CN111621514A - 一种利用水稻内源序列的RNAi植物表达载体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种利用水稻内源序列的RNAi植物表达载体及其应用，以及一种干扰植物细胞色素P450基因CYP81A6表达的方法和获得除草剂显性敏感植物的方法。将本发明的RNAi植物表达载体转化水稻，能够成功抑制基因CYP81A6的表达，并将水稻从对除草剂具有抗性转变为敏感，使得敏感植株可以通过施用除草剂的方式被清除，从而培育了一种对除草剂显性敏感的水稻。该水稻在培育转基因新品种，杂交水稻制种，防止转基因逃逸等方面具有重要的应用价值。

Description

一种利用水稻内源序列的RNAi植物表达载体及其应用
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种利用水稻内源序列的RNAi植物表达载体和其构建方法和应用。
背景技术
农作物杂种优势利用是农业增产重要手段之一。水稻是全世界最重要的粮食作物之一，具有明显的杂种优势。中国是世界上首个成功实现杂交水稻商品化生产的国家，杂交水稻使我国水稻产量提高了20％，全国杂交水稻常年种植面积已超过水稻年播种面积的50％。“三系法”和“两系法”是目前杂交水稻制种的主要方法，但由于三系核质互作的基因型限制及两系的光温敏在特殊条件下的不稳定，杂交水稻产业的发展已受到制约。美国先锋公司的SPT技术利用转基因技术成功解决了杂交制种中的一系列问题，并于2012年在玉米中实现商业化应用，水稻杂交制种也极有可能利用类似SPT技术实现更新换代。同时，转基因技术在各种农作物领域的应用越来越广泛。然而转基因产品自诞生之日起产生的争议，至今仍甚嚣尘上。因此，转基因产品需要加以严格的控制和监管，防止转基因漂移污染其他品种甚至其他物种就显得尤为重要。因此，需要建立一种能够定向清除杂交种子或转基因植株的机制。培育获得除草剂敏感的不育系是解决问题的有效手段之一。
苯达松(bentazon)是一种苯并噻二唑类除草剂，属杂环类选择性化学除草剂，多数阔叶类杂草和莎草科杂草对苯达松敏感，而包括水稻在内的禾本科和豆科植物则对其有较强的耐药性，苯达松具有广谱，高效，低毒的特性。因此，苯达松用于清除稻田的阔叶类杂草和莎草科杂草十分有效，而对水稻又十分安全(张集文(2010)水稻苯达松敏感突变研究进展.中国水稻科学24:551-558)。水稻对苯达松抗性由一个单隐性基因细胞色素P450(CYP81A6)控制，该基因位于水稻第3号染色体上，参与苯达松在植物体内的羟基化脱毒过程。苯达松敏感型突变体“Norin 8m”、“M8077S”、“嘉浙mB”、“GZ mlS”和“GZ m2S”等都是由于CYP81A6基因突变造成的。CYP81A6基因的突变，导致上述突变体无法在体内降解苯达松，从而导致喷施苯达松除草剂时，植物死亡。同时，该细胞色素P450也是磺酰脲类除草剂的作用靶标，包含CYP81A 6突变基因或苯达松敏感的植物，在喷施磺酰脲类除草剂时，也会导致死亡。
因此，开发出一种能够有效显性影响水稻细胞色素P450(CYP81A6)表达的技术手段，可为杂交水稻制种、培育转基因新品种、防止转基因逃逸等方面提供有效管控方案。RNA干扰技术(RNAi技术)可达到显性抑制基因表达的目的。RNAi典型结构由茎和环组成，具体为两段反向互补的序列形成茎及两段反向互补序列之间的一段间隔序列形成环，其互补的茎结构为靶基因位点序列，其环序列理论上可以为任何与茎序列不相关的序列，但实际应用中发现不同茎、不同环其干扰效率差异非常大。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够有效的影响水稻细胞色素P450(CYP81A6)表达的植物表达载体及其构建方法：
为达到以上目的，本发明提供了一种抑制细胞色素P450基因表达的RNAi植物表达载体，含有发卡结构表达盒，其中所述发卡结构表达盒含有由SEQ ID No.1-3所示的DNA片段所形成的发卡结构。
其中，SEQ ID No.1所示的DNA片段为基于CYP81A6编码框的长度为258bp的正向DNA片段，SEQ ID No.3所示的DNA片段为基于CYP81A6编码框的长度为258bp的与SEQ IDNo.1所示的DNA片段反向互补的DNA片段。SEQ ID No.2为来自水稻CYP81A6基因的内含子。
SEQ ID No.1至3所示的DNA片段按照从上游到下游的方向依次排列。该发夹表达盒可在转化的植物细胞中转录形成发卡式的二级结构，SEQ ID No.2所示的DNA片段形成发卡的“环”，SEQ ID No.1和3所示的DNA片段互补形成发卡的“茎”。
其中，所述发卡结构表达盒还包括位于发卡结构上游的植物组成型启动子或植物组织特异性启动子，以及，位于发卡结构下游的终止子。
其中所述植物组成型启动子为水稻或玉米的Ubi启动子、CAMV 35S启动子或Actin启动子；所述植物组织特异性启动子为Rubisco小亚基启动子或Cab启动子。优选的，当启动子为水稻或玉米的Ubi启动子时，能够取得非常强的干扰CYP81A6基因表达的效果。
所述终止子包括：NOS终止子，Ubi终止子等在植物中可以终止基因转录的DNA序列。优选的，所述终止子为NOS终止子。
所述RNAi植物表达载体还包括选择标记表达盒，所述选择标记表达盒含有启动子、标记基因和终止子，其中所述启动子为水稻或玉米的Ubi启动子，CAMV 35S启动子或Actin启动子，优选的，当启动子为CAMV 35S启动子时，能够取得良好的驱动选择标记基因在植物中超量表达的效果。所述终止子为NOS终止子或Ubi终止子，优选为NOS终止子。
所述标记基因为可产生颜色变化的酶的基因(如GUS基因、荧光素酶基因等)、荧光标记基因(如荧光蛋白基因)、抗生素标记基因(可供筛选的抗生素标记如潮霉素、庆大霉素、卡那霉素基因)、除草剂筛选标记基因(如抗草甘膦基因、抗双草醚基因等)或抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因等)。特别优选的，所述标记基因为潮霉素基因。
在本发明的一种优选的实施方式中，所述的RNAi植物表达载体是将SEQ ID No.1-3所示的DNA片段用overlapping方法连接到植物双元转化载体pCAMBIA1300-Ubi-Nos的AscⅠ和BamH Ⅰ位点间，得到RNAi植物表达载体pC1300-UN-P450i-10。
特别优选的，所述的RNAi植物表达载体，具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。
其中，所述植物为水稻，优选的，所述植物为转基因水稻株系。
值得注意的是，用于RNAi植物表达载体构建的中间载体和具有选择标记基因的RNAi表达载体，工程菌及包含P450i-10茎环结构的细胞、愈伤组织、转基因苗、种子等均属于本发明的保护范围。
本发明的另一个方面还提供了一种RNAi植物表达载体的构建方法，所述方法包括：SEQ ID No.1-3所示的DNA片段用overlapping方法连接到植物双元转化载体pCAMBIA1300-Ubi-Nos的Asc Ⅰ和BamH Ⅰ位点间，得到RNAi植物表达载体pC1300-UN-P450i-10。
具体的，所述方法可以按照以下步骤进行：
(1)由于SEQ ID No.1和2在水稻基因组上为顺序排列，故可通过一对引物(P450i-10-1F/R)一次性扩增获得SEQ ID No.1和2顺序连接的片段，故设计2对引物，分别扩增SEQID No.1-3所示的DNA片段其中相邻的两个片段上下游引物5’端均有15个左右核苷酸序列与片段或载体相应连接位置重复，以便利用Gibson Assembly重组连接。具体引物信息如下：
P450i-10-1F gttacttggcgcgcc ATCCCGCACATCGGCGCGGCCAA
P450i-10-1R acagctctaacggcgCTGCACGGCAAGAGGGTGGAACT
P450i-10-2F cctcttgccgtgcagCGCCGTTAGAGCTGTGATCAT
P450i-10-2R tcgactctagaggatccATCCCGCACATCGGCGCGGCCAA
(2)RNAi植物表达载体的构建与转化
以水稻DNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增，将SEQ ID No.1和2一起扩。扩增体系及程序如下：
程序：94℃预变性5-10min，94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸1min，30-35个循环,72℃再延伸10min；16℃结束。
Figure BDA0001979995930000051
以水稻DNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增基因片段SEQ ID No.3。扩增体系及程序如下：
程序：94℃预变性5-10min，94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸30s，30-35个循环,72℃再延伸5min；16℃结束。
Figure BDA0001979995930000052
获得PCR产物片段，回收后，分别命名为P450i-10-1(SEQ ID No.1所示序列+SEQID No.2所示序列)、P450i-10-2(SEQ ID No.3所示序列)。用Asc Ⅰ+BamH Ⅰ酶切植物双元转化载体pCAMBIA1300-Ubi-Nos，将目的片段P450i-10-1、P450i-10-2直接连入经酶切的pCAMBIA1300-Ubi-Nos质粒，获得载体pC1300-UN-P450i-10。
本发明还提供了一种本发明所述的RNAi植物表达载体在干扰植物细胞色素P450基因CYP81A6表达制备除草剂显性敏感植物中的应用。
本发明的RNAi植物表达载体可通过农杆菌介导遗传转化法、基因枪法、花粉管通道法等常规生物学方法转化植物细胞或组织。
优选的，所述应用包括将pC1300-UN-P450i-10导入农杆菌EHA105菌株，并转化愈伤组织。所述愈伤组织可以为花药诱导的愈伤组织、成熟胚诱导的愈伤组织、幼胚诱导的愈伤组织、幼穗诱导的愈伤组织。
本发明的一个方面还提供了一种获得除草剂显性敏感植物的方法，包括将所述RNAi植物表达载体转化植物，干扰植物细胞色素P450基因CYP81A6表达。
在本发明的一种实施方式中，所述获得除草剂显性敏感植物的方法包括：
(1)构建RNAi植物表达载体：将SEQ ID No.1-3所示的DNA片段用overlapping方法连接到植物双元转化载体pCAMBIA1300-Ubi-Nos的Asc Ⅰ和BamH Ⅰ位点间，得到RNAi植物表达载体pC1300-UN-P450i-10；
(2)转化：将pC1300-UN-P450i-10导入农杆菌EHA105菌株，并转化愈伤组织，将转化后的愈伤组织进行诱导分化获得除草剂显性敏感植物。
其中，所述RNAi植物表达载体pC1300-UN-P450i-10具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。
其中，所述除草剂可以为苯达松或磺酰脲类除草剂。所述植物为水稻，优选的，所述植物为转基因水稻株系。
本发明提供了所述RNAi植物表达载体在培育转基因新品种、杂交水稻制种或防止转基因逃逸中的应用。
本发明基于RNAi技术，通过筛选构建了一个针对水稻细胞色素P450(CYP81A6)的植物双元转基因载体，该载体可高效的抑制细胞色素P450(CYP81A6)载体，且其序列完全为水稻内源序列，可有效消除公众对于外源基因转基因引起的风险和担忧。将该载体转化水稻，成功抑制了CYP81A6基因的表达，并将水稻从对苯达松或磺酰脲类除草剂具有抗性转变为敏感，从而培育了一种对苯达松或磺酰脲类除草剂显性敏感的水稻。使得转基因植株可以通过施用除草剂的方式被清除。该水稻在培育转基因新品种，杂交水稻制种，防止转基因逃逸等方面具有非常重要的应用价值。
附图说明
图1为P450i-10-1、P450i-10-2 2个目的片段扩增及pCAMBIA1300-Ubi-Nos骨架载体酶切回收电泳图。其中1，AscI/BamHI双酶切pCAMBIA1300-Ubi-Nos骨架载体；2，P450i-10-1目的片段(SEQ ID No.1和2)；3，P450i-10-2目的片段(SEQ ID No.3)。
图2为pC1300-UN-P450i-10载体经Asc Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切的电泳图。图中泳道1、3、5分别为未酶切的单克隆重组质粒，2、4、6分别为经酶切的单克隆重组质粒，M为D2000marker，所切出的片段大小1245bp，包括目的片段的正向、反向互补序列及CYP81A6基因内含子序列。
图3为部分转基因株系潮霉素抗性基因PCR检测电泳图；泳道1，H2O；泳道2-3阴性对照(中花11非转基因植株)；泳道4，阳性对照(pC1300-UN-P450i-10质粒)；泳道5-24，转基因株系(其中7和24为弱阳性)；M，Marker。
图4为pC1300-UN-P450i-10转基因T0代三叶期幼苗对1g/L苯达松溶液敏感度测试。白色箭头所指为CK(ZH11非转基因植株)，枯萎死亡的为敏感株系。0d为喷施前；7d和14d为喷施后7天和14天记录。
图5对比例1中苯达松敏感的P450i转基因株系T0代3-5叶期幼苗对10g/L以上浓度苯达松溶液敏感度测试，其中1-2、6-1、9-1、18-2、33-1为独立P450i转基因株系。
图6对比例2中苯达松敏感的P450i-7转基因株系T0代3-5叶期幼苗对1g/L浓度苯达松溶液在第7d的敏感度测试表型对照图；0d为喷施前记录。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1菌株、质粒的获得及PCR引物的合成
(1)菌株和质粒
作为骨架载体的植物双元转化载体pCAMBIA1300-Ubi-Nos包含潮霉素抗性基因、玉米Ubi启动子及NOS终止子。大肠杆菌(Escherichia coli)菌株为DH5α；农杆菌(Agrobacterim tumefacieus)菌株为EHA105。
(2)PCR引物序列
由于SEQ ID No.1和2在水稻基因组上为顺序排列，故可通过一对引物(P450i-10-1F/R)一次性扩增获得SEQ ID No.1和2顺序连接的片段，故设计2对引物，分别扩增SEQ IDNo.1-3所示的DNA片段其中相邻的两个片段上下游引物5’端均有15个左右核苷酸序列与片段或载体相应连接位置重复，以便利用Gibson Assembly重组连接。
P450i-10-1F gttacttggcgcgcc atcccgcacatcggcgcggccaa
P450i-10-1R acagctctaacggcgctgcacggcaagagggtggaact
P450i-10-2F cctcttgccgtgcagcgccgttagagctgtgatcat
P450i-10-2R tcgactctagaggatccatcccgcacatcggcgcggccaa
实施例2 RNAi植物表达载体的构建与转化
为了构建细胞色素P450基因CYP81A6的干扰载体，以水稻DNA为模板，利用实施例1的引物进行PCR扩增，将SEQ ID No.1和2(一起扩)。扩增体系及程序如下：
程序：94℃预变性5-10min，94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸1min，30-35个循环,72℃再延伸10min；16℃结束。
Figure BDA0001979995930000091
以水稻DNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增基因片段SEQ ID No.3。扩增体系及程序如下：
程序：94℃预变性5-10min，94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸30s，30-35个循环，72℃再延伸5min；16℃结束。
Figure BDA0001979995930000092
经琼脂糖凝胶电泳后，利用
Figure BDA0001979995930000093
Gel Extraction kit(Omega,下同)回收PCR产物片段，大小分别为984bp、及258bp，分别命名为P450i-10-1及P450i-10-2。用AscI+BamHI对载体质粒pCAMBIA1300-Ubi-Nos进行双酶切，经琼脂糖凝胶电泳后，利用
Figure BDA0001979995930000103
Gel Extraction kit(Omega,下同)回收11kb左右大小条带，得到pCAMBIA1300-Ubi-Nos线性片段(图1)。
AscI+BamHI双酶切反应体系如下：
Figure BDA0001979995930000101
(2)2x Lightening Cloning Kit连接试剂盒(Gene-
Figure BDA0001979995930000104
)连接P450i-10-1及P450i-10-2两个片段到pCAMBIA1300-Ubi-Nos载体上，连接体系如下：
Figure BDA0001979995930000102
连接程序：50℃30min。
连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，重组质粒经Asc Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切，目的片段大小符合预期(图2)，并将重组子送测序验证正确，即以CYP81A6基因内含子为环，构建的P450i-10RNAi载体，将此载体命名为pCAMBIA1300-Ubi-Nos-P450i-10(以下简称pC1300-UN-P450i-10)。
实施例3农杆菌转化水稻及转基因植株鉴定
将pC1300-UN-P450i-10重组质粒导入农杆菌EHA105菌株，并转化粳稻中花11愈伤组织，经潮霉素抗性筛选，分化，生根获得再生转基因株系20株，通过PCR鉴定转基因植株中转入的潮霉素抗性基因，结果显示，PCR阳性植株18株，弱阳性植株2株可认为是阴性植株(图3)，将阳性植株移栽至泥土中，成活12株。
实施例4水稻苯达松敏感与抗性转基因株系的获得
为了检测所设计干扰载体片段在转基因植株中的效果，用48％苯达松母液(常州精度生物科技有限公司)配制1g/L苯达松溶液，喷施实施例3获得的pC1300-UN-P450i-10转基因T0代三叶期幼苗，喷后连续观察。
喷施后4d，P450i-10转基因T0代幼苗部分株系叶片叶尖卷曲枯黄；喷施后7d，P450i-10转基因12个株系中，有1个株系出现不可逆死亡，属于高度敏感株系；有2个株系之前叶片枯萎严重但逐渐恢复生长，属于中度敏感株系；有3个株系叶尖有些枯黄但正常生长，属于低度敏感株系；有6个株系喷施前后无明显变化，属于抗性株系(图4)。需要强调的是，虽然本实施例用1g/L苯达松喷施筛选苯达松敏感转基因株系，但筛选敏感株系并不限于1g/L，0.1g/L为本发明所应用的筛选苯达松敏感转基因株系的苯达松的最低浓度。以上结果表明，本发明成功获得了除草剂显性敏感的转基因材料。
实施例5敏感株系各生育期对苯达松的敏感度测试
为了检测本发明获得的显性敏感株系在不同生育期对苯达松的敏感程度，在不同生育期对其进行苯达松临界浓度测试。
以野生型ZH11作为对照，转基因敏感株系苗期(五叶期之前)喷施苯达松溶液0.005-0.2g/m2，喷施后连续观察，10d～15d后，敏感株系不可逆死亡，但野生型却正常生长。
以野生型ZH11作为对照，转基因敏感株系初分蘖期(移栽后2-4周)喷施苯达松溶液0.2-0.5g/m2，喷施后连续观察，10d～15d后，敏感株系不可逆死亡，但野生型却正常生长。
以野生型ZH11作为对照，转基因敏感株系最大分蘖期至抽穗期(移栽后6-10周左右)喷施苯达松溶液0.6-1.2g/m2，喷施后连续观察，10d～15d后，敏感株系不可逆死亡，但野生型却正常生长。
以野生型ZH11作为对照，转基因敏感株系开花后7d喷施苯达松溶液1.2-1.5g/m2，喷施后连续观察，10d～15d后，敏感株系不可逆死亡，但野生型却正常生长。
实施例6敏感株系各生育期对磺酰脲类除草剂的敏感度测试
为了检测显性敏感株系在不同生育期对磺酰脲类除草剂的敏感程度，本发明在不同生育期对其进行磺酰脲类除草剂如苄嘧磺隆临界浓度测试。
以野生型ZH11作为对照，转基因敏感株系苗期(五叶期之前)喷施苄嘧磺隆溶液0.5-5mg/m2，喷施后连续观察，5d～10d后，敏感株系生长停滞，但野生型却正常生长。
以野生型ZH11作为对照，转基因敏感株系初分蘖期(移栽后2-4周)喷施磺苄嘧磺隆溶液5-12mg/m2，喷施后连续观察，5d～10d后，敏感株系生长停滞，但野生型却正常生长。
以野生型ZH11作为对照，转基因敏感株系最大分蘖期至抽穗期(移栽后6-10周左右)喷施苄嘧磺隆溶液20-40mg/m2，喷施后连续观察，5d～10d后，敏感株系生长停滞，但野生型却正常生长。
以野生型ZH11作为对照，转基因敏感株系开花后7d喷施苄嘧磺隆溶液40-60mg/m2，喷施后连续观察，5d～10d后，敏感株系生长停滞，但野生型却正常生长。
综合实施例5和6，本发明提供了P450 RNAi转基因水稻在各个生长期阶段的灭杀浓度。
对比例1
按照Lin等先前报道的方法(Lin C,Fang J,Xu X,Zhao T,Cheng J,Tu J,Ye G,Shen Z(2008)A built-in strategy for containment of transgenic plants:creationof selectively terminable transgenic rice.PLoS One 3:e1818)构建发卡结构并利用中花11制备获得苯达松敏感的转基因株系。
对苯达松敏感的转基因株系分别喷施浓度为0.5g/L和1g/L的苯达松，结果发现没有任何一棵转基因株系被杀死。当对转基因株系喷施10g/L以上浓度苯达松时才有表型(图5)，且苯达松敏感的表型率较低，表明按照此方法设计的P450i对内源基因的干扰效率较低。
对比例2
同时将来自水稻CYP81A6基因起始密码子ATG下游+667到+924间258bp片段(SEQID NO.1)以及该片段的反向互补片段(SEQ ID NO.3)作为RNAi干扰茎，另外将CYP81A6基因的内含子部分序列(122bp)(SEQ ID NO.5)作为RNAi干扰环，构建P450的另外一个RNA干扰载体，简称为P450i-7(核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)。
经三次转化实验，对获得的该载体转基因株系喷施0.25g/L及1g/L的苯达松，结果发现均无任何一棵转基因株系被杀死(图6)，喷施2g/L以上浓度苯达松，10天后出现表型，但高敏感株系占比例并不高(见表1)。本申请P450i-10与P450i-7使用了相同的RNAi干扰茎，但效率相差较大，表明不同茎环结构之间组合干扰效率差异较大。
表1 P450i-7转基因苗苯达松敏感度测试结果
Figure BDA0001979995930000131
综上，本申请通过一系列实验表明，不同茎环结构对RNAi干扰效率影响差异显著，并非任意序列作为RNAi干扰茎环，构建P450的RNAi干扰载体都能够成功抑制基因CYP81A6的表达，并将水稻从对除草剂具有抗性转变为敏感，本申请筛选获得的高效水稻CYP81A6干扰载体(SEQ ID No.4所示的核苷酸序列)具备前述功能，且利用CYP81A6自身序列形成的干扰载体，不引入外源序列，降低了外源基因转入引起的风险和公众担忧，可用于培育转基因新品种，杂交水稻制种，防止转基因逃逸，具备优良的应用价值。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 海南波莲水稻基因科技有限公司
<120> 一种利用水稻内源序列的RNAi植物表达载体及其应用
<130> KHP191110809.0
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 258
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atcccgcaca tcggcgcggc caacctgtgg gactacttgc cggcgctccg gtggttcgac 60
gtgttcggcg tcaggaggaa gatcctcgcc gctgtaagcc ggagggacgc gttccttcgc 120
cgcctgatcg acgcggagcg gcggaggctg gacgacggcg acgagggcga gaagaagagc 180
atgatcgccg tgctgctcac tctgcagaag acagagccgg aggtgtacac cgataacatg 240
atcacagctc taacggcg 258
<210> 2
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtgagttcat cttctgctgt tttacctttc tgatatctga attctctcat tggtgcgtaa 60
tttttttttt ttggctgtca tcggtatagc tttcttaagc actcagtagc cttgcaatta 120
taaaaagaaa aacaatcagt agctttttac atgctttgag tcagtcagta gcagtgtggc 180
actatcagca ttcagcagta ttcatgttgt ttgctaatca ctatcatggt ttgagtcagc 240
acaatcagta gcttttgaca tggtttgagt cagcagtatc ttttctagga actgaattag 300
ttattcattt agtacaactt gtttgtctgt ctattgattg ctttaaatta tttcttctat 360
gcaaccctct aatcctagta tagtactagc cttttatatg aagaatcatc aataattttc 420
ttctcacttt cagtgtagct ttacttaatg aatattttga aagatcgcct agttgcctta 480
ttataattgt ataaaaggaa aacaatcagt agccttttac atggttgagt cagcgagtta 540
tcaggagtac tattgtttat catggtagta gcacgataga ctattcaacc cgggcgatta 600
aaatccttct cccaaatttg tattctttgt tttttcctca aaaattcacc aaactcttgg 660
aactattata gttcagtttt agacaaaaaa aaaatgaaat cttagttcca ccctcttgcc 720
gtgcag 726
<210> 3
<211> 258
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgccgttaga gctgtgatca tgttatcggt gtacacctcc ggctctgtct tctgcagagt 60
gagcagcacg gcgatcatgc tcttcttctc gccctcgtcg ccgtcgtcca gcctccgccg 120
ctccgcgtcg atcaggcggc gaaggaacgc gtccctccgg cttacagcgg cgaggatctt 180
cctcctgacg ccgaacacgt cgaaccaccg gagcgccggc aagtagtccc acaggttggc 240
cgcgccgatg tgcgggat 258
<210> 4
<211> 12412
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aattcgagct cgtgcagcgt gacccggtcg tgcccctctc tagagataat gagcattgca 60
tgtctaagtt ataaaaaatt accacatatt ttttttgtca cacttgtttg aagtgcagtt 120
tatctatctt tatacatata tttaaacttt actctacgaa taatataatc tatagtacta 180
caataatatc agtgttttag agaatcatat aaatgaacag ttagacatgg tctaaaggac 240
aattgagtat tttgacaaca ggactctaca gttttatctt tttagtgtgc atgtgttctc 300
cttttttttt gcaaatagct tcacctatat aatacttcat ccattttatt agtacatcca 360
tttagggttt agggttaatg gtttttatag actaattttt ttagtacatc tattttattc 420
tattttagcc tctaaattaa gaaaactaaa actctatttt agttttttta tttaataatt 480
tagatataaa atagaataaa ataaagtgac taaaaattaa acaaataccc tttaagaaat 540
taaaaaaact aaggaaacat ttttcttgtt tcgagtagat aatgccagcc tgttaaacgc 600
cgtcgacgag tctaacggac accaaccagc gaaccagcag cgtcgcgtcg ggccaagcga 660
agcagacggc acggcatctc tgtcgctgcc tctggacccc tctcgagagt tccgctccac 720
cgttggactt gctccgctgt cggcatccag aaattgcgtg gcggagcggc agacgtgagc 780
cggcacggca ggcggcctcc tcctcctctc acggcaccgg cagctacggg ggattccttt 840
cccaccgctc cttcgctttc ccttcctcgc ccgccgtaat aaatagacac cccctccaca 900
ccctctttcc ccaacctcgt gttgttcgga gcgcacacac acacaaccag atctccccca 960
aatccacccg tcggcacctc cgcttcaagg tacgccgctc gtcctccccc cccccccctc 1020
tctaccttct ctagatcggc gttccggtcc atggttaggg cccggtagtt ctacttctgt 1080
tcatgtttgt gttagatccg tgtttgtgtt agatccgtgc tgctagcgtt cgtacacgga 1140
tgcgacctgt acgtcagaca cgttctgatt gctaacttgc cagtgtttct ctttggggaa 1200
tcctgggatg gctctagccg ttccgcagac gggatcgatt tcatgatttt ttttgtttcg 1260
ttgcataggg tttggtttgc ccttttcctt tatttcaata tatgccgtgc acttgtttgt 1320
cgggtcatct tttcatgctt ttttttgtct tggttgtgat gatgtggtct ggttgggcgg 1380
tcgttctaga tcggagtaga attctgtttc aaactacctg gtggatttat taattttgga 1440
tctgtatgtg tgtgccatac atattcatag ttacgaattg aagatgatgg atggaaatat 1500
cgatctagga taggtataca tgttgatgcg ggttttactg atgcatatac agagatgctt 1560
tttgttcgct tggttgtgat gatgtggtgt ggttgggcgg tcgttcattc gttctagatc 1620
ggagtagaat actgtttcaa actacctggt gtatttatta attttggaac tgtatgtgtg 1680
tgtcatacat cttcatagtt acgagtttaa gatggatgga aatatcgatc taggataggt 1740
atacatgttg atgtgggttt tactgatgca tatacatgat ggcatatgca gcatctattc 1800
atatgctcta accttgagta cctatctatt ataataaaca agtatgtttt ataattattt 1860
tgatcttgat atacttggat gatggcatat gcagcagcta tatgtggatt tttttagccc 1920
tgccttcata cgctatttat ttgcttggta ctgtttcttt tgtcgatgct caccctgttg 1980
tttggtgtta cttggcgcgc catcccgcac atcggcgcgg ccaacctgtg ggactacttg 2040
ccggcgctcc ggtggttcga cgtgttcggc gtcaggagga agatcctcgc cgctgtaagc 2100
cggagggacg cgttccttcg ccgcctgatc gacgcggagc ggcggaggct ggacgacggc 2160
gacgagggcg agaagaagag catgatcgcc gtgctgctca ctctgcagaa gacagagccg 2220
gaggtgtaca ccgataacat gatcacagct ctaacggcgg tgagttcatc ttctgctgtt 2280
ttacctttct gatatctgaa ttctctcatt ggtgcgtaat tttttttttt tggctgtcat 2340
cggtatagct ttcttaagca ctcagtagcc ttgcaattat aaaaagaaaa acaatcagta 2400
gctttttaca tgctttgagt cagtcagtag cagtgtggca ctatcagcat tcagcagtat 2460
tcatgttgtt tgctaatcac tatcatggtt tgagtcagca caatcagtag cttttgacat 2520
ggtttgagtc agcagtatct tttctaggaa ctgaattagt tattcattta gtacaacttg 2580
tttgtctgtc tattgattgc tttaaattat ttcttctatg caaccctcta atcctagtat 2640
agtactagcc ttttatatga agaatcatca ataattttct tctcactttc agtgtagctt 2700
tacttaatga atattttgaa agatcgccta gttgccttat tataattgta taaaaggaaa 2760
acaatcagta gccttttaca tggttgagtc agcgagttat caggagtact attgtttatc 2820
atggtagtag cacgatagac tattcaaccc gggcgattaa aatccttctc ccaaatttgt 2880
attctttgtt ttttcctcaa aaattcacca aactcttgga actattatag ttcagtttta 2940
gacaaaaaaa aaatgaaatc ttagttccac cctcttgccg tgcagcgccg ttagagctgt 3000
gatcatgtta tcggtgtaca cctccggctc tgtcttctgc agagtgagca gcacggcgat 3060
catgctcttc ttctcgccct cgtcgccgtc gtccagcctc cgccgctccg cgtcgatcag 3120
gcggcgaagg aacgcgtccc tccggcttac agcggcgagg atcttcctcc tgacgccgaa 3180
cacgtcgaac caccggagcg ccggcaagta gtcccacagg ttggccgcgc cgatgtgcgg 3240
gatggatcct ctagagtcga cctgcaggca tgcgtttctt aagattgaat cctgttgccg 3300
gtcttgcgat gattatcata taatttctgt tgaattacgt taagcatgta ataattaaca 3360
tgtaatgcat gacgttattt atgagatggg tttttatgat tagagtcccg caattataca 3420
tttaatacgc gatagaaaac aaaatatagc gcgcaaacta ggataaatta tcgcgcgcgg 3480
tgtcatctat gttactagat cgggaagctt ggcactggcc gtcgttttac aacgtcgtga 3540
ctgggaaaac cctggcgtta cccaacttaa tcgccttgca gcacatcccc ctttcgccag 3600
ctggcgtaat agcgaagagg cccgcaccga tcgcccttcc caacagttgc gcagcctgaa 3660
tggcgaatgc tagagcagct tgagcttgga tcagattgtc gtttcccgcc ttcagtttaa 3720
actatcagtg tttgacagga tatattggcg ggtaaaccta agagaaaaga gcgtttatta 3780
gaataacgga tatttaaaag ggcgtgaaaa ggtttatccg ttcgtccatt tgtatgtgca 3840
tgccaaccac agggttcccc tcgggatcaa agtactttga tccaacccct ccgctgctat 3900
agtgcagtcg gcttctgacg ttcagtgcag ccgtcttctg aaaacgacat gtcgcacaag 3960
tcctaagtta cgcgacaggc tgccgccctg cccttttcct ggcgttttct tgtcgcgtgt 4020
tttagtcgca taaagtagaa tacttgcgac tagaaccgga gacattacgc catgaacaag 4080
agcgccgccg ctggcctgct gggctatgcc cgcgtcagca ccgacgacca ggacttgacc 4140
aaccaacggg ccgaactgca cgcggccggc tgcaccaagc tgttttccga gaagatcacc 4200
ggcaccaggc gcgaccgccc ggagctggcc aggatgcttg accacctacg ccctggcgac 4260
gttgtgacag tgaccaggct agaccgcctg gcccgcagca cccgcgacct actggacatt 4320
gccgagcgca tccaggaggc cggcgcgggc ctgcgtagcc tggcagagcc gtgggccgac 4380
accaccacgc cggccggccg catggtgttg accgtgttcg ccggcattgc cgagttcgag 4440
cgttccctaa tcatcgaccg cacccggagc gggcgcgagg ccgccaaggc ccgaggcgtg 4500
aagtttggcc cccgccctac cctcaccccg gcacagatcg cgcacgcccg cgagctgatc 4560
gaccaggaag gccgcaccgt gaaagaggcg gctgcactgc ttggcgtgca tcgctcgacc 4620
ctgtaccgcg cacttgagcg cagcgaggaa gtgacgccca ccgaggccag gcggcgcggt 4680
gccttccgtg aggacgcatt gaccgaggcc gacgccctgg cggccgccga gaatgaacgc 4740
caagaggaac aagcatgaaa ccgcaccagg acggccagga cgaaccgttt ttcattaccg 4800
aagagatcga ggcggagatg atcgcggccg ggtacgtgtt cgagccgccc gcgcacgtct 4860
caaccgtgcg gctgcatgaa atcctggccg gtttgtctga tgccaagctg gcggcctggc 4920
cggccagctt ggccgctgaa gaaaccgagc gccgccgtct aaaaaggtga tgtgtatttg 4980
agtaaaacag cttgcgtcat gcggtcgctg cgtatatgat gcgatgagta aataaacaaa 5040
tacgcaaggg gaacgcatga aggttatcgc tgtacttaac cagaaaggcg ggtcaggcaa 5100
gacgaccatc gcaacccatc tagcccgcgc cctgcaactc gccggggccg atgttctgtt 5160
agtcgattcc gatccccagg gcagtgcccg cgattgggcg gccgtgcggg aagatcaacc 5220
gctaaccgtt gtcggcatcg accgcccgac gattgaccgc gacgtgaagg ccatcggccg 5280
gcgcgacttc gtagtgatcg acggagcgcc ccaggcggcg gacttggctg tgtccgcgat 5340
caaggcagcc gacttcgtgc tgattccggt gcagccaagc ccttacgaca tatgggccac 5400
cgccgacctg gtggagctgg ttaagcagcg cattgaggtc acggatggaa ggctacaagc 5460
ggcctttgtc gtgtcgcggg cgatcaaagg cacgcgcatc ggcggtgagg ttgccgaggc 5520
gctggccggg tacgagctgc ccattcttga gtcccgtatc acgcagcgcg tgagctaccc 5580
aggcactgcc gccgccggca caaccgttct tgaatcagaa cccgagggcg acgctgcccg 5640
cgaggtccag gcgctggccg ctgaaattaa atcaaaactc atttgagtta atgaggtaaa 5700
gagaaaatga gcaaaagcac aaacacgcta agtgccggcc gtccgagcgc acgcagcagc 5760
aaggctgcaa cgttggccag cctggcagac acgccagcca tgaagcgggt caactttcag 5820
ttgccggcgg aggatcacac caagctgaag atgtacgcgg tacgccaagg caagaccatt 5880
accgagctgc tatctgaata catcgcgcag ctaccagagt aaatgagcaa atgaataaat 5940
gagtagatga attttagcgg ctaaaggagg cggcatggaa aatcaagaac aaccaggcac 6000
cgacgccgtg gaatgcccca tgtgtggagg aacgggcggt tggccaggcg taagcggctg 6060
ggttgtctgc cggccctgca atggcactgg aacccccaag cccgaggaat cggcgtgacg 6120
gtcgcaaacc atccggcccg gtacaaatcg gcgcggcgct gggtgatgac ctggtggaga 6180
agttgaaggc cgcgcaggcc gcccagcggc aacgcatcga ggcagaagca cgccccggtg 6240
aatcgtggca agcggccgct gatcgaatcc gcaaagaatc ccggcaaccg ccggcagccg 6300
gtgcgccgtc gattaggaag ccgcccaagg gcgacgagca accagatttt ttcgttccga 6360
tgctctatga cgtgggcacc cgcgatagtc gcagcatcat ggacgtggcc gttttccgtc 6420
tgtcgaagcg tgaccgacga gctggcgagg tgatccgcta cgagcttcca gacgggcacg 6480
tagaggtttc cgcagggccg gccggcatgg ccagtgtgtg ggattacgac ctggtactga 6540
tggcggtttc ccatctaacc gaatccatga accgataccg ggaagggaag ggagacaagc 6600
ccggccgcgt gttccgtcca cacgttgcgg acgtactcaa gttctgccgg cgagccgatg 6660
gcggaaagca gaaagacgac ctggtagaaa cctgcattcg gttaaacacc acgcacgttg 6720
ccatgcagcg tacgaagaag gccaagaacg gccgcctggt gacggtatcc gagggtgaag 6780
ccttgattag ccgctacaag atcgtaaaga gcgaaaccgg gcggccggag tacatcgaga 6840
tcgagctagc tgattggatg taccgcgaga tcacagaagg caagaacccg gacgtgctga 6900
cggttcaccc cgattacttt ttgatcgatc ccggcatcgg ccgttttctc taccgcctgg 6960
cacgccgcgc cgcaggcaag gcagaagcca gatggttgtt caagacgatc tacgaacgca 7020
gtggcagcgc cggagagttc aagaagttct gtttcaccgt gcgcaagctg atcgggtcaa 7080
atgacctgcc ggagtacgat ttgaaggagg aggcggggca ggctggcccg atcctagtca 7140
tgcgctaccg caacctgatc gagggcgaag catccgccgg ttcctaatgt acggagcaga 7200
tgctagggca aattgcccta gcaggggaaa aaggtcgaaa aggtctcttt cctgtggata 7260
gcacgtacat tgggaaccca aagccgtaca ttgggaaccg gaacccgtac attgggaacc 7320
caaagccgta cattgggaac cggtcacaca tgtaagtgac tgatataaaa gagaaaaaag 7380
gcgatttttc cgcctaaaac tctttaaaac ttattaaaac tcttaaaacc cgcctggcct 7440
gtgcataact gtctggccag cgcacagccg aagagctgca aaaagcgcct acccttcggt 7500
cgctgcgctc cctacgcccc gccgcttcgc gtcggcctat cgcggccgct ggccgctcaa 7560
aaatggctgg cctacggcca ggcaatctac cagggcgcgg acaagccgcg ccgtcgccac 7620
tcgaccgccg gcgcccacat caaggcaccc tgcctcgcgc gtttcggtga tgacggtgaa 7680
aacctctgac acatgcagct cccggagacg gtcacagctt gtctgtaagc ggatgccggg 7740
agcagacaag cccgtcaggg cgcgtcagcg ggtgttggcg ggtgtcgggg cgcagccatg 7800
acccagtcac gtagcgatag cggagtgtat actggcttaa ctatgcggca tcagagcaga 7860
ttgtactgag agtgcaccat atgcggtgtg aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat 7920
accgcatcag gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc 7980
tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg 8040
ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg 8100
ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac 8160
gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg 8220
gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct 8280
ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg 8340
tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct 8400
gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac 8460
tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt 8520
tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc 8580
tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca 8640
ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat 8700
ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac 8760
gttaagggat tttggtcatg cattctaggt actaaaacaa ttcatccagt aaaatataat 8820
attttatttt ctcccaatca ggcttgatcc ccagtaagtc aaaaaatagc tcgacatact 8880
gttcttcccc gatatcctcc ctgatcgacc ggacgcagaa ggcaatgtca taccacttgt 8940
ccgccctgcc gcttctccca agatcaataa agccacttac tttgccatct ttcacaaaga 9000
tgttgctgtc tcccaggtcg ccgtgggaaa agacaagttc ctcttcgggc ttttccgtct 9060
ttaaaaaatc atacagctcg cgcggatctt taaatggagt gtcttcttcc cagttttcgc 9120
aatccacatc ggccagatcg ttattcagta agtaatccaa ttcggctaag cggctgtcta 9180
agctattcgt atagggacaa tccgatatgt cgatggagtg aaagagcctg atgcactccg 9240
catacagctc gataatcttt tcagggcttt gttcatcttc atactcttcc gagcaaagga 9300
cgccatcggc ctcactcatg agcagattgc tccagccatc atgccgttca aagtgcagga 9360
cctttggaac aggcagcttt ccttccagcc atagcatcat gtccttttcc cgttccacat 9420
cataggtggt ccctttatac cggctgtccg tcatttttaa atataggttt tcattttctc 9480
ccaccagctt atatacctta gcaggagaca ttccttccgt atcttttacg cagcggtatt 9540
tttcgatcag ttttttcaat tccggtgata ttctcatttt agccatttat tatttccttc 9600
ctcttttcta cagtatttaa agatacccca agaagctaat tataacaaga cgaactccaa 9660
ttcactgttc cttgcattct aaaaccttaa ataccagaaa acagcttttt caaagttgtt 9720
ttcaaagttg gcgtataaca tagtatcgac ggagccgatt ttgaaaccgc ggtgatcaca 9780
ggcagcaacg ctctgtcatc gttacaatca acatgctacc ctccgcgaga tcatccgtgt 9840
ttcaaacccg gcagcttagt tgccgttctt ccgaatagca tcggtaacat gagcaaagtc 9900
tgccgcctta caacggctct cccgctgacg ccgtcccgga ctgatgggct gcctgtatcg 9960
agtggtgatt ttgtgccgag ctgccggtcg gggagctgtt ggctggctgg tggcaggata 10020
tattgtggtg taaacaaatt gacgcttaga caacttaata acacattgcg gacgttttta 10080
atgtactgaa ttaacgccga attaattcgg gggatctgga ttttagtact ggattttggt 10140
tttaggaatt agaaatttta ttgatagaag tattttacaa atacaaatac atactaaggg 10200
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ta 122
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tgccagtgat acacatgggg atcagcaatc gcgcatatga aatcacgcca tgtagtgtat 10320
tgaccgattc cttgcggtcc gaatgggccg aacccgctcg tctggctaag atcggccgca 10380
gcgatcgcat ccatagcctc cgcgaccggt tgtagaacag cgggcagttc ggtttcaggc 10440
aggtcttgca acgtgacacc ctgtgcacgg cgggagatgc aataggtcag gctctcgcta 10500
aactccccaa tgtcaagcac ttccggaatc gggagcgcgg ccgatgcaaa gtgccgataa 10560
acataacgat ctttgtagaa accatcggcg cagctattta cccgcaggac atatccacgc 10620
cctcctacat cgaagctgaa agcacgagat tcttcgccct ccgagagctg catcaggtcg 10680
gagacgctgt cgaacttttc gatcagaaac ttctcgacag acgtcgcggt gagttcaggc 10740
tttttcatat ctcattgccc ccccggatct gcgaaagctc gagagagata gatttgtaga 10800
gagagactgg tgatttcagc gtgtcctctc caaatgaaat gaacttcctt atatagagga 10860
aggtcttgcg aaggatagtg ggattgtgcg tcatccctta cgtcagtgga gatatcacat 10920
caatccactt gctttgaaga cgtggttgga acgtcttctt tttccacgat gctcctcgtg 10980
ggtgggggtc catctttggg accactgtcg gcagaggcat cttgaacgat agcctttcct 11040
ttatcgcaat gatggcattt gtaggtgcca ccttcctttt ctactgtcct tttgatgaag 11100
tgacagatag ctgggcaatg gaatccgagg aggtttcccg atattaccct ttgttgaaaa 11160
gtctcaatag ccctttggtc ttctgagact gtatctttga tattcttgga gtagacgaga 11220
gtgtcgtgct ccaccatgtt atcacatcaa tccacttgct ttgaagacgt ggttggaacg 11280
tcttcttttt ccacgatgct cctcgtgggt gggggtccat ctttgggacc actgtcggca 11340
gaggcatctt gaacgatagc ctttccttta tcgcaatgat ggcatttgta ggtgccacct 11400
tccttttcta ctgtcctttt gatgaagtga cagatagctg ggcaatggaa tccgaggagg 11460
tttcccgata ttaccctttg ttgaaaagtc tcaatagccc tttggtcttc tgagactgta 11520
tctttgatat tcttggagta gacgagagtg tcgtgctcca ccatgttggc aagctgctct 11580
agccaatacg caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc agctggcacg 11640
acaggtttcc cgactggaaa gcgggcagtg agcgcaacgc aattaatgtg agttagctca 11700
ctcattaggc accccaggct ttacacttta tgcttccggc tcgtatgttg tgtggaattg 11760
tgagcggata acaatttcac acaggaaaca gctatgacca tgattacg 11808
<210> 9
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gttacttggc gcgccatccc gcacatcggc gcggccaa 38
<210> 10
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
acagctctaa cggcgctgca cggcaagagg gtggaact 38
<210> 11
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cctcttgccg tgcagcgccg ttagagctgt gatcat 36
<210> 12
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tcgactctag aggatccatc ccgcacatcg gcgcggccaa 40

Claims (10)

1.一种抑制细胞色素P450基因表达的RNAi植物表达载体，其特征在于，含有发卡结构表达盒，其中所述发卡结构表达盒含有由SEQ ID No.1-3所示的DNA片段所形成的发卡结构。
2.根据权利要求1所述的RNAi植物表达载体，其特征在于，所述发卡结构表达盒还包括位于发卡结构上游的植物组成型启动子或植物组织特异性启动子，以及，位于发卡结构下游的终止子，
其中所述植物组成型启动子为水稻或玉米的Ubi启动子、CAMV 35S启动子或Actin启动子；所述植物组织特异性启动子为Rubisco小亚基启动子或Cab启动子。
3.根据权利要求1所述的RNAi植物表达载体，其特征在于，还包括选择标记表达盒，所述选择标记表达盒含有启动子、标记基因和终止子，其中所述启动子为水稻或玉米的Ubi启动子、CAMV 35S启动子，或Actin启动子；所述标记基因为可产生颜色变化的酶的基因、荧光标记基因、抗生素标记基因、除草剂筛选标记基因或抗化学试剂标记基因，所述终止子为NOS终止子或Ubi终止子。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的RNAi植物表达载体，其特征在于，具有SEQ IDNo.4所示的核苷酸序列。
5.含有权利要求1-4任一所述的RNAi植物表达载体的生物材料，所述生物材料为工程菌、包含P450i-10茎环结构的细胞或愈伤组织。
6.一种RNAi植物表达载体的构建方法，其特征在于，所述方法包括：将SEQ ID No.1-3所示的DNA片段用overlapping方法连接到植物双元转化载体pCAMBIA1300-Ubi-Nos的AscⅠ和BamH Ⅰ位点间，得到RNAi植物表达载体pC1300-UN-P450i-10。
7.权利要求1-4中任意一项所述的RNAi植物表达载体在干扰植物细胞色素P450基因CYP81A6表达制备除草剂显性敏感植物中的应用，其特征在于，包括将pC1300-UN-P450i-10导入农杆菌EHA105菌株，并转化植物愈伤组织。
8.一种干扰植物细胞色素P450基因CYP81A6表达的方法，其特征在于，包括将权利要求1-4中任意一项所述的RNAi植物表达载体转化植物，干扰植物细胞色素P450基因CYP81A6表达。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，包括：
(1)构建RNAi植物表达载体：将SEQ ID No.1-3所示的DNA片段用overlapping方法连接到植物双元转化载体pCAMBIA1300-Ubi-Nos的Asc Ⅰ和BamH Ⅰ位点间，得到RNAi植物表达载体pC1300-UN-P450i-10；
(2)转化：将pC1300-UN-P450i-10导入农杆菌EHA105菌株，并转化愈伤组织，将转化后的愈伤组织进行诱导分化获得除草剂显性敏感植物。
10.权利要求1-4中任意一项所述的RNAi植物表达载体在培育转基因新品种、杂交水稻制种或防止转基因逃逸中的应用。
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