CN112175968B - 大豆WD40蛋白基因GmPRL1b及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种大豆威廉姆斯82中WD40结构域蛋白基因GmPRL1b，该基因cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明还公开了一种含所述基因GmPRL1b的植物表达载体pB2GW7::GmPRL1b，该表达载体克隆区域核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。本发明同时提供了所述基因GmPRL1b和植物表达载体pB2GW7::GmPRL1b在提高植株耐盐及提高植株抗灰霉病中的应用。实验证明，本发明的转基因植株比非转基因植株的抗灰霉病、耐盐能力得到了很大程度的提高，此为提高作物抗病、耐盐性提供了理论依据和实践基础，也预示本发明所述的基因可广泛用于培育抗病、耐盐的植物品种。

Description

大豆WD40蛋白基因GmPRL1b及其应用

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，尤其涉及一种大豆(Glycine max(L.)Merr)威廉姆斯82(Williams 82)中WD40蛋白基因——GmPRL1b及其应用。

背景技术

植物暴露在自然环境当中，经常受到各种环境胁迫的影响，比如干旱、极端的温度、养分缺乏和病虫害等。这些环境胁迫不仅制约了植物的生长发育，同时也导致了粮食作物的减产。高等植物自身生长发育和对环境变化的响应是通过调控目的基因的表达来实现。

WD40蛋白是指含有WD40结构域的蛋白，这类蛋白广泛的存在于真核生物中，在细菌中也有少量的存在。WD40蛋白能够形成蛋白支架结构，与多种蛋白、多肽及核酸互作，形成功能复合体，参与调控各种生物学途径，如信号传导、细胞分裂、转录调控等。目前，植物中WD40蛋白的功能研究主要在拟南芥中进行，已有9个WD蛋白的功能已被发掘和报道。经检索，目前还未见大豆WD40蛋白及其相关功能的报道。

发明内容

针对目前的技术状况，本发明的目的是提供一种大豆(Glycine max(L.)Merr)威廉姆斯82(Williams 82)中WD40蛋白基因——GmPRL1b及其应用。

本发明所述的大豆威廉姆斯82中含有WD40结构域蛋白基因，其特征在于：所述基因命名为大豆威廉姆斯82中WD40结构域蛋白基因GmPRL1b，该基因cDNA的核苷酸序列如SEQID No.1所示。

本发明还提供了一种含有上述大豆威廉姆斯82中WD40结构域蛋白基因GmPRL1b的植物表达载体，其特征在于：所述植物表达载体命名为植物表达载体pB2GW7::GmPRL1b，该表达载体克隆区域核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

本发明所述大豆威廉姆斯82中WD40结构域蛋白基因GmPRL1b在提高植株耐盐中的应用。

本发明所述大豆威廉姆斯82中WD40结构域蛋白基因GmPRL1b在提高植株抗灰霉病中的应用。

上述的应用中，所述植株优选是大豆或拟南芥。进一步的，所述拟南芥是Col-0野生型，大豆品种是威廉姆斯82。

本发明还提供了所述植物表达载体pB2GW7::GmPRL1b在提高植株耐盐中的应用。

本发明还提供了所述植物表达载体pB2GW7::GmPRL1b在提高植株抗灰霉病中的应用。

其中：所述植株优选是大豆或拟南芥。

本发明中，申请人从大豆Williams 82中分离得到WD蛋白基因—GmPRL1b，将该基因转到模式植物拟南芥中证明其功能，结果得到了抗灰霉病、耐盐性改变的转基因拟南芥植株。

具体的，大豆威廉姆斯82中WD40结构域蛋白基因GmPRL1b在拟南芥植株中表达GmPRL1b的例证。

申请人首先在Williams 82植株中克隆到了WD40蛋白基因GmPRL1b(SEQ IDNo.1)；利过Gateway系统将GmPRL1b基因通过BP反应连接到pDONR221载体上(见图1)，然后通过转化的方法在大肠杆菌DH5α中得到大量克隆，接着进行LR反应把此基因GmPRL1b连接到表达载体pB2GW7(见图2,3)上，并在大肠杆菌DH5α中表达；接着筛选转基因大肠杆菌，并提取转化质粒，最后将转化质粒转入农杆菌菌株EHA105中。将转化农杆菌菌株转入模式植物拟南芥(图4)，验证表达了基因GmPRL1b具有提高植株耐盐和提高植株抗灰霉病的功能(图5，图6)。

本发明的有益效果是：利用现有的植物基因工程技术，申请人首次克隆得到了Williams 82WD蛋白基因GmPRL1b并在拟南芥中进行表达，实验证实转基因拟南芥的灰霉病抗性及耐盐性均高于非转基因拟南芥。充分证明了本发明所述的大豆威廉姆斯82WD蛋白基因GmPRL1b在提高植株在抗病、耐盐中具有重要的作用，预示本发明所述的基因可广泛用于抗病、耐盐的植物品种的改良。

附图说明

图1为入门载体pDONR221图谱。

图2为植物表达载体pB2GW7图谱。

图3为Williams 82NAC转录因子基因GmPRL1b的CDS全长克隆电泳图

其中：M为Marker，泳道GmPRL1b CDS以大豆Williams 82cDNA为模板克隆获得的GmPRL1b CDS。

图4为Williams 82WD蛋白基因GmPRL1b在转基因拟南芥中RT-PCR表达分析。

其中：WT:野生型拟南芥。1-12：35S::GmPRL1b转基因拟南芥株系。

图5为35S::GmPRL1b转基因拟南芥植株灰霉抗性分析

其中：A图为转基因植株及对照侵染灰霉2天后的叶片照片，B图为侵染菌斑直径的统计结果(Student’s t-test，***表示p<0.001,n>15)，误差线表示标准误差。OE-1和OE-2分别代表2个GmPRL1b拟南芥过表达转基因纯系，Col-0为野生型拟南芥。

图6为35S::GmPRL1b转基因拟南芥植株耐盐性分析

其中：A图为转基因植株及对照在Mock和100mmol/L NaCl胁迫下生长7天的照片(根长表型)，植物在1/2MS固体培养基上生长，根长长到1cm再移到添加或不添加NaCl的1/2MS固体培养基上竖直生长7天后对根长进行照相和测量；B图为根长统计数据结果。OE-1和OE-2分别代表2个GmPRL1b拟南芥过表达转基因纯系，Col-0为野生型拟南芥。柱状图代表根长平均值，误差线代表标准方差，星号代表转基因植株与Col-0植株根长的差异显著性(Student’s t-test，*：P<0.05，**:P<0.01，***:P<0.001，n＝15)。

具体实施方式

下面结合具体附图和实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，应该说明的是，下述说明仅仅是为了解释本发明，并非对本发明作任何形式上的限制。

下述实施例中，所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均从商业途径得到。所述的实验方法如无特殊说明，均为本领域常规方法。

实施例1、GmPRL1b的克隆及植物表达载体构建

1.1Williams 82总RNA的提取

(1)将Williams 82植物材料放入研钵中，利用液氮将其研磨成粉末(直接应用于下面的实验或者冻于-80℃超低温冰箱保存备用)；

(2)等液氮挥发后，立即将100mg组织粉末转入到1.5ml离心管中，然后迅速的加入1ml Trizol提取液，涡旋震荡使样品充分溶入提取液中，室温放置5min；

(3)4℃，12,000rpm，离心10min，将0.9ml上清液转移到新的1.5ml离心管中，再加入0.2ml氯仿剧烈振荡混匀15sec，室温放置2-5min；

(4)4℃，12,000rpm，离心10min，将0.4ml上清液转移到新的1.5ml离心管中，再加入0.4ml异丙醇，上下翻转15次混匀溶液，室温放置15mim；

(5)4℃，12,000rpm，离心10min，弃上清，用1ml 75％的乙醇洗涤沉淀两次，4℃，8,000rpm，离心5min；

(6)弃上清，开盖于超净工作台中上干燥RNA约2-5min，加入40μl RNase-Free水，在60℃中充分溶解RNA 10min；

(7)用紫外分光光度计测RNA样品的OD值和浓度，A₂₆₀/A₂₈₀达到1.7-2.0为佳；琼脂糖凝胶电泳检测质量。

1.2RNA的反转录

(1)向离心管中依次加入下列物质(40μl反应体系)：

(2)轻轻混匀后，65℃变性5min，立即插到冰上，冰浴至少1min；

(3)向离心管中依次加入下列物质

(4)轻轻混匀后，42℃恒温水浴1h，65℃变性10min，-20℃保存备用。

1.3GmPRL1b基因克隆

GmPRL1b OX-F：5’-:AA AAAGCAGGCTACATGGAGGTGGAGCCCGTGG-3’

GmPRL1b OX-R：5’-A GAA AGC TGG CTA GAATCGACGGATGTCTTTAGGA-3’

(1)高保真酶Primer Star进行Gateway系统的第一步扩增的反应体系如下(50μl体系)：

扩增条件如下：

反应结束后，反应液于0.8％TAE琼脂糖凝胶电泳检测。

(2)克隆基因片段的纯化回收(天根试剂盒)

1)将切下带有目的片段的凝胶放入1.5ml离心管并称凝胶重量，加入3倍体积的溶胶液，60℃溶胶10min，溶胶期间不断的翻转；

2)凝胶完全融化后，全部吸取到回收柱中，放置片刻；

3)室温，12000rpm，离心30Sec，弃溶液；

4)在柱中加入700μl的漂洗液，12000rpm，离心1min，弃漂洗液；

5)在柱中加入500μl的漂洗液，12000rpm，离心1min，弃漂洗液；

6)空柱，12000rpm，离心2min；

7)回收柱开盖晾干1-2min，放入新的干净的1.5ml离心管，加入60℃预热的40μl灭菌水或者EB缓冲液，放置2min；

8)12000rpm离心1min，所得溶液即为回收片段。

(3)高保真酶Primer Star进行Gateway系统的第二步扩增。

attb引物序列：

attb-F：5’-G GGG ACA AGT TTG TAC AAA AAA GCA GGC T-3’

attb-R：5’-GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GT-3’

反应体系如下(50μl体系)：

扩增条件如下：

反应结束后，反应液于0.8％TAE琼脂糖凝胶电泳检测，见图3。

1.4克隆基因片段的BP反应

BP反应(Gateway系统)体系如下：

25℃反应8小时-过夜。

1.5大肠杆菌感受态的制备(无菌操作)

(1)取DH5α菌种接种于20ml LB液体培养基中，37℃摇床培养过夜；

(2)按1:100接种于50ml LB液体培养基中，37℃，200rpm培养1小时，至OD₆₀₀值为0.4-0.6；

(3)将菌液放置在冰上30min；

(4)4℃，4200rpm，离心10min，弃上清，加入10ml预冷的0.1M的CaCl₂悬浮菌体；

(5)将菌液放置在冰上10min；

(6)4℃，4200rpm，离心10min，弃上清，加入2ml预冷的0.1M的CaCl₂悬浮菌体，分装于1.5ml离心管中，现用或加入终体积30％甘油经液氮速冻后-80℃保存备用。

1.6大肠杆菌的质粒转化(无菌操作)

(1)将1-5μl质粒DNA或者连接产物加入50μl的感受态细胞中，轻弹离心管混匀，冰浴30min；

(2)42℃，温水浴热激90sec，立即冰浴2-3min；

(3)加入1ml LB培养基，37℃培养40-50min；

(4)室温，4000rpm，离心3min，收集菌体；

(5)将菌涂布于含有相应抗生素的培养平板上，37℃倒置培养过夜。

1.7大肠杆菌PCR验证

反应体系如下(20μl体系)：

扩增条件如下：

反应结束后，反应液于0.8％TAE琼脂糖凝胶电泳检测。

1.8DNA测序

挑取含有重组质粒的阳性单菌落用含有卡那霉素(25mg/L)的液体LB摇过夜，然后送上海博亚生物技术有限公司测序，得到测序结果：基因cDNA序列如序列表SEQ ID No.1所示。

经过序列分析，上述cDNA序列与大豆Willms82的核苷酸同源100％，三次实验证明得到的就是Willms82 WD蛋白基因，命名为GmPRL1b，所述基因GmPRL1b的cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

1.9大肠杆菌质粒DNA的提取

(1)挑取单克隆接种于10ml含有相应抗生素的LB液体培养基中，37℃培养8h；

(2)室温，12,000rpm，离心1min，收集菌体；

(3)弃上清，加入100μl低温预冷的溶液I，振荡悬浮菌体；

(4)加200μl新鲜配制的溶液II，快速翻转混匀，冰浴5min；

(5)溶液澄清后加入150μl低温预冷的溶液III，轻轻混匀后冰浴5min；

(6)4℃，12000rpm，离心10min，吸取上清至新的1.5ml离心管中；

(7)加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)，振荡混匀；

(8)室温，12,000rpm，离心10min，转移上层水相于另一新的1.5ml离心管中，加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，再抽提一次，振荡混匀；

(9)室温，12,000rpm，离心10min，转移上层水相于另一新的1.5ml离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀并于-20℃放置30min；

(10)室温，12,000rpm，离心10min，弃上清保留沉淀。

(11)用75％乙醇洗涤沉淀两次，真空干燥5min，溶于40μl灭菌水，放至-20℃保存备用。

1.10克隆基因片段的LR反应

LR反应(Gateway系统)体系如下：

25℃反应8小时。

1.11大肠杆菌感受态的制备和质粒转化(同1.5、1.6)

1.12大肠杆菌PCR验证(同1.7)

1.13大肠杆菌质粒DNA的提取(同1.9)

验证转入pB2GW7(核苷酸序列如SEQ ID No.3所示)载体的阳性pB2GW7::GmPRL1b质粒的克隆区域，所述pB2GW7::GmPRL1b质粒核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

1.14农杆菌感受态的制备(无菌操作)

(1)取农杆菌EHA105菌种接种于10ml YEP液体培养基中，28℃摇床培养过夜；

(2)按1：50接种于50ml YEP液体培养基中，28℃振荡培养3-4小时，至OD₆₀₀值为0.4-0.6；

(3)4℃，4,200rpm，离心10min，收集菌体；

(4)弃上清，加入10ml预冷的0.15mol/L的NaCl悬浮菌体；

(5)重复步骤3；

(6)弃上清，加入2ml预冷的20mmol/L的CaCl₂悬浮菌体，分装于1.5ml离心管中，现用或加入终体积7％DMSO经液氮速冻后-80℃保存备用。

1.15农杆菌的质粒转化(无菌操作)

(1)将10μl质粒DNA加入50μl的感受态细胞中，轻弹离心管混匀，冰浴30min；

(2)液氮速冻1min；然后37℃水浴5min，立即冰浴2-3min；

(3)加入1ml YEP培养基，28℃培养2-4h；

(4)室温，4,000rpm，离心3min，收集菌体；

(5)将菌涂布于含有相应抗生素的YEP培养平板上，28℃倒置培养48h。

1.16转化农杆菌的PCR验证

反应体系如下(20μl体系)：

扩增条件如下：

反应结束后，反应液于0.8％TAE琼脂糖凝胶电泳检测。

实施例2、在拟南芥中表达Williams 82WD蛋白基因GmPRL1b的功能验证

2.1花侵染法转化拟南芥

(1)拟南芥(Col-0野生型)生长至抽苔1cm时，将顶端减掉以诱导侧生花序的生成；

(2)在转化前一天，取1ml活化过的含有表达载体质粒的农杆菌EHA105加到含相应抗生素及50μg/ml利福平的40ml YEP培养基中，28℃震荡培养至OD₆₀₀约为1.0-1.2；

(3)室温，4,200rpm,离心10min，收集菌体，用浸染液(5％蔗糖，0.02％Silwet L-77)重悬菌体，使OD₆₀₀约为0.8；

(4)用移液器将农杆菌滴到花序上进行浸染，待所有花序都被侵染后，将拟南芥放入真空干燥器中抽真空1min；

(5)用保鲜袋覆盖花序，至于20-22℃避光培养一天剪开顶部露出花序，再培养一天后揭去保鲜袋，培养至种子成熟。

2.2拟南芥种子的表面消毒

将适量待灭菌的拟南芥中子放入1.5ml离心管中，加入1ml 75％的乙醇(含有0.03％体积比的TritonX-100)震荡消毒1min，再用90％的乙醇震荡消毒1min(两次)，最后用吸头将种子吸到无菌滤纸上吹干，然后用无菌的牙签将其点入培养基中。

2.3转基因植株的筛选

对收获的T₀代种子进行表面消毒，然后后均匀涂布于1/2MS平板上(含Basta)。春化处理3d后移入人工气候室生长。萌发约10天，子叶深绿色的植株为转基因植株，而子叶发浅绿甚至黄化的植株为非转基因植株。将转基因植株转入土中生长直至收获得到T₁代转基因种子，T₁代植株单株收种子，每株收取的种子继续筛选，将后代分离比为3∶1(阳性∶阴性)的阳性植株移栽后生长至收获T₂代转基因种子，单株收种后，每株收取的种子经筛选可以得到纯系T₂代转基因种子。

2.4植物RNA的提取

(1)将植物材料放入研钵中，利用液氮将其研磨成粉末(直接应用于下面的实验或者冻于-80℃超低温冰箱保存备用)；

(2)等液氮挥发后，立即将100-200mg植物粉末转入到1.5ml离心管中，然后迅速的加入1ml Trizol提取液，涡旋震荡使样品充分溶入提取液中，室温放置5min；

(3)4℃，12,000rpm，离心10min，将0.9ml上清液转移到新的1.5ml离心管中，再加入0.2ml氯仿剧烈振荡混匀15sec，室温放置2-5min；

(4)4℃，12,000rpm，离心10min，将0.4ml上清液转移到新的1.5ml离心管中，再加入0.4ml异丙醇，上下翻转15次混匀溶液，室温放置15mim；

(5)4℃，12,000rpm，离心10min，弃上清，用1ml 75％的乙醇洗涤沉淀两次，4℃，8,000rpm，

离心5min；

(6)弃上清，开盖于超净工作台中上干燥RNA约2-5min，加入40μl RNase-Free水，在60℃中充分溶解RNA 10min；

(7)用紫外分光光度计测RNA样品的OD值和浓度，A₂₆₀/A₂₈₀达到1.7-2.0为佳；琼脂糖凝胶电泳检测质量。

2.5RNA的反转录

(1)向离心管中依次加入下列物质(40μl反应体系)：

(2)轻轻混匀后，65℃变性5min，立即插到冰上，冰浴至少1min；

(3)向离心管中依次加入下列物质

(4)轻轻混匀后，42℃恒温水浴1h，65℃变性10min，-20℃保存备用。

2.6转基因植株的RT-PCR检测

PCR法筛选转基因阳性植株：将具有抗性的植株的cDNA用GmPRL1b基因RT-PCR引物进行PCR检测。

GmPRL1b基因RT-PCR引物序列：

GmPRL1bRT-F：5’-GAGTGGTGTTTATTGCTTGG-3’

GmPRL1bRT-R：5’-ACAATTGTTTGGGATTGCTG-3’

GmTUB基因作为内标，其引物序列为：

GmTUBRT-F：5’-CTCAAGAGGTTCTCAGCAGTA-3’

GmTUBRT-R：5’-TCACCTTCTTCATCCGCAGTT-3’

普通Taq酶进行RT-PCR扩增的反应如下(15μl体系)：

扩增条件如下：

注：内标基因选用GmTUB。

结果见图5。

2.7转基因拟南芥灰霉抗性检测

(1)沙氏麦芽糖肉汤培养基1g加至100mL水中,搅拌混匀。

(2)挑取灰霉菌块至上述悬浮液中，涡旋振荡，用2层滤布过滤，调孢子浓度至105个/mL。

(3)取4uL孢子悬浮液，一株拟南芥取3片生长一致的叶片，点在主叶脉的同一侧，保湿处理后，22℃，黑暗培养，2d后统计病斑大小。

结果：灰霉侵染后，GmPRL1b-OE1、GmPRL1b-OE2叶片上的病斑大小显著小于对照植株Col-0，对15个以上单株叶片病斑大小的统计性结果也说明同一结论，证明GmPRL1b转基因拟南芥具有更强的灰霉抗性。

结果见图5。

2.8转基因拟南芥耐盐性检测

(1)拟南芥种子的表面消毒(同2.2)。

(2)NaCl处理

将无菌的Col-0、GmPRL1b-OE1、GmPRL1b-OE2纯系种子分别均匀撒在于1/2MS培养基平板上。春化处理3天后移入人工气候室生长。萌发约3d，根长至0.5cm左右，将拟南芥小苗移至添加不同浓度NaCl(0、100、125mmol/L)的1/2MS培养基平板上。待小苗长至8d，观察小苗根长生长状况。

结果：在正常的1/2MS培养基上，GmPRL1b-OE1、GmPRL1b-OE2和Col-0主根长度无明显差异。在含150mMNaCl的1/2MS培养基中，GmPRL1b-OE1、GmPRL1b-OE2的主根平均长度均高于Col-0，说明转基因植株主根伸长对盐胁迫有较高的耐受性。

结果见图6。

序列表

<110> 山东大学

<120>大豆WD40蛋白基因GmPRL1b及其应用

<141> 2020-10-06

<160>4

<210> 1

<211> 1431

<212> cDNA

<213> 大豆(Glycine max?(L.) Merr)

<221>大豆威廉姆斯D40蛋白基因GmPRL1b核苷酸序列

<222>（1）…（1431）

<400>1

atggaggtgg agcccgtgga gccacagtcg ctaaagaagc taagcttcaa gtctctgaag 60

cgcgctctcg atctcttctc tcccattcac ggacacctcg ctcctcccga tgccgaaagc 120

aagaaaatcc gcactagcca caaggtgagc gtggagtatg gcggaatcaa aagcactgct 180

aatcaacctc ctcatcaagt tagttctgcc acacaggatc cagggccctc taacactctt 240

gctcttccag gtccaggaga ttccaaggat tctcagaaag gaggacccca aaatgccttg 300

gttgttggtc caactatgcc atccacaaca ccgaatgata ctggctttca gagcaaaagt 360

acagcggttg tttcagcctc tggttcatct gaaagaaatt tatcaacatc tgctttgatg 420

gaaagaatgc caagtaaatg gccacgtcct gtatggcatg caccatggaa gaactacagg 480

gtcatcagcg gccacttagg atgggtgaga tctgttgcag ttgatcccag taacacatgg 540

ttttgtactg gttctgcaga tcgaactatc aagatatggg acttggcaag tggagtattg 600

aagctcacat taacaggcca cattgaacaa gttagaggtc ttgctgttag caacagacat 660

acttacatgt tctctgctgg tgatgataaa caagttaaat gttgggacct tgaacagaat 720

aaggttatta gatcttatca tggtcatctg agtggtgttt attgcttggc tcttcatccc 780

acaattgacg ttttactaac cggaggacgt gattctgtct gccgggtttg ggatatacga 840

agtaaaatgc agattcatgc tctttcagga catgataaca ctgtctgctc tgtgtttacg 900

cggccgacgg atccccaagt tgttacgggt tctcatgaca ctaccatcaa gatgtgggac 960

cttagatatg gtaaaacaat gtcaactctt acaaaccata aaaaatctgt tcgagcaatg 1020

gcccagcatc ccaaagagca agcttttgca tctgcttcag ctgacaatat taaaaagttc 1080

aaccttccaa aaggagaatt tttgcacaac atgctctctc aacagaaaac tatcatcaat 1140

gcaatggctg tcaatgagga gggtgtgatg gttactggag gtgacaatgg cagcatgtgg 1200

ttctgggatt ggaagagtgg tcataatttc cagcaatccc aaacaattgt acagcctggt 1260

tccctggata gtgaagctgg tatttatgct tgtacctatg atcttactgg ctcgaggctt 1320

ataacctgcg aggctgacaa gacgataaaa atgtggaaag aagacgagag tgccactcca 1380

gaaacccatc cccttaactt caggcctcct aaagacatcc gtcgattcta g 1431

<210> 2

<211> 4760

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 入门载体pDONR221

<222>（1）…（4760）

<400> 2

ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga 60

taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga 120

gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca 180

cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaata cgcgtaccgc 240

tagccaggaa gagtttgtag aaacgcaaaa aggccatccg tcaggatggc cttctgctta 300

gtttgatgcc tggcagttta tggcgggcgt cctgcccgcc accctccggg ccgttgcttc 360

acaacgttca aatccgctcc cggcggattt gtcctactca ggagagcgtt caccgacaaa 420

caacagataa aacgaaaggc ccagtcttcc gactgagcct ttcgttttat ttgatgcctg 480

gcagttccct actctcgcgt taacgctagc atggatgttt tcccagtcac gacgttgtaa 540

aacgacggcc agtcttaagc tcgggcccca aataatgatt ttattttgac tgatagtgac 600

ctgttcgttg caacaaattg atgagcaatg cttttttata atgccaactt tgtacaaaaa 660

agctgaacga gaaacgtaaa atgatataaa tatcaatata ttaaattaga ttttgcataa 720

aaaacagact acataatact gtaaaacaca acatatccag tcactatgaa tcaactactt 780

agatggtatt agtgacctgt agtcgaccga cagccttcca aatgttcttc gggtgatgct 840

gccaacttag tcgaccgaca gccttccaaa tgttcttctc aaacggaatc gtcgtatcca 900

gcctactcgc tattgtcctc aatgccgtat taaatcataa aaagaaataa gaaaaagagg 960

tgcgagcctc ttttttgtgt gacaaaataa aaacatctac ctattcatat acgctagtgt 1020

catagtcctg aaaatcatct gcatcaagaa caatttcaca actcttatac ttttctctta 1080

caagtcgttc ggcttcatct ggattttcag cctctatact tactaaacgt gataaagttt 1140

ctgtaatttc tactgtatcg acctgcagac tggctgtgta taagggagcc tgacatttat 1200

attccccaga acatcaggtt aatggcgttt ttgatgtcat tttcgcggtg gctgagatca 1260

gccacttctt ccccgataac ggagaccggc acactggcca tatcggtggt catcatgcgc 1320

cagctttcat ccccgatatg caccaccggg taaagttcac gggagacttt atctgacagc 1380

agacgtgcac tggccagggg gatcaccatc cgtcgcccgg gcgtgtcaat aatatcactc 1440

tgtacatcca caaacagacg ataacggctc tctcttttat aggtgtaaac cttaaactgc 1500

atttcaccag cccctgttct cgtcagcaaa agagccgttc atttcaataa accgggcgac 1560

ctcagccatc ccttcctgat tttccgcttt ccagcgttcg gcacgcagac gacgggcttc 1620

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acatacttcg ggtatacata tcagtatata ttcttatacc gcaaaaatca gcgcgcaaat 1800

acgcatactg ttatctggct tttagtaagc cggatccacg cggcgtttac gccccccctg 1860

ccactcatcg cagtactgtt gtaattcatt aagcattctg ccgacatgga agccatcaca 1920

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actggtgaaa ctcacccagg gattggctga gacgaaaaac atattctcaa taaacccttt 2100

agggaaatag gccaggtttt caccgtaaca cgccacatct tgcgaatata tgtgtagaaa 2160

ctgccggaaa tcgtcgtggt attcactcca gagcgatgaa aacgtttcag tttgctcatg 2220

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ctggttatag gtacattgag caactgactg aaatgcctca aaatgttctt tacgatgcca 2460

ttgggatata tcaacggtgg tatatccagt gatttttttc tccattttag cttccttagc 2520

tcctgaaaat ctcgataact caaaaaatac gcccggtagt gatcttattt cattatggtg 2580

aaagttggaa cctcttacgt gccgatcaac gtctcatttt cgccaaaagt tggcccaggg 2640

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actaatacca tctaagtagt tgattcatag tgactggata tgttgtgttt tacagtatta 2820

tgtagtctgt tttttatgca aaatctaatt taatatattg atatttatat cattttacgt 2880

ttctcgttca gctttcttgt acaaagttgg cattataaga aagcattgct tatcaatttg 2940

ttgcaacgaa caggtcacta tcagtcaaaa taaaatcatt atttgccatc cagctgatat 3000

cccctatagt gagtcgtatt acatggtcat agctgtttcc tggcagctct ggcccgtgtc 3060

tcaaaatctc tgatgttaca ttgcacaaga taaaaatata tcatcatgaa caataaaact 3120

gtctgcttac ataaacagta atacaagggg tgttatgagc catattcaac gggaaacgtc 3180

gaggccgcga ttaaattcca acatggatgc tgatttatat gggtataaat gggctcgcga 3240

taatgtcggg caatcaggtg cgacaatcta tcgcttgtat gggaagcccg atgcgccaga 3300

gttgtttctg aaacatggca aaggtagcgt tgccaatgat gttacagatg agatggtcag 3360

actaaactgg ctgacggaat ttatgcctct tccgaccatc aagcatttta tccgtactcc 3420

tgatgatgca tggttactca ccactgcgat ccccggaaaa acagcattcc aggtattaga 3480

agaatatcct gattcaggtg aaaatattgt tgatgcgctg gcagtgttcc tgcgccggtt 3540

gcattcgatt cctgtttgta attgtccttt taacagcgat cgcgtatttc gtctcgctca 3600

ggcgcaatca cgaatgaata acggtttggt tgatgcgagt gattttgatg acgagcgtaa 3660

tggctggcct gttgaacaag tctggaaaga aatgcataaa cttttgccat tctcaccgga 3720

ttcagtcgtc actcatggtg atttctcact tgataacctt atttttgacg aggggaaatt 3780

aataggttgt attgatgttg gacgagtcgg aatcgcagac cgataccagg atcttgccat 3840

cctatggaac tgcctcggtg agttttctcc ttcattacag aaacggcttt ttcaaaaata 3900

tggtattgat aatcctgata tgaataaatt gcagtttcat ttgatgctcg atgagttttt 3960

ctaatcagaa ttggttaatt ggttgtaaca ctggcagagc attacgctga cttgacggga 4020

cggcgcaagc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagttac gcgtcgttcc actgagcgtc 4080

agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg 4140

ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct 4200

accaactctt tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgttct 4260

tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct 4320

cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg 4380

gttggactca agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc 4440

gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga 4500

gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg 4560

cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta 4620

tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg 4680

ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg 4740

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<210> 3

<211> 10882

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 植物表达载体pB2GW7核苷酸序列

<222>（1）…（10882）

<400> 3

ctcccatatg gtcgactaga gccaagctga tctcctttgc cccggagatc accatggacg 60

actttctcta tctctacgat ctaggaagaa agttcgacgg agaaggtgac gataccatgt 120

tcaccaccga taatgagaag attagcctct tcaatttcag aaagaatgct gacccacaga 180

tggttagaga ggcctacgcg gcaggtctca tcaagacgat ctacccgagt aataatctcc 240

aggagatcaa ataccttccc aagaaggtta aagatgcagt caaaagattc aggactaact 300

gcatcaagaa cacagagaaa gatatatttc tcaagatcag aagtactatt ccagtatgga 360

cgattcaagg cttgcttcat aaaccaaggc aagtaataga gattggagtc tctaagaaag 420

tagttcctac tgaatcaaag gccatggagt caaaaattca gatcgaggat ctaacagaac 480

tcgccgtgaa gactggcgaa cagttcatac agagtctttt acgactcaat gacaagaaga 540

aaatcttcgt caacatggtg gagcacgaca ctctcgtcta ctccaagaat atcaaagata 600

cagtctcaga agaccaaagg gctattgaga cttttcaaca aagggtaata tcgggaaacc 660

tcctcggatt ccattgccca gctatctgtc acttcatcaa aaggacagta gaaaaggaag 720

gtggcaccta caaatgccat cattgcgata aaggaaaggc tatcgttcaa gatgcctctg 780

ccgacagtgg tcccaaagat ggacccccac ccacgaggag catcgtggaa aaagaagacg 840

ttccaaccac gtcttcaaag caagtggatt gatgtgatat ctccactgac gtaagggatg 900

acgcacaatc ccactatcct tcgcaagacc cttcctctat ataaggaagt tcatttcatt 960

tggagaggac tccggtattt ttacaacaat accacaacaa aacaaacaac aaacaacatt 1020

acaatttact attctagtcg acctgcaggc ggccgcacta gtgatatcac aagtttgtac 1080

aaaaaagctg aacgagaaac gtaaaatgat ataaatatca atatattaaa ttagattttg 1140

cataaaaaac agactacata atactgtaaa acacaacata tccagtcact atggcggccg 1200

cattaggcac cccaggcttt acactttatg cttccggctc gtataatgtg tggattttga 1260

gttaggatcc ggcgagattt tcaggagcta aggaagctaa aatggagaaa aaaatcactg 1320

gatataccac cgttgatata tcccaatggc atcgtaaaga acattttgag gcatttcagt 1380

cagttgctca atgtacctat aaccagaccg ttcagctgga tattacggcc tttttaaaga 1440

ccgtaaagaa aaataagcac aagttttatc cggcctttat tcacattctt gcccgcctga 1500

tgaatgctca tccggaattc cgtatggcaa tgaaagacgg tgagctggtg atatgggata 1560

gtgttcaccc ttgttacacc gttttccatg agcaaactga aacgttttca tcgctctgga 1620

gtgaatacca cgacgatttc cggcagtttc tacacatata ttcgcaagat gtggcgtgtt 1680

acggtgaaaa cctggcctat ttccctaaag ggtttattga gaatatgttt ttcgtctcag 1740

ccaatccctg ggtgagtttc accagttttg atttaaacgt ggccaatatg gacaacttct 1800

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tggcgattca ggttcatcat gccgtctgtg atggcttcca tgtcggcaga atgcttaatg 1920

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taaaagccag ataacagtat gcgtatttgc gcgctgattt ttgcggtata agaatatata 2040

ctgatatgta tacccgaagt atgtcaaaaa gaggtgtgct atgaagcagc gtattacagt 2100

gacagttgac agcgacagct atcagttgct caaggcatat atgatgtcaa tatctccggt 2160

ctggtaagca caaccatgca gaatgaagcc cgtcgtctgc gtgccgaacg ctggaaagcg 2220

gaaaatcagg aagggatggc tgaggtcgcc cggtttattg aaatgaacgg ctcttttgct 2280

gacgagaaca gggactggtg aaatgcagtt taaggtttac acctataaaa gagagagccg 2340

ttatcgtctg tttgtggatg tacagagtga tattattgac acgcccgggc gacggatggt 2400

gatccccctg gccagtgcac gtctgctgtc agataaagtc tcccgtgaac tttacccggt 2460

ggtgcatatc ggggatgaaa gctggcgcat gatgaccacc gatatggcca gtgtgccggt 2520

ctccgttatc ggggaagaag tggctgatct cagccaccgc gaaaatgaca tcaaaaacgc 2580

cattaacctg atgttctggg gaatataaat gtcaggctcc cttatacaca gccagtctgc 2640

aggtcgacca tagtgactgg atatgttgtg ttttacagta ttatgtagtc tgttttttat 2700

gcaaaatcta atttaatata ttgatattta tatcatttta cgtttctcgt tcagctttct 2760

tgtacaaagt ggtgatatcc cgcggccatg ctagagtccg caaaaatcac cagtctctct 2820

ctacaaatct atctctctct atttttctcc agaataatgt gtgagtagtt cccagataag 2880

ggaattaggg ttcttatagg gtttcgctca tgtgttgagc atataagaaa cccttagtat 2940

gtatttgtat ttgtaaaata cttctatcaa taaaatttct aattcctaaa accaaaatcc 3000

agtgacctgc aggcatgcga cgtcgggccc aagcttagct tgagcttgga tcagattgtc 3060

gtttcccgcc ttcagtttaa actatcagtg tttgacagga tatattggcg ggtaaaccta 3120

agagaaaaga gcgtttatta gaataacgga tatttaaaag ggcgtgaaaa ggtttatccg 3180

ttcgtccatt tgtatgtgca tgccaaccac agggttcccc tcgggatcaa agtactttga 3240

tccaacccct ccgctgctat agtgcagtcg gcttctgacg ttcagtgcag ccgtcttctg 3300

aaaacgacat gtcgcacaag tcctaagtta cgcgacaggc tgccgccctg cccttttcct 3360

ggcgttttct tgtcgcgtgt tttagtcgca taaagtagaa tacttgcgac tagaaccgga 3420

gacattacgc catgaacaag agcgccgccg ctggcctgct gggctatgcc cgcgtcagca 3480

ccgacgacca ggacttgacc aaccaacggg ccgaactgca cgcggccggc tgcaccaagc 3540

tgttttccga gaagatcacc ggcaccaggc gcgaccgccc ggagctggcc aggatgcttg 3600

accacctacg ccctggcgac gttgtgacag tgaccaggct agaccgcctg gcccgcagca 3660

cccgcgacct actggacatt gccgagcgca tccaggaggc cggcgcgggc ctgcgtagcc 3720

tggcagagcc gtgggccgac accaccacgc cggccggccg catggtgttg accgtgttcg 3780

ccggcattgc cgagttcgag cgttccctaa tcatcgaccg cacccggagc gggcgcgagg 3840

ccgccaaggc ccgaggcgtg aagtttggcc cccgccctac cctcaccccg gcacagatcg 3900

cgcacgcccg cgagctgatc gaccaggaag gccgcaccgt gaaagaggcg gctgcactgc 3960

ttggcgtgca tcgctcgacc ctgtaccgcg cacttgagcg cagcgaggaa gtgacgccca 4020

ccgaggccag gcggcgcggt gccttccgtg aggacgcatt gaccgaggcc gacgccctgg 4080

cggccgccga gaatgaacgc caagaggaac aagcatgaaa ccgcaccagg acggccagga 4140

cgaaccgttt ttcattaccg aagagatcga ggcggagatg atcgcggccg ggtacgtgtt 4200

cgagccgccc gcgcacgtct caaccgtgcg gctgcatgaa atcctggccg gtttgtctga 4260

tgccaagctg gcggcctggc cggccagctt ggccgctgaa gaaaccgagc gccgccgtct 4320

aaaaaggtga tgtgtatttg agtaaaacag cttgcgtcat gcggtcgctg cgtatatgat 4380

gcgatgagta aataaacaaa tacgcaaggg gaacgcatga aggttatcgc tgtacttaac 4440

cagaaaggcg ggtcaggcaa gacgaccatc gcaacccatc tagcccgcgc cctgcaactc 4500

gccggggccg atgttctgtt agtcgattcc gatccccagg gcagtgcccg cgattgggcg 4560

gccgtgcggg aagatcaacc gctaaccgtt gtcggcatcg accgcccgac gattgaccgc 4620

gacgtgaagg ccatcggccg gcgcgacttc gtagtgatcg acggagcgcc ccaggcggcg 4680

gacttggctg tgtccgcgat caaggcagcc gacttcgtgc tgattccggt gcagccaagc 4740

ccttacgaca tatgggccac cgccgacctg gtggagctgg ttaagcagcg cattgaggtc 4800

acggatggaa ggctacaagc ggcctttgtc gtgtcgcggg cgatcaaagg cacgcgcatc 4860

ggcggtgagg ttgccgaggc gctggccggg tacgagctgc ccattcttga gtcccgtatc 4920

acgcagcgcg tgagctaccc aggcactgcc gccgccggca caaccgttct tgaatcagaa 4980

cccgagggcg acgctgcccg cgaggtccag gcgctggccg ctgaaattaa atcaaaactc 5040

atttgagtta atgaggtaaa gagaaaatga gcaaaagcac aaacacgcta agtgccggcc 5100

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tacgccaagg caagaccatt accgagctgc tatctgaata catcgcgcag ctaccagagt 5280

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aatcaagaac aaccaggcac cgacgccgtg gaatgcccca tgtgtggagg aacgggcggt 5400

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ccggcaaccg ccggcagccg gtgcgccgtc gattaggaag ccgcccaagg gcgacgagca 5700

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ggaagggaag ggagacaagc ccggccgcgt gttccgtcca cacgttgcgg acgtactcaa 6000

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caagaacccg gacgtgctga cggttcaccc cgattacttt ttgatcgatc ccggcatcgg 6300

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caagacgatc tacgaacgca gtggcagcgc cggagagttc aagaagttct gtttcaccgt 6420

gcgcaagctg atcgggtcaa atgacctgcc ggagtacgat ttgaaggagg aggcggggca 6480

ggctggcccg atcctagtca tgcgctaccg caacctgatc gagggcgaag catccgccgg 6540

ttcctaatgt acggagcaga tgctagggca aattgcccta gcaggggaaa aaggtcgaaa 6600

aggtctcttt cctgtggata gcacgtacat tgggaaccca aagccgtaca ttgggaaccg 6660

gaacccgtac attgggaacc caaagccgta cattgggaac cggtcacaca tgtaagtgac 6720

tgatataaaa gagaaaaaag gcgatttttc cgcctaaaac tctttaaaac ttattaaaac 6780

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aaaagcgcct acccttcggt cgctgcgctc cctacgcccc gccgcttcgc gtcggcctat 6900

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ctatgcggca tcagagcaga ttgtactgag agtgcaccat atgcggtgtg aaataccgca 7260

cagatgcgta aggagaaaat accgcatcag gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc 7320

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gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa 7440

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cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag 7560

ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct 7620

taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg 7680

ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc 7740

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gtccaagata agcctgtcta gcttcaagta tgacgggctg atactgggcc ggcaggcgct 8460

ccattgccca gtcggcagcg acatccttcg gcgcgatttt gccggttact gcgctgtacc 8520

aaatgcggga caacgtaagc actacatttc gctcatcgcc agcccagtcg ggcggcgagt 8580

tccatagcgt taaggtttca tttagcgcct caaatagatc ctgttcagga accggatcaa 8640

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agatagccag atcaatgtcg atcgtggctg gctcgaagat acctgcaaga atgtcattgc 8760

gctgccattc tccaaattgc agttcgcgct tagctggata acgccacgga atgatgtcgt 8820

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ccgtaaccag caaatcaata tcactgtgtg gcttcaggcc gccatccact gcggagccgt 9000

acaaatgtac ggccagcaac gtcggttcga gatggcgctc gatgacgcca actacctctg 9060

atagttgagt cgatacttcg gcgatcaccg cttcccccat gatgtttaac tttgttttag 9120

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cgtaacgcgc ttgctgcttg gatgcccgag gcatagactg taccccaaaa aaacatgtca 9240

taacaagaag ccatgaaaac cgccactgcg ccgttaccac cgctgcgttc ggtcaaggtt 9300

ctggaccagt tgcgtgacgg cagttacgct acttgcatta cagcttacga accgaacgag 9360

gcttatgtcc actgggttcg tgcccgaatt gatcacaggc agcaacgctc tgtcatcgtt 9420

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tttatcctag tttgcgcgct atattttgtt ttctatcgcg tattaaatgt ataattgcgg 9840

gactctaatc ataaaaaccc atctcataaa taacgtcatg cattacatgt taattattac 9900

atgcttaacg taattcaaca gaaattatat gataatcatc gcaagaccgg caacaggatt 9960

caatcttaag aaactttatt gccaaatgtt tgaacgatct gcttgactct aggggtcatc 10020

agatttcggt gacgggcagg accggacggg gcggcaccgg caggctgaag tccagctgcc 10080

agaaacccac gtcatgccag ttcccgtgct tgaagccggc cgcccgcagc atgccgcggg 10140

gggcatatcc gagcgcctcg tgcatgcgca cgctcgggtc gttgggcagc ccgatgacag 10200

cgaccacgct cttgaagccc tgtgcctcca gggacttcag caggtgggtg tagagcgtgg 10260

agcccagtcc cgtccgctgg tggcgggggg agacgtacac ggtcgactcg gccgtccagt 10320

cgtaggcgtt gcgtgccttc cagggacccg cgtaggcgat gccggcgacc tcgccgtcca 10380

cctcggcgac gagccaggga tagcgctccc gcagacggac gaggtcgtcc gtccactcct 10440

gcggttcctg cggctcggta cggaagttga ccgtgcttgt ctcgatgtag tggttgacga 10500

tggtgcagac cgccggcatg tccgcctcgg tggcacggcg gatgtcggcc gggcgtcgtt 10560

ctgggctcat ggtagatccc ctcgatcgag ttgagagtga atatgagact ctaattggat 10620

accgagggga atttatggaa cgtcagtgga gcatttttga caagaaatat ttgctagctg 10680

atagtgacct taggcgactt ttgaacgcgc aataatggtt tctgacgtat gtgcttagct 10740

cattaaactc cagaaacccg cggctcagtg gctccttcaa cgttgcggtt ctgtcagttc 10800

caaacgtaaa acggcttgtc ccgcgtcatc ggcgggggtc ataacgtgac tcccttaatt 10860

ctcatgtatg ataattcgag ct 10882

<210> 4

<211> 10658

<212> DNA

<213> 人工序列

<221>含有基因GmPRL1b的植物表达载体pB2GW7::GmPRL1b

<222>（1）…（10658）

<400> 4

ctcccatatg gtcgactaga gccaagctga tctcctttgc cccggagatc accatggacg 60

actttctcta tctctacgat ctaggaagaa agttcgacgg agaaggtgac gataccatgt 120

tcaccaccga taatgagaag attagcctct tcaatttcag aaagaatgct gacccacaga 180

tggttagaga ggcctacgcg gcaggtctca tcaagacgat ctacccgagt aataatctcc 240

aggagatcaa ataccttccc aagaaggtta aagatgcagt caaaagattc aggactaact 300

gcatcaagaa cacagagaaa gatatatttc tcaagatcag aagtactatt ccagtatgga 360

cgattcaagg cttgcttcat aaaccaaggc aagtaataga gattggagtc tctaagaaag 420

tagttcctac tgaatcaaag gccatggagt caaaaattca gatcgaggat ctaacagaac 480

tcgccgtgaa gactggcgaa cagttcatac agagtctttt acgactcaat gacaagaaga 540

aaatcttcgt caacatggtg gagcacgaca ctctcgtcta ctccaagaat atcaaagata 600

cagtctcaga agaccaaagg gctattgaga cttttcaaca aagggtaata tcgggaaacc 660

tcctcggatt ccattgccca gctatctgtc acttcatcaa aaggacagta gaaaaggaag 720

gtggcaccta caaatgccat cattgcgata aaggaaaggc tatcgttcaa gatgcctctg 780

ccgacagtgg tcccaaagat ggacccccac ccacgaggag catcgtggaa aaagaagacg 840

ttccaaccac gtcttcaaag caagtggatt gatgtgatat ctccactgac gtaagggatg 900

acgcacaatc ccactatcct tcgcaagacc cttcctctat ataaggaagt tcatttcatt 960

tggagaggac tccggtattt ttacaacaat accacaacaa aacaaacaac aaacaacatt 1020

acaatttact attctagtcg acctgcaggc ggccgcacta gtgatatcac aagtttgtac 1080

aaaaaagcag gctatggagg tggagcccgt ggagccacag tcgctaaaga agctaagctt 1140

caagtctctg aagcgcgctc tcgatctctt ctctcccatt cacggacacc tcgctcctcc 1200

cgatgccgaa agcaagaaaa tccgcactag ccacaaggtg agcgtggagt atggcggaat 1260

caaaagcact gctaatcaac ctcctcatca agttagttct gccacacagg atccagggcc 1320

ctctaacact cttgctcttc caggtccagg agattccaag gattctcaga aaggaggacc 1380

ccaaaatgcc ttggttgttg gtccaactat gccatccaca acaccgaatg atactggctt 1440

tcagagcaaa agtacagcgg ttgtttcagc ctctggttca tctgaaagaa atttatcaac 1500

atctgctttg atggaaagaa tgccaagtaa atggccacgt cctgtatggc atgcaccatg 1560

gaagaactac agggtcatca gcggccactt aggatgggtg agatctgttg cagttgatcc 1620

cagtaacaca tggttttgta ctggttctgc agatcgaact atcaagatat gggacttggc 1680

aagtggagta ttgaagctca cattaacagg ccacattgaa caagttagag gtcttgctgt 1740

tagcaacaga catacttaca tgttctctgc tggtgatgat aaacaagtta aatgttggga 1800

ccttgaacag aataaggtta ttagatctta tcatggtcat ctgagtggtg tttattgctt 1860

ggctcttcat cccacaattg acgttttact aaccggagga cgtgattctg tctgccgggt 1920

ttgggatata cgaagtaaaa tgcagattca tgctctttca ggacatgata acactgtctg 1980

ctctgtgttt acgcggccga cggatcccca agttgttacg ggttctcatg acactaccat 2040

caagatgtgg gaccttagat atggtaaaac aatgtcaact cttacaaacc ataaaaaatc 2100

tgttcgagca atggcccagc atcccaaaga gcaagctttt gcatctgctt cagctgacaa 2160

tattaaaaag ttcaaccttc caaaaggaga atttttgcac aacatgctct ctcaacagaa 2220

aactatcatc aatgcaatgg ctgtcaatga ggagggtgtg atggttactg gaggtgacaa 2280

tggcagcatg tggttctggg attggaagag tggtcataat ttccagcaat cccaaacaat 2340

tgtacagcct ggttccctgg atagtgaagc tggtatttat gcttgtacct atgatcttac 2400

tggctcgagg cttataacct gcgaggctga caagacgata aaaatgtgga aagaagacga 2460

gagtgccact ccagaaaccc atccccttaa cttcaggcct cctaaagaca tccgtcgatt 2520

ctagacccag ctttcttgta caaagtggtg atatcccgcg gccatgctag agtccgcaaa 2580

aatcaccagt ctctctctac aaatctatct ctctctattt ttctccagaa taatgtgtga 2640

gtagttccca gataagggaa ttagggttct tatagggttt cgctcatgtg ttgagcatat 2700

aagaaaccct tagtatgtat ttgtatttgt aaaatacttc tatcaataaa atttctaatt 2760

cctaaaacca aaatccagtg acctgcaggc atgcgacgtc gggcccaagc ttagcttgag 2820

cttggatcag attgtcgttt cccgccttca gtttaaacta tcagtgtttg acaggatata 2880

ttggcgggta aacctaagag aaaagagcgt ttattagaat aacggatatt taaaagggcg 2940

tgaaaaggtt tatccgttcg tccatttgta tgtgcatgcc aaccacaggg ttcccctcgg 3000

gatcaaagta ctttgatcca acccctccgc tgctatagtg cagtcggctt ctgacgttca 3060

gtgcagccgt cttctgaaaa cgacatgtcg cacaagtcct aagttacgcg acaggctgcc 3120

gccctgccct tttcctggcg ttttcttgtc gcgtgtttta gtcgcataaa gtagaatact 3180

tgcgactaga accggagaca ttacgccatg aacaagagcg ccgccgctgg cctgctgggc 3240

tatgcccgcg tcagcaccga cgaccaggac ttgaccaacc aacgggccga actgcacgcg 3300

gccggctgca ccaagctgtt ttccgagaag atcaccggca ccaggcgcga ccgcccggag 3360

ctggccagga tgcttgacca cctacgccct ggcgacgttg tgacagtgac caggctagac 3420

cgcctggccc gcagcacccg cgacctactg gacattgccg agcgcatcca ggaggccggc 3480

gcgggcctgc gtagcctggc agagccgtgg gccgacacca ccacgccggc cggccgcatg 3540

gtgttgaccg tgttcgccgg cattgccgag ttcgagcgtt ccctaatcat cgaccgcacc 3600

cggagcgggc gcgaggccgc caaggcccga ggcgtgaagt ttggcccccg ccctaccctc 3660

accccggcac agatcgcgca cgcccgcgag ctgatcgacc aggaaggccg caccgtgaaa 3720

gaggcggctg cactgcttgg cgtgcatcgc tcgaccctgt accgcgcact tgagcgcagc 3780

gaggaagtga cgcccaccga ggccaggcgg cgcggtgcct tccgtgagga cgcattgacc 3840

gaggccgacg ccctggcggc cgccgagaat gaacgccaag aggaacaagc atgaaaccgc 3900

accaggacgg ccaggacgaa ccgtttttca ttaccgaaga gatcgaggcg gagatgatcg 3960

cggccgggta cgtgttcgag ccgcccgcgc acgtctcaac cgtgcggctg catgaaatcc 4020

tggccggttt gtctgatgcc aagctggcgg cctggccggc cagcttggcc gctgaagaaa 4080

ccgagcgccg ccgtctaaaa aggtgatgtg tatttgagta aaacagcttg cgtcatgcgg 4140

tcgctgcgta tatgatgcga tgagtaaata aacaaatacg caaggggaac gcatgaaggt 4200

tatcgctgta cttaaccaga aaggcgggtc aggcaagacg accatcgcaa cccatctagc 4260

ccgcgccctg caactcgccg gggccgatgt tctgttagtc gattccgatc cccagggcag 4320

tgcccgcgat tgggcggccg tgcgggaaga tcaaccgcta accgttgtcg gcatcgaccg 4380

cccgacgatt gaccgcgacg tgaaggccat cggccggcgc gacttcgtag tgatcgacgg 4440

agcgccccag gcggcggact tggctgtgtc cgcgatcaag gcagccgact tcgtgctgat 4500

tccggtgcag ccaagccctt acgacatatg ggccaccgcc gacctggtgg agctggttaa 4560

gcagcgcatt gaggtcacgg atggaaggct acaagcggcc tttgtcgtgt cgcgggcgat 4620

caaaggcacg cgcatcggcg gtgaggttgc cgaggcgctg gccgggtacg agctgcccat 4680

tcttgagtcc cgtatcacgc agcgcgtgag ctacccaggc actgccgccg ccggcacaac 4740

cgttcttgaa tcagaacccg agggcgacgc tgcccgcgag gtccaggcgc tggccgctga 4800

aattaaatca aaactcattt gagttaatga ggtaaagaga aaatgagcaa aagcacaaac 4860

acgctaagtg ccggccgtcc gagcgcacgc agcagcaagg ctgcaacgtt ggccagcctg 4920

gcagacacgc cagccatgaa gcgggtcaac tttcagttgc cggcggagga tcacaccaag 4980

ctgaagatgt acgcggtacg ccaaggcaag accattaccg agctgctatc tgaatacatc 5040

gcgcagctac cagagtaaat gagcaaatga ataaatgagt agatgaattt tagcggctaa 5100

aggaggcggc atggaaaatc aagaacaacc aggcaccgac gccgtggaat gccccatgtg 5160

tggaggaacg ggcggttggc caggcgtaag cggctgggtt gtctgccggc cctgcaatgg 5220

cactggaacc cccaagcccg aggaatcggc gtgacggtcg caaaccatcc ggcccggtac 5280

aaatcggcgc ggcgctgggt gatgacctgg tggagaagtt gaaggccgcg caggccgccc 5340

agcggcaacg catcgaggca gaagcacgcc ccggtgaatc gtggcaagcg gccgctgatc 5400

gaatccgcaa agaatcccgg caaccgccgg cagccggtgc gccgtcgatt aggaagccgc 5460

ccaagggcga cgagcaacca gattttttcg ttccgatgct ctatgacgtg ggcacccgcg 5520

atagtcgcag catcatggac gtggccgttt tccgtctgtc gaagcgtgac cgacgagctg 5580

gcgaggtgat ccgctacgag cttccagacg ggcacgtaga ggtttccgca gggccggccg 5640

gcatggccag tgtgtgggat tacgacctgg tactgatggc ggtttcccat ctaaccgaat 5700

ccatgaaccg ataccgggaa gggaagggag acaagcccgg ccgcgtgttc cgtccacacg 5760

ttgcggacgt actcaagttc tgccggcgag ccgatggcgg aaagcagaaa gacgacctgg 5820

tagaaacctg cattcggtta aacaccacgc acgttgccat gcagcgtacg aagaaggcca 5880

agaacggccg cctggtgacg gtatccgagg gtgaagcctt gattagccgc tacaagatcg 5940

taaagagcga aaccgggcgg ccggagtaca tcgagatcga gctagctgat tggatgtacc 6000

gcgagatcac agaaggcaag aacccggacg tgctgacggt tcaccccgat tactttttga 6060

tcgatcccgg catcggccgt tttctctacc gcctggcacg ccgcgccgca ggcaaggcag 6120

aagccagatg gttgttcaag acgatctacg aacgcagtgg cagcgccgga gagttcaaga 6180

agttctgttt caccgtgcgc aagctgatcg ggtcaaatga cctgccggag tacgatttga 6240

aggaggaggc ggggcaggct ggcccgatcc tagtcatgcg ctaccgcaac ctgatcgagg 6300

gcgaagcatc cgccggttcc taatgtacgg agcagatgct agggcaaatt gccctagcag 6360

gggaaaaagg tcgaaaaggt ctctttcctg tggatagcac gtacattggg aacccaaagc 6420

cgtacattgg gaaccggaac ccgtacattg ggaacccaaa gccgtacatt gggaaccggt 6480

cacacatgta agtgactgat ataaaagaga aaaaaggcga tttttccgcc taaaactctt 6540

taaaacttat taaaactctt aaaacccgcc tggcctgtgc ataactgtct ggccagcgca 6600

cagccgaaga gctgcaaaaa gcgcctaccc ttcggtcgct gcgctcccta cgccccgccg 6660

cttcgcgtcg gcctatcgcg gccgctggcc gctcaaaaat ggctggccta cggccaggca 6720

atctaccagg gcgcggacaa gccgcgccgt cgccactcga ccgccggcgc ccacatcaag 6780

gcaccctgcc tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg 6840

gagacggtca cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg 6900

tcagcgggtg ttggcgggtg tcggggcgca gccatgaccc agtcacgtag cgatagcgga 6960

gtgtatactg gcttaactat gcggcatcag agcagattgt actgagagtg caccatatgc 7020

ggtgtgaaat accgcacaga tgcgtaagga gaaaataccg catcaggcgc tcttccgctt 7080

cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact 7140

caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag 7200

caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata 7260

ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc 7320

cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg 7380

ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc 7440

tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg 7500

gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc 7560

ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga 7620

ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg 7680

gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa 7740

aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg 7800

tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt 7860

ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgcatg 7920

atatatctcc caatttgtgt agggcttatt atgcacgctt aaaaataata aaagcagact 7980

tgacctgata gtttggctgt gagcaattat gtgcttagtg catctaatcg cttgagttaa 8040

cgccggcgaa gcggcgtcgg cttgaacgaa tttctagcta gacattattt gccgactacc 8100

ttggtgatct cgcctttcac gtagtggaca aattcttcca actgatctgc gcgcgaggcc 8160

aagcgatctt cttcttgtcc aagataagcc tgtctagctt caagtatgac gggctgatac 8220

tgggccggca ggcgctccat tgcccagtcg gcagcgacat ccttcggcgc gattttgccg 8280

gttactgcgc tgtaccaaat gcgggacaac gtaagcacta catttcgctc atcgccagcc 8340

cagtcgggcg gcgagttcca tagcgttaag gtttcattta gcgcctcaaa tagatcctgt 8400

tcaggaaccg gatcaaagag ttcctccgcc gctggaccta ccaaggcaac gctatgttct 8460

cttgcttttg tcagcaagat agccagatca atgtcgatcg tggctggctc gaagatacct 8520

gcaagaatgt cattgcgctg ccattctcca aattgcagtt cgcgcttagc tggataacgc 8580

cacggaatga tgtcgtcgtg cacaacaatg gtgacttcta cagcgcggag aatctcgctc 8640

tctccagggg aagccgaagt ttccaaaagg tcgttgatca aagctcgccg cgttgtttca 8700

tcaagcctta cggtcaccgt aaccagcaaa tcaatatcac tgtgtggctt caggccgcca 8760

tccactgcgg agccgtacaa atgtacggcc agcaacgtcg gttcgagatg gcgctcgatg 8820

acgccaacta cctctgatag ttgagtcgat acttcggcga tcaccgcttc ccccatgatg 8880

tttaactttg ttttagggcg actgccctgc tgcgtaacat cgttgctgct ccataacatc 8940

aaacatcgac ccacggcgta acgcgcttgc tgcttggatg cccgaggcat agactgtacc 9000

ccaaaaaaac atgtcataac aagaagccat gaaaaccgcc actgcgccgt taccaccgct 9060

gcgttcggtc aaggttctgg accagttgcg tgacggcagt tacgctactt gcattacagc 9120

ttacgaaccg aacgaggctt atgtccactg ggttcgtgcc cgaattgatc acaggcagca 9180

acgctctgtc atcgttacaa tcaacatgct accctccgcg agatcatccg tgtttcaaac 9240

ccggcagctt agttgccgtt cttccgaata gcatcggtaa catgagcaaa gtctgccgcc 9300

ttacaacggc tctcccgctg acgccgtccc ggactgatgg gctgcctgta tcgagtggtg 9360

attttgtgcc gagctgccgg tcggggagct gttggctggc tggtggcagg atatattgtg 9420

gtgtaaacaa attgacgctt agacaactta ataacacatt gcggacgttt ttaatgtact 9480

gaattaacgc cgaattgaat tatcagcttg catgccggtc gatctagtaa catatagatg 9540

acaccgcgcg cgataattta tcctagtttg cgcgctatat tttgttttct atcgcgtatt 9600

aaatgtataa ttgcgggact ctaatcataa aaacccatct cataaataac gtcatgcatt 9660

acatgttaat tattacatgc ttaacgtaat tcaacagaaa ttatatgata atcatcgcaa 9720

gaccggcaac aggattcaat cttaagaaac tttattgcca aatgtttgaa cgatctgctt 9780

gactctaggg gtcatcagat ttcggtgacg ggcaggaccg gacggggcgg caccggcagg 9840

ctgaagtcca gctgccagaa acccacgtca tgccagttcc cgtgcttgaa gccggccgcc 9900

cgcagcatgc cgcggggggc atatccgagc gcctcgtgca tgcgcacgct cgggtcgttg 9960

ggcagcccga tgacagcgac cacgctcttg aagccctgtg cctccaggga cttcagcagg 10020

tgggtgtaga gcgtggagcc cagtcccgtc cgctggtggc ggggggagac gtacacggtc 10080

gactcggccg tccagtcgta ggcgttgcgt gccttccagg gacccgcgta ggcgatgccg 10140

gcgacctcgc cgtccacctc ggcgacgagc cagggatagc gctcccgcag acggacgagg 10200

tcgtccgtcc actcctgcgg ttcctgcggc tcggtacgga agttgaccgt gcttgtctcg 10260

atgtagtggt tgacgatggt gcagaccgcc ggcatgtccg cctcggtggc acggcggatg 10320

tcggccgggc gtcgttctgg gctcatggta gatcccctcg atcgagttga gagtgaatat 10380

gagactctaa ttggataccg aggggaattt atggaacgtc agtggagcat ttttgacaag 10440

aaatatttgc tagctgatag tgaccttagg cgacttttga acgcgcaata atggtttctg 10500

acgtatgtgc ttagctcatt aaactccaga aacccgcggc tcagtggctc cttcaacgtt 10560

gcggttctgt cagttccaaa cgtaaaacgg cttgtcccgc gtcatcggcg ggggtcataa 10620

cgtgactccc ttaattctca tgtatgataa ttcgagct 10658

Claims (1)

1.大豆威廉姆斯82中WD40结构域蛋白基因GmPRL1b在提高大豆或拟南芥耐盐或抗灰霉病中的应用；其中所述大豆威廉姆斯82中WD40结构域蛋白基因GmPRL1b cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述提高大豆或拟南芥耐盐或抗灰霉病应用的方法是：将GmPRL1b基因通过BP反应连接到pDONR221载体上，然后通过转化的方法在大肠杆菌DH5α中得到克隆，接着进行LR反应把此基因GmPRL1b连接到表达载体pB2GW7上制得植物表达载体pB2GW7::GmPRL1b，并在大肠杆菌DH5α中表达，接着筛选转基因大肠杆菌，并提取转化质粒，最后将转化质粒转入农杆菌菌株EHA105中，将转化农杆菌菌株转入大豆或拟南芥，通过表达基因GmPRL1b实现提高大豆或拟南芥耐盐或抗灰霉病的功能。

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