；
5)利用所述步骤4)中的统计条带检测结果进行红三叶遗传多样性分析和种质遗传系谱分析；所述步骤1)和步骤2)之间没有时间顺序的限制。
本发明提取待测红三叶样品基因组DNA。所述红三叶样品优选为红三叶幼嫩叶片。本发明对所述提取红三叶样品基因组DNA的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的植物基因组DNA的提取方法即可。
本发明每对引物的正向引物分别加上通用M13接头序列，得到M13接头正向引物，在所述M13接头正向引物标记上荧光基团，得到荧光标记的M13接头正向引物和M13接头正向引物。所述荧光基团优选为HEX荧光基团。所述通用M13接头序列如序列表中SEQ IDNo.17所示的核苷酸序列。
得到待测样品基因组DNA、M13接头正向引物和荧光标记的M13荧光接头正向引物后，本发明以提取的待测样品基因组DNA为模板，以反向引物、所述获得的M13接头正向引物和荧光标记的M13荧光接头正向引物使用三引物法进行PCR扩增，得到荧光PCR扩增产物。
在本发明中，所述PCR扩增体系优选如下：1μL模板DNA、5μL的2×TaqPCR MasterMix、0.1μL浓度为10pmol/μL的正向引物、0.4μL浓度为10pmol/μL的反向引物、0.4μL浓度为10pmol/μL的带荧光M13正向引物，ddH2O补充至10μL。所述PCR扩增的反应程序优选为：95℃预变性5min；95℃变性30s，57.5～60℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；接着95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，共8个循环；最后72℃末端延伸10min。
得到荧光PCR扩增产物后，本发明将所述荧光PCR扩增产物进行毛细管荧光电泳检测，读取毛细管电泳数据，统计条带检测结果。
在本发明中，所述毛细管荧光电泳检测的方法具体见文献(Lingli Xu,LiyanZeng,Baowen Liao(2014),Yang Zhong.Microsatellite markers for a mangrovespecies,Cerbera manghas,from South China.Conservation Genet Resour 6:45–48)，所述毛细管荧光电泳检测部分结果见图2。在本发明中，所述读取毛细管电泳数据优选利用利用GeneMarker v2.2.0读取样本片段大小及等位基因数目。
得到检测结果后，本发明利用所述统计条带检测结果进行红三叶遗传多样性分析和种质遗传系谱分析。所述红三叶遗传多样性分析和种质遗传系谱分析的方法，优选包括以下步骤：
A.根据所述步骤4)中条带检测结果，建立原始矩阵；
B.根据所述步骤A中的原始矩阵，统计SSR标记扩增产物的条带总数和多态性条带数；根据每对引物原始矩阵，利用POPGEN v1.32软件计算各引物对的Shannon信息多样性指数、期望杂合度He和多态信息含量指数PIC；
C.根据所述步骤A中的原始矩阵利用软件NTSYSpc2.0计算遗传相似系数并利用UPGMA方法构建聚类树状图。
在本发明中，所述建立原始矩阵的方法优选如下：将所述条带检测结果进行比对、校正，按照扩增条带的分子量从大到小编号和读取，有扩增条带出现记为“1”，无条带出现记为“0”。
在本发明中，优选用NTSYS-PC 2.10软件基于UPGMA法计算个体间的遗传距离。
在本发明中，优选用POPGEN v1.32软件计算各引物对的Shannon信息多样性指数(I)、期望杂合度(He)和多态信息含量指数(PIC)，利用软件NTSYSpc2.0计算遗传相似系数并利用UPGMA方法构建聚类树状图。
下面结合实施例对本发明提供的一种用于红三叶遗传多样性分析的SSR引物组及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
利用已有白三叶转录组序列，通过软件MicroSatellite(MISA)(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)进行EST-SSR位点扫描。筛选标准为：单碱基至少重复10次，2个碱基至少重复6次，3-6个碱基至少重复5次才被识别为SSR位点。获得了21602个EST-SSR位点，然后利用Primer 5.0软件对这些位点进行引物设计，参数设定为：引物长度18-25nt，最适长度为21nt；引物退火温度为55-65℃，最优退火温度为60℃；PCR产物长度范围在80bp至500bp之间；GC含量在40％至60％之间，最优GC含量为50％。最后成功设计出18549对SSR引物，本发明初步使用20对SSR引物，并利用30个样本研究引物的扩增效率及多态性，最终筛选出8对能稳定扩增出清晰且多态性条带的引物，其引物序列如表1所示。
实施例2
基于实施例1合成的SSR引物组可应用于红三叶遗传多样性分析，其分析方法包括如下步骤：
A、提取待测红三叶样品基因组DNA：
以30份红三叶材料验证开发的SSR标记有效性。红三叶材料信息见表2。样品为红三叶幼叶，每份材料只选取1个单株采集样品。
表2 红三叶材料信息
选取上述30份材料的健康嫩叶，采用改良的CTAB法提取基因组DNA，并用分光光度计及1％的琼脂糖凝胶电泳检测供试材料DNA浓度与纯度，将合格DNA样品置于-20℃条件下保存备用。
B、将序列表1所示每个引物的正向引物(F引物)加上通用M13接头序列“tgtaaaacgacggccagt(SEQ ID No.17)”，得到M13接头引物，另外再合成加HEX荧光基团的M13荧光接头引物；
C、以步骤A提取的待测样品DNA为模板，以反向引物、步骤B获得的M13接头引物和荧光基团的M13荧光接头引物使用三引物PCR法进行扩增，得到PCR扩增产物；所述PCR反应优化体系总体积为10μL，包括1μL模板DNA，5μL的2×Taq PCR Master Mix，0.1μL浓度为10pmol/μL的正向引物，0.4μL浓度为10pmol/μL的反向引物，0.4μL浓度为10pmol/μL的带荧光M13引物，余量为ddH2O。所述PCR扩增程序为：95℃预变性5min；然后95℃变性30s，57.5～60℃退火30s(每对引物的退火温度见表3)，72℃延伸30s，共30个循环；接着95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，共8个循环；最后72℃末端延伸10min，于4℃保存。
D、将步骤C得到的荧光PCR扩增产物使用DNA测序仪ABI3730x1进行毛细管荧光电泳检测，利用GeneMarker V2.2.0读取毛细管电泳数据，统计检测结果；
E、将步骤D得到的条带检测结果进行人工比对、校正，根据条带的有无，赋以“1”或“0”，缺失数据记为“-9”，建立“0,1”分子数据矩阵；根据分子数据矩阵，统计EST-SSR标记扩增产物的条带总数和多态性条带数；利用POPGEN v1.32软件计算各引物对的Shannon信息多样性指数(I)、期望杂合度(He)和多态信息含量指数(PIC)；利用NTSYS-PC 2.10软件计算遗传相似系数并基于UPGMA方法对红三叶样品个体进行聚类分析，构建得到UPGMA聚类树。
8对SSR引物对30份红三叶材料的扩增结果见表3。
表3 8对SSR多态性引物对红三叶材料扩增信息统计
由表3可知，8对引物对30份红三叶材料的位点有效个体数均超过24个，扩增效率达80％以上；共扩增出58条多态性谱带，每对引物平均等位基因数为7.25个，有效等位基因数的范围为1.884-5.663，其中引物RW-5扩增出10个等位基因，并且其有效等位基因数也为最高(5.663)，表明其有最高的多态性。Shannon信息多样性指数、期望杂合度和多态信息含量指数均是反映引物多态性的指标，其值越大说明多态性越高，三个指标的平均值分别为1.331、0.621和0.587，表明红三叶材料间遗传多样性十分丰富，以及本发明开发的EST-SSR引物组能应用于红三叶遗传多样性分析及种质系谱分析。从各个引物来看，引物RW-5具有最高的Shannon信息多样性指数、期望杂合度和多态信息含量指数，尤其多态信息含量指数达到0.804，说明该引物的扩增效果最好。
为进一步验证该引物组在红三叶遗传多样性中的应用，根据居群间的Nei’s遗传距离(其值越小表示遗传关系越近)，运用NTSYS-PC 2.10软件基于UPGMA法对30个红三叶样本进行聚类分析，结果见图1。红三叶材料间Nei’s遗传距离最近的两个材料分别是CF022233和CF022183，遗传距离为0.048；遗传关系最远的2个材料分别是CF022195和CF022176，其Nei’s遗传距离为0.397。在Nei’s遗传距离0.4处可将所有红三叶材料分为四大类：I、II、III和IV(图1)。第一大类(I)包括25份材料，几乎涵盖了所有来源国。这一大类内又可细分为四个小类(图1)，第1小类包括4个材料，第2小类包括19个材料，第3小类和第4小类各包括1份材料，分别来自美国和中国；第二大类(II)包括材料2份，分别来自波兰(CF022176)和俄罗斯(CF022195)；第三大类(III)包括2个材料，分别为CF022203和CF022180；第四大类只有1份材料(CF022217)，来自俄罗斯。
从图1的聚类分析的结果来看，来自同一国家的材料并没有聚类在一类，这是由于红三叶材料多为栽培品种，其育种材料的原始采集地并不一定是培育国，不同国家育成的不同品种可能其原始植株采集地相近。实际上，中国大部分红三叶品种都是由国外引进，比如我国20世纪80年代就引进三叶草品种近200个，在长期驯化过程中出现了丰富的性状变异。但是，对于一些欧洲地区的野生材料，来源地基本相同的材料能够聚为同一类，比如来自丹麦的野生材料CF022194和来自德国的CF022179被聚为一类，其Nei’s遗传距离为0.129，表明其较近的亲缘关系。来自中国的栽培品种“鄂牧5号”品种(编号为emu 5)是由湖北巴东地区采集的野生种培育而成，其单独构成1类，说明中国红三叶材料在经过长期的栽培驯化其多样性已经产生了分化，即使其来源于欧洲地区。可见，本发明所述的8对引物能够对这些红三叶材料进行有效区分和聚类，本引物组可以用于红三叶种质资源间的遗传多样性分析。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所
<120> 一种用于红三叶遗传多样性分析的SSR引物组及其应用
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcatggtctg ggacacttct aat 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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tgacgacatt ttctactacc gct 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tattggttgg atttggttat tgg 23
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ttgaatttct ttctttggtg acg 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
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<400> 6
acaacaacac agcacaacac act 23
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cctctttaat taatcacttc gcca 24
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<211> 23
<212> DNA
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<211> 23
<212> DNA
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<210> 10
<211> 23
<212> DNA
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tcacgttaac aatccaattc ttt 23
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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agaaagtcac agtctcccga gt 22
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aatcctatca gcaggtgaca aag 23
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
agttttgtag tgttggaagg ggt 23
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
aattcaaagc atgtgagtct tgg 23
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ttcttgcatc tcatcatctt cac 23
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tgtaaaacga cggccagt 18

Claims (10)

1.一种用于红三叶遗传多样性分析的SSR引物组，其特征在于，包括以下8对引物：
具有如序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的引物RW-1-F；
具有如序列表中SEQ ID No.2所示的核苷酸序列的引物RW-1-R；
具有如序列表中SEQ ID No.3所示的核苷酸序列的引物RW-2-F；
具有如序列表中SEQ ID No.4所示的核苷酸序列的引物RW-2-R；
具有如序列表中SEQ ID No.5所示的核苷酸序列的引物RW-3-F；
具有如序列表中SEQ ID No.6所示的核苷酸序列的引物RW-3-R；
具有如序列表中SEQ ID No.7所示的核苷酸序列的引物RW-4-F；
具有如序列表中SEQ ID No.8所示的核苷酸序列的引物RW-4-R；
具有如序列表中SEQ ID No.9所示的核苷酸序列的引物RW-5-F；
具有如序列表中SEQ ID No.10所示的核苷酸序列的引物RW-5-R；
具有如序列表中SEQ ID No.11所示的核苷酸序列的引物RW-6-F；
具有如序列表中SEQ ID No.12所示的核苷酸序列的引物RW-6-R；
具有如序列表中SEQ ID No.12所示的核苷酸序列的引物RW-7-F；
具有如序列表中SEQ ID No.14所示的核苷酸序列的引物RW-7-R；
具有如序列表中SEQ ID No.15所示的核苷酸序列的引物RW-8-F；
具有如序列表中SEQ ID No.16所示的核苷酸序列的引物RW-8-R。
2.权利要求1所述引物组在红三叶遗传多样性分析及种质资源遗传系谱分析中的应用。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述红三叶遗传多样性分析及种质资源遗传系谱分析的方法，包括以下步骤：
1)提取待测红三叶样品基因组DNA；
2)每对引物的正向引物分别加上通用M13接头序列，得到M13接头正向引物，在所述M13接头正向引物标记上荧光基团，得到荧光标记的M13接头正向引物和M13接头正向引物；
3)以所述步骤1)中提取的待测样品DNA为模板，以反向引物、所述步骤2)获得的M13接头正向引物和荧光标记的M13荧光接头正向引物使用三引物法进行PCR扩增，得到荧光PCR扩增产物；
4)将所述步骤3)得到的荧光PCR扩增产物进行毛细管荧光电泳检测，读取毛细管电泳数据，统计条带检测结果；
5)利用所述步骤4)中的统计条带检测结果进行红三叶遗传多样性分析和种质遗传系谱分析；所述步骤1)和步骤2)之间没有时间顺序的限制。
4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，步骤5)中所述红三叶遗传多样性分析和种质遗传系谱分析的方法，包括以下步骤：
A.根据所述步骤4)中条带检测结果，建立原始矩阵；
B.根据所述步骤A中的原始矩阵，统计SSR标记扩增产物的条带总数和多态性条带数；根据每对引物原始矩阵，利用POPGEN v1.32软件计算各引物对的Shannon信息多样性指数、期望杂合度He和多态信息含量指数PIC；
C.根据所述步骤A中的原始矩阵利用软件NTSYSpc2.0计算遗传相似系数并利用UPGMA方法构建聚类树状图。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述建立原始矩阵的方法如下：将所述步骤4)中的条带检测结果进行比对、校正，按照扩增条带的分子量从大到小编号和读取，有扩增条带出现记为“1”，无条带出现记为“0”。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤3)中PCR扩增体系如下：1μL模板DNA、5μL的2×TaqPCR MasterMix、0.1μL浓度为10pmol/μL的正向引物、0.4μL浓度为10pmol/μL的反向引物、0.4μL浓度为10pmol/μL的带荧光M13正向引物，ddH2O补充至10μL。
7.根据权利要求3或6所述应用，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，57.5～60℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；接着95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，共8个循环；最后72℃末端延伸10min。
8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤2)中荧光基团为HEX荧光基团。
9.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤2)通用M13接头序列如序列表中SEQ ID No.17所示的核苷酸序列。
10.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤1)中红三叶样品为红三叶幼嫩叶片。
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