CN104593365A - 一种用于鱼腥草分子鉴定的dna条形码,引物、试剂盒和鉴定方法 - Google Patents
一种用于鱼腥草分子鉴定的dna条形码,引物、试剂盒和鉴定方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种用于鱼腥草分子鉴定的DNA条形码，引物、试剂盒和鉴定方法。该方法通过鱼腥草植物及其主要混伪品DNA提取，然后利用DNA条形码引物进行PCR扩增，扩增出的片段按照核苷酸序列特征变异位点进行物种鉴别。该方法可用于鱼腥草和混伪品白苞裸蒴无法从形态上加以识别的种间鉴定，而且本发明操作简单、结果可靠、检测速度快速、不受植株生长发育时期和环境的影响，可大大提高鉴定效率。
Description
技术领域
本发明属于植物分子生物学领域，特别涉及一种用于鱼腥草分子鉴定的DNA条形码，引物、试剂盒和鉴定方法。
背景技术
鱼腥草(Houttuynia cordata Thunb)属三白草科蕺菜属，是宿根性多年生草本植物。俗称有侧耳根、猪鼻孔、臭草、芩草等，因其茎叶搓碎后有鱼腥味，故名鱼腥草。鱼腥草不仅可以嫩茎叶和地下茎作蔬菜食用，而且全株又可鲜用或晒干入药，它已经被国家卫生部正式确定为“既是药品，又是食品”的极具开发潜力的资源之一，日益受到人们的关注。
因国内外对鱼腥草的需求急剧增加，使其货源供应不足，各地曾一度出现混淆品，少数不法分子掺伪作假、以伪乱真，兜售假药以牟取暴利，加之有些参与药材流通的人员缺乏必要的鉴别知识或经验不足，使鱼腥草混伪品进入商品流通渠道，严重影响了药材质量和临床疗效。由于白苞裸蒴的外形与鱼腥草很相似(图1)，因此是目前市场上常见的鱼腥草混伪品。
以往大都以地上茎、地下茎和叶片等形态差异和解剖学特征，有时结合理化分析来鉴别鱼腥草及其混伪品，但以上鉴定方法一是非长期从事该工作的人员不能胜任原植物和药品的鉴定工作；二是费时费力，且准确鉴定存在一定难度。近年来，随着分子生物学技术的发展，体现物种遗传本质的DNA分子已成为物种鉴定的有效分析手段。目前通过DNA分子特征对鱼腥草植物进行分类学鉴定的研究报道缺少真伪品的核苷酸差异比较信息，不能提供可靠的分子鉴别数据。DNA条形码是利用基因组中一段公认标准的DNA片段来对物种进行准确鉴定的新技术，它具有操作简便、准确、快速的优势，不受样品发育阶段(叶片、种子、花等)、药材形态(原药材或粉末)以及研究者专业水平的限制，具有较强的通用性。
发明内容
本发明的目的是克服现有检测技术中存在的缺陷，从分子水平提供一种用于鱼腥草分子鉴定的DNA条形码，引物、试剂盒和鉴定方法。本发明将加速分子标记辅助选择在鱼腥草及其混伪品鉴定方法的应用。
一种用于鱼腥草分子鉴定的DNA条形码，序列如SEQ NO:1。
一种用于鱼腥草分子鉴定的引物，序列如下：
正向序列F：GGAAGTAAAAGTAACAAGG，
反向序列R：TCCTTCCGCTTATTGATATGC。
一种用于鱼腥草分子鉴定的试剂盒，包括上所述的引物，以及进行PCR反应所需的各种试剂。
PCR反应所需的各种试剂包括：10×Buffer、dNTP、MgCl2、TaqDNA聚合酶。
所述的用于鱼腥草分子鉴定的试剂盒还包括测序试剂。
一种用于鱼腥草分子鉴定的方法：该方法用于区分鱼腥草与白苞裸蒴，以上述的核酸分子为引物，以待检测样品的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，分别扩增出642bp和626bp大小的DNA片段，序列如SEQ NO:1和NO:2；将扩增出来的片段进行测序：
鱼腥草在位点4上的碱基为A，位点5上的碱基为T，位点36上的碱基为C，位点41上的碱基为A，位点46-48上的碱基为TCG，位点56-57上的碱基都为GG，位点67-68上的碱基为CC，位点71上的碱基为G，位点76-78上的碱基为CCA，位点84-86上的碱基为CCC，位点96-97上的碱基为GA，位点102-103上的碱基为CG，位点107-108上的碱基为GA，位点111上的碱基为C，在位点131上的碱基为G，位点136-138上的碱基为ATT，位点141-143上的碱基为CCA，位点155上的碱基为A，位点159上的碱基为C，位点170上的碱基都为C，位点176上的碱基为G，位点185-186上的碱基为CG，位点208上的碱基为C，位点376-377上的碱基为GC，位点383-384上的碱基为GA，位点392-393上的碱基为CC，位点396-398上的碱基为GCC，位点405-407上的碱基为GAG，位点414-415上的碱基为CT，位点423-424上的碱基为GG，位点429-430上的碱基为GT，位点433-437上的碱基为GACGT，位点443上的碱基为G，位点448上的碱基为A，位点452-455上的碱基为CCCT，位点462上的碱基为C，位点465-467上的碱基为CCG，位点474上的碱基为T，位点482上的碱基为A，位点495上的碱基都为C，位点508上的碱基为G，位点515-516上的碱基为GT，位点523-524上的碱基为GA，位点530上的碱基为G，位点532上的碱基为A，位点539上的碱基为G，位点554上的碱基为C，位点562-563上的碱基为AC，位点565-567上的碱基为AGC，位点572上的碱基为T，在位点576-578上的碱基为ATA，位点581上的碱基为C，位点592上的碱基为G，位点595上的碱基为C，位点597上的碱基为A，位点600上的碱基都为G；而白苞裸蒴在位点4上的碱基为C，位点5上的碱基为C，位点36上的碱基为G，位点41上的碱基为G，位点46-48上的碱基为GTC，位点56-57上的碱基都为AT，位点67-68上的碱基为GT，位点71上的碱基为T，位点76-78上的碱基为GTG，位点84-86上的碱基为ATG，位点96-97上的碱基为CT，位点102-103上的碱基为TA，位点107-108上的碱基为AT，位点111上的碱基为A，在位点131上的碱基为A，位点136-138上的碱基为CCC，位点141-143上的碱基为TCC，位点155上的碱基为C，位点159上的碱基为T，位点170上的碱基都为T，位点176上的碱基为C，位点185-186上的碱基为AC，位点208上的碱基为T，位点376-377上的碱基为TA，位点383-384上的碱基为CG，位点392-393上的碱基为AG，位点396-398上的碱基为TTG，位点405-407上的碱基为CCC，位点414-415上的碱基为GG，位点423-424上的碱基为TT，位点429-430上的碱基为CC，位点433-437上的碱基为ACGTG，位点443上的碱基为T，位点448上的碱基为C，位点452-455上的碱基为TTGC，位点462上的碱基为T，位点465-467上的碱基为GTA，位点474上的碱基为C，位点482上的碱基为G，位点495上的碱基都为T，位点508上的碱基为A，位点515-516上的碱基为AC，位点523-524上的碱基为CC，位点530上的碱基为A，位点532上的碱基为C，位点539上的碱基为A，位点554上的碱基为G，位点562-563上的碱基为GA，位点565-567上的碱基为CCG，位点572上的碱基为G，在位点576-578上的碱基为GCC，位点581上的碱基为T，位点592上的碱基为T，位点595上的碱基为G，位点597上的碱基为C，位点600上的碱基都为A。
PCR体系包括10×Buffer、0.25mmol/L dNTP、2.5mmol/L MgCL2、0.2U TaqDNA聚合酶、50ng模板DNA、引物0.2μmol/L。
PCR反应条件：97℃预变性4min→30个循环：依次包括：94℃变性1min、50℃退火1min和72℃延伸1min→72℃延伸7min。
测序方法：
采用5μL的反应体系，包括：1μL的测序mix，0.5μL的引物(即PCR反应所用引物)，1μL的PCR纯化产物和2.5μL的双蒸水；
反应程序为：95℃预变性4min→33个循环：依次包括96℃变性10s、50℃退火5s和60℃延伸4min。
测序反应产物经95％乙醇+乙酸钠沉淀，之后用70％乙醇、无水乙醇洗涤，干燥后加入20μL的双蒸水充分溶解，经95℃变性4min后上样，进行测序。
与传统技术相比，本发明所提供的检测方法，①克服了现有技术用感官难以鉴别鱼腥草原料的真伪；②通过建立的鱼腥草DNA条形码，能轻易地将鱼腥草与白苞裸蒴区分开来；③采用鱼腥草DNA的ITS片段为目标片段，能够准确的用于鱼腥草植物的鉴定；④通过对鱼腥草DNA的ITS片段的PCR测序分析，发现鱼腥草与白苞裸蒴在序列位点上存在稳定的差异，完全可以区分它们，因而本发明能准确地鉴定出鱼腥草植物。本发明不仅是首先利用基因工程中分子标记的方法鉴定鱼腥草植物，而且检测的方法简便、可靠、速度快、不受植株生长发育时期和环境的影响等特点，在苗期就可进行早期鉴定，大大提高了鉴定效率。
附图说明
图1为鱼腥草植物与其混伪品白苞裸蒴的形态比较；鱼腥草植物(右)与其混伪品白苞裸蒴(左)的形态比较；
图2为引物对样品材料的扩增结果。
具体实施方式
以下实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。
实施例1：本发明方法实施的过程
(1)样品材料的准备：分别取鱼腥草和白苞裸蒴幼嫩叶片10g左右。
(2)基因组DNA的提取：利用CTAB法提取基因组DNA，将冷冻干燥的烟草叶片研磨成粉末，加入65℃预热的CTAB抽提液，65℃保温45min以上，间或轻摇混匀→12000r/min室温离心20min后取上清液→加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)，轻轻混匀15min以上，12000r/min室温离心20min，取上清液移入新离心管中→加入预冷的异丙醇，轻轻摇动5min，8000r/min室温离心10min后去上清→沉淀用75％乙醇和10mmol/L KAC抽提2～3次(每次8000r/min室温离心10min)→加入预冷的95％乙醇，轻轻上下颠倒，12000r/min室温离心20min后弃乙醇，真空抽干或自然晾干→加入200uL TE buffer，轻轻敲打使沉淀溶解→加入1ul 10mg/mL RNAse 37℃水浴，保温1h，去除RNA→DNA提取物放于-20℃冰箱中贮藏备用。
(3)PCR扩增：以叶片基因组DNA为模板进行SCAR-PCR扩增，PCR体系包括10×Buffer、0.25mmol/L dNTP、2.5mmol/L MgCL2、0.2U TaqDNA聚合酶、50ng模板DNA、随机引物0.2μmol/L。PCR反应条件：97℃预变性4min→(94℃变性1min→50℃退火1min→72℃延伸1min)30个循环→72℃延伸7min。其中所用引物：
正向序列F：GGAAGTAAAAGTAACAAGG，
反向序列R：TCCTTCCGCTTATTGATATGC。
(4)电泳检测：扩增后的产物进行电泳检测，扩增出约650bp左右的条带。
(5)测序：扩增引物同时作为测序引物，测序反应在PE9600PCR仪上进行，反应体系：1μL测序mix，0.5μL引物，1μL PCR纯化产物和2.5μL双蒸水。反应程序为：95℃预变性4min→(96℃变性10s→50℃退火5s→60℃延伸4min)共33个循环。反应产物经95％乙醇+乙酸钠沉淀，之后用70％乙醇、无水乙醇洗涤，干燥后加入20μL的双蒸水充分溶解，经95℃变性4min后上样，在ABI3700型自动测序仪上进行检测。
实施例2：本发明方法实施后两种材料DNA条形码序列长度与同源性的对比
应用引物对两种材料进行PCR扩增，得到鱼腥草和混伪品白苞裸蒴DNA条形码序列长度分别为642bp和626bp(图2)。鱼腥草5.8S rDNA147bp，ITS1spacer223bp，ITS2spacer272bp；混伪品白苞裸蒴5.8s rDNA147bp，ITS1spacer223bp，ITS2spacer256bp。
DNA条形码同源性比较结果表明，鱼腥草和混伪品白苞裸蒴的ITS、5.8s rDNA、ITS1spacer和ITS2spacer的同源性分别为84.66％、100.00％、82.51％和77.73％，其ITS1spacer和ITS2spacer对应的差异性分别为17.49％和22.27％，同源性分析表明两物种的亲缘关系相近，但也存在一定的差异(表1)。因此DNA条形码可以用作鱼腥草和混伪品白苞裸蒴的种间鉴定。
表1鱼腥草和混伪品白苞裸蒴DNA条形码序列长度及同源性比较
鱼腥草植物与其混伪品白苞裸蒴的DNA条形码比对
1.上行为鱼腥草，下行为白苞裸蒴；2.带下划线的为5.8S rDNA序列，下划线之前的为ITS1序列，下划线之后的为ITS2序列；3.灰色底纹为两个材料差异性碱基。
Claims (10)
1.一种用于鱼腥草分子鉴定的DNA条形码，其特征在于，序列如SEQ NO:1。
2.一种用于鱼腥草分子鉴定的引物，其特征在于，序列如下：
正向序列F：GGAAGTAAAAGTAACAAGG，
反向序列R：TCCTTCCGCTTATTGATATGC。
3.一种用于鱼腥草分子鉴定的试剂盒，其特征在于，包括权利要求2所述的引物，以及进行PCR反应所需的各种试剂。
4.根据权利要求3所述的用于鱼腥草分子鉴定的试剂盒，其特征在于：PCR反应所需的各种试剂包括：10×Buffer、dNTP、MgCl2、TaqDNA聚合酶。
5.根据权利要求3或4所述的用于鱼腥草分子鉴定的试剂盒，其特征在于：还包括测序试剂。
6.一种用于鱼腥草分子鉴定的方法，其特征在于：该方法用于区分鱼腥草与白苞裸蒴，以权利要求2所述的核酸分子为引物，以待检测样品的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，
分别扩增出642bp和626bp大小的DNA片段，序列如SEQ NO:1和NO:2；将扩增出来的片段进行测序：
鱼腥草在位点4上的碱基为A，位点5上的碱基为T，位点36上的碱基为C，位点41上的碱基为A，位点46-48上的碱基为TCG，位点56-57上的碱基都为GG，位点67-68上的碱基为CC，位点71上的碱基为G，位点76-78上的碱基为CCA，位点84-86上的碱基为CCC，位点96-97上的碱基为GA，位点102-103上的碱基为CG，位点107-108上的碱基为GA，位点111上的碱基为C，在位点131上的碱基为G，位点136-138上的碱基为ATT，位点141-143上的碱基为CCA，位点155上的碱基为A，位点159上的碱基为C，位点170上的碱基都为C，位点176上的碱基为G，位点185-186上的碱基为CG，位点208上的碱基为C，位点376-377上的碱基为GC，位点383-384上的碱基为GA，位点392-393上的碱基为CC，位点396-398上的碱基为GCC，位点405-407上的碱基为GAG，位点414-415上的碱基为CT，位点423-424上的碱基为GG，位点429-430上的碱基为GT，位点433-437上的碱基为GACGT，位点443上的碱基为G，位点448上的碱基为A，位点452-455上的碱基为CCCT，位点462上的碱基为C，位点465-467上的碱基为CCG，位点474上的碱基为T，位点482上的碱基为A，位点495上的碱基都为C，位点508上的碱基为G，位点515-516上的碱基为GT，位点523-524上的碱基为GA，位点530上的碱基为G，位点532上的碱基为A，位点539上的碱基为G，位点554上的碱基为C，位点562-563上的碱基为AC，位点565-567上的碱基为AGC，位点572上的碱基为T，在位点576-578上的碱基为ATA，位点581上的碱基为C，位点592上的碱基为G，位点595上的碱基为C，位点597上的碱基为A，位点600上的碱基都为G；而白苞裸蒴在位点4上的碱基为C，位点5上的碱基为C，位点36上的碱基为G，位点41上的碱基为G，位点46-48上的碱基为GTC，位点56-57上的碱基都为AT，位点67-68上的碱基为GT，位点71上的碱基为T，位点76-78上的碱基为GTG，位点84-86上的碱基为ATG，位点96-97上的碱基为CT，位点102-103上的碱基为TA，位点107-108上的碱基为AT，位点111上的碱基为A，在位点131上的碱基为A，位点136-138上的碱基为CCC，位点141-143上的碱基为TCC，位点155上的碱基为C，位点159上的碱基为T，位点170上的碱基都为T，位点176上的碱基为C，位点185-186上的碱基为AC，位点208上的碱基为T，位点376-377上的碱基为TA，位点383-384上的碱基为CG，位点392-393上的碱基为AG，位点396-398上的碱基为TTG，位点405-407上的碱基为CCC，位点414-415上的碱基为GG，位点423-424上的碱基为TT，位点429-430上的碱基为CC，位点433-437上的碱基为ACGTG，位点443上的碱基为T，位点448上的碱基为C，位点452-455上的碱基为TTGC，位点462上的碱基为T，位点465-467上的碱基为GTA，位点474上的碱基为C，位点482上的碱基为G，位点495上的碱基都为T，位点508上的碱基为A，位点515-516上的碱基为AC，位点523-524上的碱基为CC，位点530上的碱基为A，位点532上的碱基为C，位点539上的碱基为A，位点554上的碱基为G，位点562-563上的碱基为GA，位点565-567上的碱基为CCG，位点572上的碱基为G，在位点576-578上的碱基为GCC，位点581上的碱基为T，位点592上的碱基为T，位点595上的碱基为G，位点597上的碱基为C，位点600上的碱基都为A。
7.根据权利要求6所述的用于鱼腥草分子鉴定的方法，其特征在于：
PCR体系包括10×Buffer、0.25mmol/L dNTP、2.5mmol/L MgCL2、0.2U TaqDNA聚合酶、50ng模板DNA、引物0.2μmol/L。
8.根据权利要求6或7所述的用于鱼腥草分子鉴定的方法，其特征在于：
PCR反应条件：97℃预变性4min→30个循环：依次包括：94℃变性1min、50℃退火1min和72℃延伸1min→72℃延伸7min。
9.根据权利要求6或7所述的用于鱼腥草分子鉴定的方法，其特征在于：
测序方法：
采用5μL的反应体系，包括：1μL的测序mix，0.5μL的引物，1μL的PCR纯化产物和2.5μL的双蒸水；
反应程序为：95℃预变性4min→33个循环：依次包括96℃变性10s、50℃退火5s和60℃延伸4min。
10.根据权利要求9所述的用于鱼腥草分子鉴定的方法，其特征在于：
测序反应产物经95％乙醇+乙酸钠沉淀，之后用70％乙醇、无水乙醇洗涤，干燥后加入20μL的双蒸水充分溶解，经95℃变性4min后上样，进行测序。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
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Granted publication date: 20170922 Termination date: 20200115 |