CN104878114A - 滇鸡血藤药材分子身份证 - Google Patents

Abstract

本发明公开了滇鸡血藤药材DNA条形码标准序列和滇鸡血藤药材快速分子鉴定的方法，其特征在于所述DNA条形码标准检测基因为叶绿体trnH-psbA基因，具有基因序列SEQ ID NO.1。该方法可以为滇鸡血藤药材提供分子身份证，从而对其进行准确快速的鉴定。该方法主要流程包括：滇鸡血藤实验样本首先由形态学专家鉴定，DNA分离提取及PCR扩增、测序，测序结果通过手工校对、序列拼接，所得序列与对照药材的序列进行比对，以确保结果的可靠性。本发明采用传统的形态学鉴定与分子鉴定相结合，可确保物种鉴定的准确性和可靠性。本发明提供的滇鸡血藤的DNA条形码标准基因序列及方法能够实现滇鸡血藤药材的快速准确鉴定，缩短鉴定时间。

Description

滇鸡血藤药材分子身份证

技术领域

本发明涉及中药材物种鉴定领域，具体涉及滇鸡血藤药材DNA条形码标准序列，为滇鸡血藤药材提供分子身份证。

背景技术

《中华人民共和国药典》2010年版收载滇鸡血藤Kadsurae Caulis为木兰科植物内南五味子Kadsura interior A.C.Smith的干燥藤茎。《中国植物志》将其记录为凤庆南五味子，产于云南西南部(保山、凤庆、临沧、耿马)。性苦、甘，温。归肝、肾经。具有活血补血，调经止痛，舒筋通络的功效。可用于月经不调，痛经，麻木瘫痪，风湿痹痛，气血虚弱，为传统中成药复方滇鸡血藤膏的君药成分。由于本草记载差异和不同地区使用习惯的不同，中药的学名、别名繁多混乱，出现异药同名和同名异药的现象。如《本草纲目拾遗》和《植物名实图考》中将滇鸡血藤收载为“鸡血藤”。有些地区将滇鸡血藤、鸡血藤、大血藤等多种含有红色树脂的藤茎均称之为“血藤”。而来源不同的药材，具有不尽相同的功效主治，药材的误用或混用，会造成“病准，方对，药不灵”的现象，影响中医临床疗效，延误中医治疗，甚至损害患者健康。为保证滇鸡血藤的质量，保障用药安全、有效，我们需要对其物种和资源进行准确鉴定。

DNA条形码分子鉴定法是利用基因组中一段公认的、相对较短的DNA序列来进行物种鉴定的一种分子生物学技术，它摆脱了传统形态鉴定方法依赖长期经验的障碍，具有鉴定结果可重复性良好；方法通用性强；可构建统一数据库和鉴定平台，易于推广和标准化等优势。可作为传统形态鉴别方法的有效补充。目前GenBank中未见到滇鸡血藤相关基因序列。本发明提供的滇鸡血藤DNA条形码标准序列，能够为滇鸡血藤药材提供分子身份证，有利于实现滇鸡血藤的快速准确鉴定。

发明内容

本发明的目的在于提供滇鸡血藤药材的DNA条形码标准基因序列，为其物种和资源的鉴定研究提供快速准确的方法。

为实现上述目的，本发明可通过如下技术方案实现：一种滇鸡血藤药材标准检测序列叶绿体trnH-psbA序列，具有如下所述的基因序列SEQ ID NO.1：

所述的滇鸡血藤药材DNA条形码标准检测基因的PCR引物序列，叶绿体trnH-psbA引物序列为：

正向引物PA：5′-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3′，

反向引物TH：5′-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3′。

本发明提供的滇鸡血藤药材快速鉴定方法，包括如下步骤：

1)从待测滇鸡血藤药材组织中分离提取总DNA；

2)以该DNA为模板，用上述引物，通过聚合酶链式反应扩增出目标基因；

3)取适量步骤2)中获得的PCR产物，用琼脂糖凝胶电泳分离检测，溴乙锭染色后于凝胶成像系统检测，叶绿体trnH-psbA序列PCR产物应在约400bp处出现一条目的条带，阴性对照应无条带；

4)对扩增产物进行测序，测序峰图经校对拼接，去除引物区和低质量区；

5)根据测序结果，如果与上述基因序列SEQ ID NO.1的同源性在99％以上，即可判断所述的检测样品为滇鸡血藤。

本发明可用琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。

本发明首次公布了滇鸡血藤叶绿体trnH-psbA序列，填补了GenBank中滇鸡血藤相关基因序列的空白。

与传统的形态学鉴定、理化鉴定等方法相比，本发明获得的基因序列有助于实现滇鸡血藤的快速鉴定，缩短鉴定时间。当缺乏专业鉴定人员，或当中药材形态学缺失时，仍然能够实现准确鉴定。

附图说明

图1所示为滇鸡血藤药材叶绿体trnH-psbA序列PCR扩增结果电泳鉴定图，编号说明如下：泳道1-6均为滇鸡血藤药材，7为滇鸡血藤对照药材，检出大小为约400bp的条带，M为AL2000的DNA marker，CK为阴性对照；

图2所示为滇鸡血藤药材叶绿体trnH-psbA序列的测序峰图(部分)。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例

1.滇鸡血藤样本的收集

滇鸡血藤药材样本6份，来自云南耿马。对照药材1份，购自中国食品药品检定研究院。

2.滇鸡血藤药材DNA的提取

用75％乙醇擦拭药材表面，取药材约40mg，用DNA提取研磨仪(Retsch MM400，Germany)研磨2min(30次/秒)后，用植物基因组DNA提取试剂盒(Tiangen Biotech Co.，China)提取总DNA，56℃水浴过夜，其余步骤按照试剂盒说明进行。DNA存于-20℃备用。

3.PCR扩增

叶绿体trnH-psbA引物序列为PA：5′-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3′，TH：5′-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3′。由生工生物工程公司有限公司(北京)合成。引物用灭菌双蒸水溶解并稀释至2.5μmol/L。

PCR反应体积为25μL，体系内含2×Tag PCR Master Mix 12.5μL、引物各1.0μL(2.5μmol/L)、dd H₂O 8.5μL、总DNA约2μL。

PCR反应程序：叶绿体trnH-psbA引物序列在PCR仪上按照以下程序进行扩增反应：

PCR产物短期保存于4℃，长期应保存于-20℃。

4.PCR扩增产物检测

采取琼脂糖凝胶电泳方法检测PCR产物。120v电压，电泳40min，溴乙锭染色。凝胶成像系统检测，叶绿体trnH-psbA序列PCR产物应在约400bp处出现一条目的条带，阴性对照应无条带。电泳图参见图1。

5.测序

将有目的条带的PCR产物直接送中国农业科学院重大工程实验室测序。测序引物同PCR引物。为确保DNA条形码序列的可靠性，需要进行正反向测序或重复测序，然后将正反向测序结果进行拼接获得DNA条形码序列。

6.滇鸡血藤药材DNA序列获得

(1)序列拼接

对双向测序峰图应用有序列拼接功能的专业软件进行序列拼接，去除引物区。

(2)序列质量与方向

为确保DNA条形码序列的可靠性，需去除测序结果两端信号弱或重叠峰区域，序列方向应与PCR扩增正向引物方向一致，获得相应的DNA序列。

滇鸡血藤药材叶绿体trnH-psbA序列具有如下所述的基因序列SEQ ID NO.1：

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.滇鸡血藤药材DNA条形码标准检测基因，其特征在于所述条形码标准检测基因为叶绿体trnH-psbA序列，具有如下所述的基因序列SEQ ID NO.1：

2.权利要求1所述的滇鸡血藤药材DNA条形码标准检测基因的PCR引物，其特征在于叶绿体trnH-psbA引物序列为：

正向引物PA：5′-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3′，

反向引物TH：5′-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3′。

3.一种滇鸡血藤药材的快速分子鉴定方法，包括：

1)从待测滇鸡血藤药材组织中分离提取总DNA

2)以该DNA为模板，用上述引物，通过聚合酶链式反应扩增出目标基因；

3)取适量步骤2)中获得的PCR产物，用琼脂糖凝胶电泳分离检测，溴乙锭染色后于凝胶成像系统检测，叶绿体trnH-psbA序列PCR产物应在约400bp处出现一条目的条带，阴性对照应无条带；

4)对扩增产物进行测序，测序峰图经校对拼接，去除引物区和低质量区；

5)根据测序结果，如果与上述基因序列SEQ ID NO.1的同源性在99％以上，即可判断所述的检测样品为滇鸡血藤。