CN104540939A - 具有内切葡聚糖酶活性的多肽 - Google Patents

具有内切葡聚糖酶活性的多肽 Download PDF

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Abstract

本发明涉及具有内切葡聚糖酶活性的家族5的糖苷水解酶变体，编码所述家族5的糖苷水解酶变体的多核苷酸，包含所述多核苷酸的载体、宿主细胞，以及使用所述家族5的糖苷水解酶变体的方法。

Description

具有内切葡聚糖酶活性的多肽
发明领域
本发明涉及具有内切葡聚糖酶活性的家族5的糖苷水解酶变体，编码所述家族5的糖苷水解酶变体的多核苷酸，包含所述多核苷酸的载体、宿主细胞，以及使用所述家族5的糖苷水解酶变体的方法。
发明背景
纤维素是植物初生细胞壁的结构组分，并且可能是地球上存在的最丰富的有机化合物之一。纤维素是由几个β(1→4)连接的葡萄糖单元的直链构成的多糖聚合物。为了利用单个葡萄糖单元，必须将多糖水解。这可以使用纤维素酶这类催化纤维素水解的酶类来实现。
许多微生物产生水解β-连接的葡聚糖的酶。这些酶包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶。内切葡聚糖酶在随机位置处消化纤维素聚合物，将其打开以被纤维二糖水解酶攻击。
纤维二糖水解酶从纤维素聚合物的末端顺序释放纤维二糖分子。纤维二糖水解酶I是一种1,4-D-葡聚糖纤维二糖水解酶活性，其催化纤维素、纤维三糖或任何含有β-1,4连接的葡萄糖的聚合物中的1,4-β-D-葡萄糖苷键的水解，从链的还原末端释放纤维二糖。纤维二糖水解酶II是一种1,4-D-葡聚糖纤维二糖水解酶活性，其催化纤维素、纤维三糖或任何含有β-1,4连接的葡萄糖的聚合物中的1,4-β-D-葡萄糖苷键的水解，从链的非还原末端释放纤维二糖。纤维二糖是葡萄糖的水溶性的β-1,4连接的二聚体。
β-葡萄糖苷酶将纤维二糖水解成葡萄糖，葡萄糖随后可以与其他物质一样发酵成乙醇。
鉴定具有改进的性质，例如提高的水解速率、更好的热稳定性、向木质素的吸附降低和除了水解纤维素之外还水解生物质的非纤维素组分例如半纤维素的能力的新的内切葡聚糖酶，在本领域中将是有利的。对半纤维素具有广范围的副活性的内切葡聚糖酶，对于提高复杂的、富含半纤维素的生物质底物的总水解得率，可能是特别有益的。
本发明的目的是提供具有内切葡聚糖酶活性的改进的多肽以及编码所述多肽的多核苷酸。
发明概述
本发明提供了多核苷酸和由其编码的多肽，所述多肽已被鉴定为具有羧甲基纤维素酶活性(CMC)的内切葡聚糖酶。
根据本发明的一个方面，提供了新的酶及其活性类似物和片段。
根据本发明的另一方面，提供了分离的本发明的多肽以及这样的酶的活性片段。
根据本发明的又一方面，提供了通过重组技术生产这样的多肽的方法，所述方法包括将含有编码本发明的酶的核酸序列的重组原核和/或真核宿主细胞，在促进所述酶的表达和随后所述酶的回收的条件下进行培养。
根据本发明的又一方面，提供了利用这样的酶或编码这样的酶的多核苷酸来水解纤维素的方法。根据本发明的又一方面，提供了将这样的酶用于燃料生产的方法。
从本文中的教示内容，本发明的这些以及其他方面对于本领域技术人员来说将是显而易见的。
附图简述
从如附图中所示的本发明的下列描述，本发明的其他目的和特点将变得更加明显，在所述附图中：
图1示出了如何在本发明提供的变体上进行初级筛选的示意图；以及
图2示出了本发明的内切葡聚糖酶变体的糖化性能。
发明详述
在一种实施方式中，本发明提供了一种家族5的糖苷水解酶变体，所述变体由野生型亲代多核苷酸的突变形式编码，所述突变形式与SEQ ID NO：1的(cDNA)核苷酸序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高或完全的序列同一性，并包含至少一种下列核苷酸残基变化：
157至159位处的核苷酸是TCT；(SEQ ID NO：3)
175至177位处的核苷酸是AAG；(SEQ ID NO：5)
175至177位处的核苷酸是CAT；(SEQ ID NO：7)
181至183位处的核苷酸是CCT；(SEQ ID NO：9)
190至192位处的核苷酸是AAT；(SEQ ID NO：11)
208至210位处的核苷酸是ATG；(SEQ ID NO：13)
259至261位处的核苷酸是CAT；(SEQ ID NO：15)
259至261位处的核苷酸是ATG；(SEQ ID NO：17)
274至276位处的核苷酸是GCT；(SEQ ID NO：19)
547至549位处的核苷酸是TTG；(SEQ ID NO：21)
550至552位处的核苷酸是GAG；(SEQ ID NO：23)
574至576位处的核苷酸是AAT；(SEQ ID NO：25)
589至591位处的核苷酸是GCT；(SEQ ID NO：27)
595至597位处的核苷酸是ATG；(SEQ ID NO：29)
598至600位处的核苷酸是GTT；(SEQ ID NO：31)和
898至900位处的核苷酸是GCG；(SEQ ID NO：33)
其中所述变体具有至少一种下列活性：内切葡聚糖酶活性，β-甘露聚糖酶活性，外切-1,3-葡聚糖酶活性，内切-1,6-葡聚糖酶活性，木聚糖酶活性和神经节苷脂内切糖苷酶活性；并且其中所述变体的活性高于由具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列的野生型亲代多核苷酸编码的多肽。
在一种实施方式中，本发明提供了一种家族5的糖苷水解酶变体，其中所述家族5的糖苷水解酶变体具有内切葡聚糖酶活性。
在一种实施方式中，本发明提供了一种表达盒、载体或克隆载体，其包含上文中提出的野生型亲代多核苷酸序列SEQ ID NO：1的突变形式，其中任选地所述克隆载体包含病毒载体、质粒、噬菌体、噬粒、粘粒、福斯质粒、细菌噬菌体或人工染色体，并且任选地所述病毒载体包含腺病毒载体、反转录病毒载体或腺相关病毒载体，并且任选地所述克隆载体包含细菌人工染色体(BAC)、质粒、细菌噬菌体P1衍生载体(PAC)、酵母人工染色体(YAC)或哺乳动物人工染色体(MAC)。
在一种实施方式中，本发明提供了一种转化的细胞，其包含含有上文中提出的野生型亲代多核苷酸序列SEQ ID NO：1的突变形式的核酸或所述表达盒、载体或克隆载体，其中任选地所述细胞是细菌细胞、哺乳动物细胞、真菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或植物细胞。
在一种实施方式中，本发明提供了一种转化的细胞，其包含上文中提出的表达载体。
在一种实施方式中，本发明提供了一种转化的细胞，其中所述细胞是细菌细胞、哺乳动物细胞、真菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或植物细胞。
在一种实施方式中，所述细菌细胞选自运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)、大肠埃希式杆菌(Escherichia coli)和产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)。
在一种实施方式中，所述酵母细胞选自酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、假热带假丝酵母(Candida pseudotropicalis)和嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tannophilus)。
在一种实施方式中，所述真菌细胞选自曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、根霉属(Rhizopus)、金孢霉属(Chrysosporium)、毁丝霉属(Myceliophthora)、木霉属(Trichoderma)、腐质霉属(Humicola)、支顶孢属(Acremonium)或镰孢菌属(Fusarium)。
在一种实施方式中，所述真菌细胞是黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)、嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)或米根霉(Rhizopus oryzae)。
在一种实施方式中，所述酵母细胞选自酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、克勒克酵母属(Klockera)、许旺酵母属(Schwanniomyces)或亚罗酵母属(Yarrowia)。
在一种实施方式中，所述酵母细胞是酿酒酵母(S.cerevisiae)、博伊丁酵母(S.bulderi)、S.barnetti、啤酒酵母(S.exiguus)、葡萄汁酵母(S.uvarum)、S.diastaticus、乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)或脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)。
在一种实施方式中，本发明提供了一种成熟的家族5的糖苷水解酶变体，所述变体具有野生型亲代多肽的突变形式，所述突变形式与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高或完全的序列同一性，并包含至少一种下列氨基酸残基变化：
53位处的脯氨酸被丝氨酸置换；(SEQ ID NO：4)
59位处的脯氨酸被赖氨酸置换；(SEQ ID NO：6)
59位处的脯氨酸被组氨酸置换；(SEQ ID NO：8)
61位处的苏氨酸被脯氨酸置换；(SEQ ID NO：10)
64位处的赖氨酸被天冬酰胺置换；(SEQ ID NO：12)
70位处的甘氨酸被甲硫氨酸置换；(SEQ ID NO：14)
87位处的苏氨酸被组氨酸置换；(SEQ ID NO：16)
87位处的苏氨酸被甲硫氨酸置换；(SEQ ID NO：18)
92位处的甘氨酸被丙氨酸置换；(SEQ ID NO：20)
183位处的丝氨酸被亮氨酸置换；(SEQ ID NO：22)
184位处的苏氨酸被谷氨酸置换；(SEQ ID NO：24)
192位处的赖氨酸被天冬酰胺置换；(SEQ ID NO：26)
197位处的谷氨酰胺被丙氨酸置换；(SEQ ID NO：28)
199位处的赖氨酸被甲硫氨酸置换；(SEQ ID NO：30)
200位处的丝氨酸被缬氨酸置换；(SEQ ID NO：32)和
300位处的赖氨酸被丙氨酸置换；(SEQ ID NO：34)
其中所述变体具有至少一种下列活性：内切葡聚糖酶活性，β-甘露聚糖酶活性，外切-1,3-葡聚糖酶活性，内切-1,6-葡聚糖酶活性，木聚糖酶活性和神经节苷脂内切糖苷酶活性；并且其中所述变体的活性高于具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的野生型亲代多肽。
在一种实施方式中，本发明提供了一种上文中提出的变体，其中所述变体具有内切葡聚糖酶活性。
在一种实施方式中，本发明提供了一种制造燃料的方法，所述方法包括将生物质与上文中提出的多肽相接触的步骤。
在一种实施方式中，所述生物质是至少一种下列物质：象草，能源甘蔗，甘蔗，甘蔗渣，高粱，甜菜或甜菜，小麦，玉米，大豆，马铃薯，水稻或大麦，柳枝稷或芒属植物(Miscanthus)，或它们的任何组合。
在一种实施方式中，所述燃料是下列至少一种：乙醇，甲醇，丙醇，丁醇，或它们的任何组合。
在一种实施方式中，本发明提供了一种水解纤维素的方法，所述方法包括将生物质与上文中提出的多肽相接触。
在一种实施方式中，本发明提供了一种方法，其中所述生物质在与上文中提出的多肽相接触之前经历预处理过程。
在一种实施方式中，本发明提供了一种方法，其中所述预处理过程包括将所述生物质加热到至少50℃的步骤。
在一种实施方式中，本发明提供了一种方法，其中所述预处理过程包括将所述生物质与水性溶液相接触的步骤。
在一种实施方式中，本发明提供了一种方法，其中所述水性溶液具有低于7的pH。
在一种实施方式中，本发明提供了一种方法，其中所述水性溶液具有高于7的pH。
在一种实施方式中，本发明提供了一种分离的成熟的、家族5的糖苷水解酶变体多肽，其与SEQ ID NO：2具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高或完全的序列同一性，并包含至少一种下列氨基酸残基变化：
53位处的脯氨酸被丝氨酸置换；(SEQ ID NO：4)
59位处的脯氨酸被赖氨酸置换；(SEQ ID NO：6)
59位处的脯氨酸被组氨酸置换；(SEQ ID NO：8)
61位处的苏氨酸被脯氨酸置换；(SEQ ID NO：10)
64位处的赖氨酸被天冬酰胺置换；(SEQ ID NO：12)
70位处的甘氨酸被甲硫氨酸置换；(SEQ ID NO：14)
87位处的苏氨酸被组氨酸置换；(SEQ ID NO：16)
87位处的苏氨酸被甲硫氨酸置换；(SEQ ID NO：18)
92位处的甘氨酸被丙氨酸置换；(SEQ ID NO：20)
183位处的丝氨酸被亮氨酸置换；(SEQ ID NO：22)
184位处的苏氨酸被谷氨酸置换；(SEQ ID NO：24)
192位处的赖氨酸被天冬酰胺置换；(SEQ ID NO：26)
197位处的谷氨酰胺被丙氨酸置换；(SEQ ID NO：28)
199位处的赖氨酸被甲硫氨酸置换；(SEQ ID NO：30)
200位处的丝氨酸被缬氨酸置换；(SEQ ID NO：32)和
300位处的赖氨酸被丙氨酸置换；(SEQ ID NO：34)
其中所述分离的、家族5的糖苷水解酶变体具有至少一种下列活性：内切葡聚糖酶活性，β-甘露聚糖酶活性，外切-1,3-葡聚糖酶活性，内切-1,6-葡聚糖酶活性，木聚糖酶活性和神经节苷脂内切糖苷酶活性；并且其中所述家族5的糖苷水解酶变体的活性高于由SEQ ID NO：1的多核苷酸序列编码的其亲代家族5的糖苷水解酶。
定义
特定酶的DNA“编码序列”或“编码特定酶的核苷酸序列”，是当置于适合的调控序列控制下时被转录并翻译成酶的DNA序列。
术语“编码序列”是指直接规定其蛋白质产物的氨基酸序列的核苷酸序列。编码序列的边界一般由开放阅读框决定，开放阅读框通常始于ATG起始密码子或可选替的起始密码子例如GTG和TTG，并止于终止密码子例如TAA、TAG和TGA。编码序列可能是DNA、cDNA或重组核苷酸序列。
术语“cDNA”在本文中被定义为可以从获自真核细胞的成熟的、剪接过的mRNA分子通过反转录制备的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相应的基因组DNA中的内含子序列。初始的原始RNA转录本是mRNA的前体，其通过一系列步骤加工后才表现为成熟的、剪接过的mRNA。这些步骤包括通过被称为剪接的过程而除去内含子序列。因此，源自于mRNA的cDNA缺少任何内含子序列。
术语“控制序列”在本文中被定义为包括对于编码本发明多肽的多核苷酸的表达来说必需或有利的所有组分。每个控制序列对于编码所述多肽的核苷酸序列来说可以是本源或外来的，或者对于彼此来说是本源或外来的。这样的控制序列包括但不限于前导序列、多腺苷化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。至少，控制序列包括启动子以及转录和翻译终止信号。控制序列可以提供有连接序列，用于导入特定限制性位点以便于控制序列与编码多肽的核苷酸序列的编码区的连接的目的。
术语“内切葡聚糖酶活性”在本文中被定义为内切-1,4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(E.C.No.3.2.1.4)，其催化纤维素、纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、木质纤维素、木质纤维素衍生物、地衣多糖中的1,4-β-D-糖苷键，以及混合的β-1,3葡聚糖例如谷类β-D-葡聚糖或木葡聚糖和含有纤维素组分的其他植物材料中的β-1,4键的内切型水解。出于本发明的目的，内切葡聚糖酶活性使用羧甲基纤维素(CMC)水解，按照Ghose,1987,Pure and Appl.Chem.59:257-268的程序来测定。
术语“表达”包括多肽生产中涉及的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
术语“表达载体”在本文中被定义为包含编码本发明多肽的多核苷酸，并且可操作连接到为其表达所提供的其他核苷酸的线性或环状DNA分子。
术语“表达”是指根据基因的核酸序列来生产多肽的过程。所述过程包括转录和翻译两者。
“家族5的糖苷水解酶”或“GH5家族”包含具有几种已知活性的酶：内切葡聚糖酶(EC:3.2.1.4)；β-甘露聚糖酶(EC:3.2.1.78)；外切-1,3-葡聚糖酶(EC:3.2.1.58)；内切-1,6-葡聚糖酶(EC:3.2.1.75)；木聚糖酶(EC:3.2.1.8)；神经节苷脂内切糖苷酶(EC:3.2.1.123)。
术语“基因”是指参与多肽链生产的DNA区段；它包括编码区之前和之后的区域(前导序列和后随序列)以及在各个编码区段(外显子)之间的居间序列(内含子)。
当在本文中使用时，术语“宿主细胞”包括易于使用包含本发明的多核苷酸的核酸构建物或表达载体转化、转染、转导等的任何细胞类型。
在将核酸序列插入到细胞中的情形中，术语“导入”意味着“转染”或“转化”或“转导”，并包括对核酸序列在真核或原核细胞中的并入的指称，其中所述核酸序列可以被并入到细胞的基因组(例如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)中，转变成自主复制子，或瞬时表达(例如转染的mRNA)。
当在本文中使用时，术语“分离的多肽”是指不含来自于它所源自的生物体的其他组分的多肽。术语“分离的多肽”还涵盖不含来自于它所获自的本源生物体的组分的多肽。多肽可能被纯化，仅存在有少量其他蛋白。当在本文中使用时，术语“纯化”也指本发明的酶的起源细胞中存在的其他组分、尤其是其他蛋白质、特别是其他酶的去除。在一种实施方式中，术语“分离的多肽”是指至少75％(w/w)、优选地至少80％、更优选地至少85％、更优选地至少90％、更优选地至少95％、更优选地至少96％、更优选地至少97％、甚至更优选地至少98％或最优选地至少99％纯的多肽。在另一种优选实施方式中，所述酶是100％纯的。
术语“成熟多肽”在本文中被定义为处于其在翻译和任何翻译后修饰例如N-端加工、C-端截短、糖基化、无内含子和前导序列切断等之后的最终形式的多肽。
当在本文中使用时，术语“核酸构建物”是指单链或双链核酸分子，其与天然存在的基因分离开或被修饰以含有原本在自然界中不存在的核酸区段。当核酸构建物含有本发明的编码序列的表达所需的控制序列时，术语核酸构建物与术语“表达盒”同义。
术语“转化的”、“稳定转化的”或“转基因的”在指称细胞时，意味着所述细胞具有整合在其基因组中或作为游离体质粒的能够经过多代得以维持的非本源(异源)核酸序列。
在开发有效的最低酶混合物的尝试中，对真菌的糖基水解酶家族5(GH5)的内切-1,4-β-D-葡聚糖酶进行突变以获得提高的活性和热稳定性。使用基因定点突变(GSSM)技术对真菌的GH5内切葡聚糖酶进行进化，以在商业上相关的木质纤维素底物上获得提高的活性和热耐受性。
具有内切葡聚糖酶活性的多肽的来源
本发明的多肽可以从任何属的微生物获得。出于本发明的目的，当在本文中与给定来源联合使用时，术语“获自”意味着由核苷酸序列编码的多肽由所述来源或者由其中已插入来自于所述来源的核苷酸序列的菌株产生。在优选情况下，从给定来源获得的多肽被细胞外分泌。
此外，这样的多肽可以使用探针从其他来源、包括从自然界(例如土壤、堆肥、水等)分离的微生物中鉴定和获得。用于从自然栖息地分离微生物的技术在本领域中是公知的。然后可以通过类似地筛选这样的微生物的基因组或cDNA文库，来获得多核苷酸。一旦使用探针检测到编码多肽的多核苷酸序列之后，可以利用本领域普通技术人员公知的技术(参见例如Sambrook等，1989，同上)来分离或克隆所述多核苷酸。
多核苷酸
本发明还涉及包含编码本发明的具有内切葡聚糖酶活性的多肽的核苷酸序列或由所述核苷酸序列构成的分离的多核苷酸。
纤维素酶变体
本发明提供了通过置换、插入和/或缺失从亲代纤维素酶衍生的新的纤维素酶变体。本发明的纤维素酶变体是具有自然界中不存在的氨基酸序列的纤维素酶变体或突变的纤维素酶。本发明的纤维素酶变体显示出改进的性能，尤其是在提高的催化活性和/或改变的热稳定性方面。
在形式上，本发明的纤维素酶变体或突变的纤维素酶可以被视为亲代纤维素酶(即天然的或野生型酶)的功能衍生物，并且可以通过编码亲代酶的亲代基因或其衍生物的DNA核苷酸序列的改变来获得。当将编码纤维素酶变体的DNA核苷酸序列插入到适合的宿主生物体中的适合的载体内时，可以表达并生产纤维素酶变体或突变的纤维素酶。宿主生物体不必与亲代基因所源自的生物体一致。
核酸的修饰
本发明提供了产生本发明的核酸的变体的方法，所述核酸是例如编码葡聚糖酶(或纤维素酶)如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶,黄原胶酶和/或糖苷酶如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡萄糖苷酶的核酸。这些方法可以以各种组合重复或使用，以产生与由模板核酸所编码的葡聚糖酶(或纤维素酶)如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡萄糖苷酶相比，具有改变或不同的活性或改变或不同的稳定性的葡聚糖酶(或纤维素酶)如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡萄糖苷酶。这些方法也可以以各种组合重复或使用，以例如在基因/遗传信息表达、遗传信息翻译或遗传信息稳定性中产生变化性。在另一种情况下，通过例如同源基因的离体修饰，然后将其重新插入到细胞中，来改变细胞的遗传组成。
在一种情况下，术语“变体”是指在一个或多个碱基对、密码子、内含子、外显子或氨基酸残基处被(分别地)修饰并仍保留本发明的葡聚糖酶的生物活性的本发明的多核苷酸或多肽。变体可以通过许多手段来生产，包括例如易错PCR、改组、寡核苷酸指导的突变、组装PCR、性PCR突变、体内突变、表达盒突变、递归集合突变、指数集合突变、定点突变、基因重新组装、基因位点饱和突变(GSSM)、合成连接重新组装(SLR)的方法及它们的任何组合。
本发明的核酸可以通过任何手段来改变。例如偶然或随机方法，或非随机或“定向进化”方法，参见例如美国专利号6,361,974。非随机或“定向进化”方法包括例如基因位点饱和突变(GSSM)、合成连接重新组装(SLR)或它们的组合，被用于修饰本发明的核酸以产生具有新的或改变的性质(例如在高酸性或碱性条件、高或低温下的活性等)的葡聚糖酶(或纤维素酶)如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡萄糖苷酶。由修饰的核酸编码的多肽，在试验葡聚糖或其他多糖水解或其他活性之前，可以进行活性筛选。可以使用任何试验模式或方案，例如使用毛细管阵列平台。参见例如美国专利号6,361,974、6,280,926、5,939,250。
饱和突变或GSSM
本发明还提供了使用基因位点饱和突变或GSSM来制造新酶或修饰本发明的序列的方法，所述技术如本文中所述，并且也描述在美国专利号6,171,820、6,765,835、6,358,709、6,562,594、6,696,275、6,764,835、6,238,884、6,773,900、6,740,506和6,713,282中。
在一种情况下，使用含有简并的N,N,G/T序列的密码子引物，将点突变导入到本发明的多核苷酸例如葡聚糖酶(或纤维素酶)如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡萄糖苷酶或抗体中，以便产生一套后代多肽，其中在每个待定向修饰的氨基酸位置例如酶活性位点(催化结构域(CD))或配体结合位点中的氨基酸残基处出现全范围的单氨基酸置换。这些寡核苷酸可以包含毗连的第一同源序列、简并的N,N,G/T序列和任选的第二同源序列。从这样的寡核苷酸的使用获得的下游子代翻译产物在沿着多肽的每个氨基酸位点处包括所有可能的氨基酸变化，这是因为N,N,G/T序列的简并性包括所有20种氨基酸的密码子。在一种情况下，将一个这样的简并寡核苷酸(包含例如一个简并的N,N,G/T表达盒)用于使亲代多核苷酸模板中的每个原始密码子经历全范围密码子置换。在另一种情况下，将至少两个简并的表达盒——在或不在同一寡核苷酸中——用于使亲代多核苷酸模板中的至少两个原始密码子经历全范围密码子置换。例如，可以在一个寡核苷酸中包含超过一个N,N,G/T序列，以在超过一个位点处导入氨基酸突变。该多个N,N,G/T序列可以直接毗连，或者被一个或多个其他核苷酸序列分离开。在另一种情况下，可用于导入添加和缺失的寡核苷酸可以单独地或与含有N,N,G/T序列的密码子组合使用，以导入氨基酸添加、缺失和/或置换的任何组合或排列。
在一种情况下，使用含有毗连的N,N,G/T三联体、即简并的(N,N,G/T)n序列的寡核苷酸，来进行两个或更多毗连的氨基酸位置的同时突变。在另一种情况下，使用简并性比N,N,G/T序列更低的简并的表达盒。例如，在某些情况下，可能希望使用(例如在寡核苷酸中)仅包含一个N的简并的三联体序列，其中所述N可以在三联体的第一、第二或第三位置中。在三联体的剩余两个位置中，可以使用任何其他碱基，包括其任何组合和排列。或者，在某些情况下可能希望使用(例如在寡核苷酸中)简并的N,N,N三联体序列。
在一种情况下，简并的三联体(例如N,N,G/T三联体)的使用允许在多肽的每个和所有氨基酸位置中系统且容易地产生全范围的可能的天然氨基酸(总共20种氨基酸)置换(在可选替情况下，方法还包括在每个氨基酸残基或密码子位置处产生少于所有可能的置换)。例如，对于100个氨基酸的多肽来说，可以产生2000个不同的种类(即每个位置20种可能的氨基酸X100个氨基酸位置)。通过使用含有简并的N,N,G/T三联体的寡核苷酸或成套寡核苷酸，32个单个序列可以编码所有20种可能的天然氨基酸。因此，在使用至少一个这样的寡核苷酸对亲代多核苷酸序列进行饱和突变的反应容器中，产生编码20种不同多肽的32种不同的子代多核苷酸。相反，在定点突变中使用非简并的寡核苷酸，使得每个反应容器仅产生一个子代多肽产物。非简并的寡核苷酸可以任选地与公开的简并引物组合使用；例如，非简并的寡核苷酸可用于在工作多核苷酸中产生定点突变。这提供了一种手段来产生沉默定点突变、引起相应氨基酸变化的点突变和引起终止密码子的产生和多肽片段的相应表达的点突变。
在一种情况下，每个饱和突变反应容器含有编码至少20种子代多肽(例如葡聚糖酶(或纤维素酶)如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡萄糖苷酶)分子的多核苷酸，使得在对应于亲代多核苷酸中被突变的密码子位置的一个特定氨基酸位置处出现所有20种天然氨基酸(其他情况使用少于所有20种天然氨基酸的组合)。可以对从每个饱和突变反应容器产生的32倍简并的子代多肽进行克隆扩增(例如使用例如表达载体克隆到适合的宿主例如大肠杆菌宿主中)并进行表达筛选。当通过筛选鉴定到表现出性质的有利变化(当与亲代多肽相比时，例如在碱性或酸性条件下提高的葡聚糖水解活性)的单个子代多肽时，可以将它测序以鉴定其中包含的对应的有利的氨基酸置换。
在一种情况下，在使用本文中所公开的饱和突变对亲代多肽中每个和所有的氨基酸位置进行突变之后，可能在超过一个氨基酸位置处鉴定到有利的氨基酸变化。可以产生含有所有或一部分这些有利的氨基酸置换的组合的一个或多个新的子代分子。例如，如果在多肽中的3个氨基酸位置的每个中鉴定到2个特定的有利的氨基酸变化，则排列包括每个位置处的3种可能性(与原始氨基酸相比无变化，以及两个有利的变化中的每一个)和3个位置。因此，存在总共3x 3x 3或27种可能性，包括以前检查过的7种——6个单一点突变(即三个位置的每个处各2个)和在任何位置处无变化。
在另一种情况下，位点饱和突变可以与改组、嵌合化、重组和其他突变方法以及筛选一起使用。本发明提供了以迭代方式使用任何突变方法，包括饱和突变。在一种示例情况中，任何突变方法的迭代使用与筛选组合使用。
本发明还提供了使用专有的密码子引物(含有简并的N,N,N序列)将点突变导入到多核苷酸中，以便产生一套子代多肽，其中在每个氨基酸位置处出现全范围的单一氨基酸置换(基因位点饱和突变(GSSM))。所使用的寡核苷酸毗连地包含第一同源序列、简并的N,N,N序列，并且在一种情况下但不是必需地包含第二同源序列。从使用这样的寡核苷酸产生的下游子代翻译产物在沿着多肽的每个氨基酸位点处包括所有可能的氨基酸变化，这是因为N,N,N序列的简并性包括所有20种氨基酸的密码子。
在一种情况下，将一个这样的简并的寡核苷酸(包含一个简并的N,N,N表达盒)用于使亲代多核苷酸模板中的每个原始密码子经历全范围的密码子置换。在另一种情况下，将至少两个简并的N,N,N表达盒——在或不在同一寡核苷酸中——用于使亲代多核苷酸模板中的至少两个原始密码子经历全范围的密码子置换。因此，在一个寡核苷酸中可以含有超过一个N,N,N序列，以在超过一个位点处导入氨基酸突变。该多个N,N,N序列可以直接毗连，或者被一个或多个其他核苷酸序列分离开。在另一种情况下，用于导入添加和缺失的寡核苷酸可以单独地或与含有N,N,N序列的密码子组合使用，以导入氨基酸添加、缺失和/或置换的任何组合或排列。
在特定示例情况下，可以使用含有毗连的N,N,N三联体、即简并的(N,N,N)n序列的寡核苷酸，同时突变两个或更多毗连的氨基酸位置。
在另一种情况下，本发明提供了简并性低于N,N,N序列的简并的表达盒的使用。例如，在某些情况下，可能希望使用(例如在寡核苷酸中)仅包含一个N的简并的三联体序列，其中所述N可以在三联体的第一、第二或第三位置中。在三联体的剩余两个位置中，可以使用任何其他碱基，包括其任何组合和排列。或者，在某些情况下可能希望使用(例如在寡核苷酸中)简并的N,N,N三联体序列、N,N,G/T或N,N,G/C三联体序列。
然而，应该认识到，出于几种原因，在本发明中所公开的简并的三联体(例如N,N,G/T或N,N,G/C三联体序列)的使用是有利的。一方面，本发明提供了在多肽的每个和所有氨基酸位置中系统且相当容易地产生可能的氨基酸(总共20种氨基酸)的全范围置换的手段。因此，对于100个氨基酸的多肽来说，本发明提供了系统且相当容易地产生2000个不同种类(即每个位置20种可能的氨基酸乘以100个氨基酸位置)的方式。应该认识到，通过使用含有简并的N,N,G/T或N,N,G/C三联体序列的寡核苷酸，提供了为20种可能的氨基酸编码的32种单个序列。因此，在使用一个这样的寡核苷酸对亲代多核苷酸序列进行饱和突变的反应容器中，产生编码20种不同多肽的32种不同的子代多核苷酸。相反，在定点突变中使用非简并的寡核苷酸，使得每个反应容器仅产生一个子代多肽产物。
本发明还提供了非简并的寡核苷酸的使用，其可以任选地与公开的简并引物组合使用。应该认识到，在某些情况下，使用非简并的寡核苷酸以在工作多核苷酸中产生定点突变是有利的。这提供了一种手段来产生沉默定点突变、引起相应氨基酸变化的点突变和引起终止密码子的产生和多肽片段的相应表达的点突变。
因此，在本发明的一种情况下，每个饱和突变反应容器含有编码至少20种子代多肽分子的多核苷酸，使得在对应于亲代多核苷酸中被突变的密码子位置的一个特定氨基酸位置处出现所有20种氨基酸。可以对从每个饱和突变反应容器产生的32倍简并的子代多肽进行克隆扩增(例如使用表达载体克隆到适合的大肠杆菌宿主中)并进行表达筛选。当通过筛选鉴定到表现出性质的有利变化(当与亲代多肽相比时)的单个子代多肽时，可以将它测序以鉴定其中包含的对应的有利的氨基酸置换。
应该认识到，在使用本文中所公开的饱和突变对亲代多肽中每个和所有的氨基酸位置进行突变之后，可能在超过一个氨基酸位置处鉴定到有利的氨基酸变化。可以产生含有所有或一部分这些有利的氨基酸置换的组合的一个或多个新的子代分子。例如，如果在多肽中的3个氨基酸位置的每个中鉴定到2个特定的有利的氨基酸变化，则排列包括每个位置处的3种可能性(与原始氨基酸相比无变化，以及两个有利的变化中的每一个)和3个位置。因此，存在总共3x3x3或27种可能性，包括以前检查过的7种——6个单一点突变(即三个位置的每个处各2个)和在任何位置处无变化。
因此，在非限制性的示例情况中，本发明提供了饱和突变与其他突变方法的组合使用，所述其他突变方法例如将两种或更多种相关的多核苷酸导入到适合的宿主细胞中，以便通过重组和还原重配产生杂交多核苷酸的方法。
除了在基因的整个序列上进行突变之外，本发明提供了可以使用突变来替换多核苷酸序列中任何数量的碱基中的每一个，其中待突变的碱基数量在一种情况下是15至100,000的每个整数。因此，代替突变沿着分子的每个位置，人们可以对每个或不连续数目的碱基(在一种情况下是总计从15至100,000的子集)进行突变。在一种情况下，将分离的核苷酸用于突变沿着多核苷酸序列的每个位置或位置组。一组待突变的3个位置可能是密码子。突变可以使用含有异源表达盒、也被称为突变表达盒的突变引物来导入。示例性的表达盒可以具有1至500个碱基。这样的异源表达盒中的每个核苷酸位置是N、A、C、G、T、A/C、A/G、A/T、C/G、C/T、G/T、C/G/T、A/G/T、A/C/T、A/C/G或E，其中E是A、C、G或T之外的任何碱基(E可以被称为设计者寡核苷酸)。
在一种情况下，饱和突变包括在待突变的确定多核苷酸序列(其中在一种情况下，待突变的序列长度为约15至100,000个碱基)中突变完整的一套突变表达盒(其中在一种情况下，每个表达盒的长度为约1-500个碱基)。因此，将一组突变(1至100个突变的范围内)导入到每个待突变的表达盒中。在一轮饱和突变实施期间，待导入到一个表达盒中的突变的分组与待导入到第二个表达盒中的突变的第二分组可以不同或相同。这样的分组以缺失、添加、特定密码子分组和特定核苷酸表达盒分组为例。
待突变的确定序列包括整个基因、通路、cDNA、完整开放阅读框(ORF)和完整启动子、增强子、阻遏物/反式激活因子、复制原点、内含子、操纵基因或任何多核苷酸官能团。一般来说，用于此目的的“确定序列”可以是15个碱基的多核苷酸序列和长度在15个碱基至15,000个碱基之间(本发明具体地指明其间的每个整数)多核苷酸序列的任何多核苷酸。在选择密码子的分组中的考虑因素包括由简并的突变表达盒编码的氨基酸的类型。
在可以导入到突变表达盒中的突变的分组的一种示例情况下，本发明具体提供了在每个位置处编码2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20种氨基酸的简并的密码子置换(使用简并的寡核苷酸)和由其编码的多肽的文库。
优化的定向进化系统
本发明提供了一种被称为“优化的定向进化系统”的非随机基因修饰系统，以产生本发明的具有新的或改变的性质的多肽例如葡聚糖酶(或纤维素酶)如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡萄糖苷酶或抗体。优化的定向进化涉及使用还原重配、重组和选择的重复循环，允许通过重组进行核酸的定向分子进化。优化的定向进化允许产生进化的嵌合序列的大的群体，其中产生的群体显著富集有具有预定数目的交换事件(crossover event)的序列。
交换事件是嵌合序列中的点，在所述点处发生了序列从一个亲代变体向另一个亲代变体的变化。这样的点通常在来自于两个亲代的寡核苷酸被连接在一起形成单一序列的接点处。这种方法允许计算寡核苷酸序列的正确浓度，以使最终的嵌合序列群体富集所选数目的交换事件。这对选择具有预定数目的交换事件的嵌合变体提供了更多控制。
此外，与其他系统相比，这种方法为探索海量的可能的蛋白质变异空间提供了方便的手段。以前，如果人们在反应期间产生例如1013个嵌合分子，则测试这样大量的嵌合变体的特定活性是极为困难的。此外，显著部分的子代群体将具有非常大数目的交换事件，导致产生的蛋白质不太可能具有增加水平的特定活性。通过使用这些方法，嵌合分子的群体可以富集那些具有特定数目的交换事件的变体。因此，尽管人们仍然在反应期间产生1013个嵌合分子，但所选的用于进一步分析的每个分子最可能具有例如仅仅3个交换事件。由于得到的子代群体可以被偏斜成具有预定数目的交换事件，因此降低了嵌合分子之间功能性变种的界限。这在计算来自于原始亲代多核苷酸的哪个寡核苷酸可能负责影响特定性状时，提供了更加可管理数目的变量。
产生嵌合的子代多核苷酸序列的一种方法是产生对应于每个亲代序列的片段或部分的寡核苷酸。在一种情况下，每个寡核苷酸包括独特的交叠区域，使得将寡核苷酸混合在一起将产生新的变体，其具有以正确次序组装的每个寡核苷酸片段。用于实践本发明的这些方法的可选替的方案，可以在美国专利号6,773,900、6,740,506、6,713,282、6,635,449、6,605,449、6,537,776、6,361,974中找到。
为每个亲代变体产生的寡核苷酸的数目，与最终产生的嵌合分子中得到的交换的总数有关。例如，可以提供三个亲代核苷酸序列变体来进行连接反应，以便寻找例如在高温下具有更高活性的嵌合变体。作为一个实例，可以产生对应于每个亲代变体的每个部分的一套50个寡核苷酸序列。因此，在连接重新组装过程期间，在每个嵌合序列内可以存在最多50个交换事件。每个产生的嵌合多核苷酸以交替次序含有来自于每个亲代变体的寡核苷酸的概率非常低。如果每个寡核苷酸片段以相同的摩尔量存在于连接反应中，可能在某些位置中来自于同一亲代多核苷酸的寡核苷酸将彼此连接，因此不引起交换事件。如果在这一实例中来自于每个亲代的每个寡核苷酸的浓度在任何连接步骤期间保持恒定，则来自于同一亲代变体的寡核苷酸连接在嵌合序列内并且不产生交换，将有1/3的机会(假设3个亲代)。
因此，给定设定数目的亲代变体、对应于每个变体的寡核苷酸的数量和连接反应中每个步骤期间每种变体的浓度，可以确定概率密度函数(PDF)以预测在连接反应中的每个步骤期间可能发生的交换事件的群体。确定PDF后面的统计学和数学描述在下文中。利用这些方法，人们可以计算这样的概率密度函数，并因此富集从特定连接反应得到的具有预定数目的交换事件的嵌合子代群体。此外，可以预先确定交换事件的目标数目，然后对系统进行编程，以计算为产生以交换事件的预定数目为中心的概率密度函数、在连接反应中的每个步骤期间所需的每种亲代寡核苷酸的起始量。这些方法涉及使用还原重配、重组和选择的重复循环，以允许通过重组进行编码多肽的核酸的定向分子进化。这种系统允许产生进化的嵌合序列的大的群体，其中产生的群体显著富集具有预定数目的交换事件的序列。交换事件是嵌合序列中的点，在所述点处发生了序列从一个亲代变体向另一个亲代变体的变化。这样的点通常在来自于两个亲代的寡核苷酸被连接在一起形成单一序列的接点处。这种方法允许计算寡核苷酸序列的正确浓度，以使最终的嵌合序列群体富集所选数目的交换事件。这对选择具有预定数目的交换事件的嵌合变体提供了更多控制。
此外，与其他系统相比，这些方法为探索海量的可能的蛋白质变异空间提供了方便的手段。通过使用本文中描述的方法，嵌合分子的群体可以富集有那些具有特定数目的交换事件的变体。因此，尽管人们在反应期间仍然可以产生1013个嵌合分子，但所选的用于进一步分析的每个分子最可能具有例如仅仅3个交换事件。由于得到的子代群体可以被偏斜成具有预定数目的交换事件，因此降低了嵌合分子之间功能性变种的界限。这在计算来自于原始亲代多核苷酸的哪个寡核苷酸可能负责影响特定性状时，提供了更加可管理数目的变量。
在一种情况下，所述方法通过产生对应于每个亲代序列的片段或部分的寡核苷酸来产生嵌合的子代多核苷酸序列。在一种情况下，每个寡核苷酸包括独特的交叠区域，使得将寡核苷酸混合在一起将产生新的变体，其具有以正确次序组装的每个寡核苷酸片段。同样参见美国专利号6,537,776、6,605,449。
进化的内切葡聚糖酶可以被用作新的最少纤维素酶混合物的一部分，或者可以在用于从生物质生产乙醇的糖化或同时的糖化和发酵(SSF)反应中，补充或替换全真菌纤维素酶混合物的内切葡聚糖酶组分。
通过GSSM将各个点突变导入到GH5内切葡聚糖酶BD25243中，并在黑曲霉(A.niger)中表达。将表达的酶变体在磨碎的蒸汽爆炸的甘蔗渣上，在过程相关条件下筛选提高的比活性。鉴定到的最好突变列于下面的表1中。
表1.
*SEQ ID NO:1,2
实施例
实施例1
野生型内切葡聚糖酶的GSSM(基因位点饱和突变)
使用含有NNK简并性的重叠DNA引物，为在信号肽终点与终止密码子之间的内切葡聚糖酶(EG)的gDNA序列(360个残基)中的每个氨基酸位置产生变体文库，在所述简并性中，N表示任何核苷酸(A、C、G或T)，K表示含有酮基的核苷酸(G或T)。突变的残基包括完整的N-端CBM结构域、连接物区域和催化结构域。突变引物的NNK简并性可以在每个残基处潜在地产生覆盖所有20种可能氨基酸的32种不同密码子。
GSSM反应在96孔板中，使用从标准的实验室dam+大肠杆菌宿主菌株制备的野生型EG的甲基化的模板DNA来进行。将用于每个氨基酸位置的成对的正向和反向NNK简并引物与模板DNA以及dNTPs、反应缓冲液和高保真DNA聚合酶合并。GSSM反应在标准的PCR条件下，使用适合于目的蛋白质和包含它的复制型质粒的扩增的延伸时间来运行。每个GSSM反应产生由变体文库构成的产物，所述文库对于单一残基来说潜在地含有最多所有20种可能的氨基酸。将反应产物用DpnI限制性酶处理以消化甲基化的野生型模板DNA并留下完整的非甲基化变体DNA。在DpnI处理后，将PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳并用溴化乙锭染色，以验证质粒的扩增。
在这种情况下，使用“序列优先”方法，由此将成功扩增的质粒文库转化到标准的实验室大肠杆菌菌株中，并将得到的各自含有单一文库变体的分离的菌落用于接种384孔板中的培养物。在过夜生长后，产生平行样板用于存档，并将来自于培养物的DNA用于测序，以确定由简并引物导入的核苷酸突变和因此造成的氨基酸突变。该测序步骤也提供了QC步骤，以消除含有野生型序列或不想要的突变(非定点突变、添加或缺失)的菌落。如果从GSSM反应获得少于16种氨基酸变体(不包括野生型)，则可以挑取第二块384孔板的分离的菌落用于另外的测序。在具有低氨基酸覆盖度的罕见情况下，使用原始的NNK引物或有时使用含有获得在原始GSSM反应的测序中未发现的氨基酸所需的最低简并性的引物，来重复GSSM反应。
在测序后，将通过GSSM反应获得的每个氨基酸的突变，从存档板挑取两份平行样到96孔培养板中。在可能时，单一残基的氨基酸变体的两份平行样由编码相同氨基酸的两种不同核苷酸变体构成。通常将两个残基的氨基酸变体挑取在板的每一半中。将这些培养物生长过夜并存档以用于下游处理。在这种情况下，将已知序列的基因转化到真菌筛选宿主中。
实施例2
将亲代EG基因插入到pDC-A2载体中，并使用GSSM技术制造变体。将文库转化到大肠杆菌Stbl2中，测序，然后继续进行在黑曲霉(Aspergillus niger)中的真菌转化。
在制造本发明的EG变体中使用的pDC-A2载体是载体pGBFin-5(描述在例如美国专利号7,220,542中)的重新构建物，其被重新制造以减小载体的总尺寸。将pGBFin-5的2.1kb的3’Gla区域缩减到0.54kb，gpd启动子保持不变，但是将2.24kb的amdS序列用编码潮霉素磷酸转移酶的1.02kb的hygB基因替换。将pGBFin-5的2.3kb的3’Gla区域缩减至1.1kb的片段，其代表原始序列的5’末端。pDC-A2的大肠杆菌复制子从pUC18获取。
在将载体转化到大肠杆菌Stbl2中之后，将各个大肠杆菌转化子挑取到96孔板中，并在液体培养物中，在每个孔200μl LB加氨苄青霉素(100μg/ml)中在30℃生长过夜。然后将细胞用于通过菌落PCR产生测序反应用模板。对来自于克隆文库的序列数据进行分析，以鉴定EG的独特变体。然后将含有所选变体的大肠杆菌转化子以96孔板格式重新部署，并用于通过PCR，使用与3’和3”Gla区域的末端杂交的引物制备整个表达盒的线性DNA(pDC-A2的除了大肠杆菌复制子之外的内容)。然后使用来自于每个克隆的约1μg的PCR产物，在PEG介导的转化中，在96孔板的一个孔中转化黑曲霉原生质体(即每个孔一个克隆)。在重新产生的琼脂(每个孔200μl的PDA加上340g/l蔗糖和200μg/ml潮霉素)上以同样的96孔格式选择转化子。在30℃温育7天后，使用pintool将转化子复制到含有PDA加上潮霉素(200μg/ml)的96孔板。在30℃温育另外7天后，使用来自于每个孔的孢子接种96孔板的每个孔200μl液体培养基。将板在30℃温育7天，并从每个孔回收含有分泌的EG变体的上清液。
用于生长用含有变体的表达构建物转化的曲霉的培养基具有下列组成：NaNO3，3.0g/l；KCl，0.26g/l；KH2PO4，0.76g/l；4M KOH，0.56ml/l；D-葡萄糖，5.0g/l；酪蛋白水解物，0.5g/l；微量元素溶液0.5ml/l；维生素溶液5ml/l；青霉素-链霉素溶液(分别为10,000U/ml和10,000μg/ml)5.0ml/l；麦芽糖，66.0g/l；大豆蛋白胨，26.4g/l；(NH4)2SO4，6.6g/l；NaH2PO4.H2O，0.44g/l；MgSO4.7H2O，0.44g/l；精氨酸，0.44g/l；吐温-80，0.035ml/l；Pleuronic Acid消泡剂，0.0088ml/l；MES，18.0g/l。每100ml微量元素溶液具有下列组成：ZnSO4.7H2O，2.2g；H3BO3，1.1g；FeSO4.7H2O，0.5g；CoCl2.6H2O，0.17g；CuSO4.5H2O，0.16；MnCl2.4H2O，0.5g/l；NaMoO4.2H2O，0.15g/l；EDTA，5g/l。每500ml维生素溶液具有下列组成：核黄素，100mg；硫胺素.HCl，100mg；烟酰胺，100mg；吡哆醇.HCl，50mg；泛酸，10mg；生物素0.2mg。
实施例3
EG GSSM筛选的测定法条件
通过将真菌转化孢子从琼脂板转移到96孔Pall过滤板中的液体培养基中，将内切葡聚糖酶GSSM突变体在液体培养物中生长。在生长5-7天后，通过离心将培养物收集到新的96孔板中，以便在筛选之前从上清液中过滤掉真菌生物质。每块上清液板通常含有两个GSSM残基的独特氨基酸变体以及野生型和仅仅载体对照的两列。野生型对照包括来自于在板上生长的转化子的上清液和在从独立生长的培养物收获后添加到板中的上清液两者。这种独立的培养物将通过凝胶密度测量术和以三种已知浓度添加的“掺入的”对照，以产生剂量响应曲线而预先定量。然后将上清液分成两份料流，用于两项分开的高通量筛选，如图1中所示。一项筛选通过预先处理的生物质的酶消化来检测活性，通过葡萄糖释放进行测量，另一项是使用蛋白质特异性Ab进行的酶定量ELISA。
活性测定法测量从酸预处理的蒸汽爆破的甘蔗渣的消化释放的葡萄糖。将预处理过的底物洗涤、干燥并粉碎至40目，然后使用标准方法进行组成分析。使用这一底物制备0.4％纤维素在50mM NaOAC pH5.0缓冲液中的悬液，并分发到96孔板中。使用野生型CBHI和CBHII以及EG突变体上清液产生酶混合物板。包含这些酶是重要的，因为所有三者协同作用以消化甘蔗渣。向底物板添加这种混合物以起始反应。将样品充分混合然后离心，随后将初始时间点转移到含有400mMpH10碳酸钠缓冲液的384孔终止板中。将反应板密封并置于37℃振摇培养箱中48小时，然后将它们再次离心，并将48小时时间点的三份平行样转移到终止板中。在所述时间点进行测量单体葡萄糖信号的葡萄糖氧化酶测定法，以测量葡萄糖从底物的酶促释放。向含有pH7.4磷酸钠缓冲液、葡萄糖氧化酶(Sigma#G7141-50KU)、辣根过氧化物酶(Sigma#P2088-5KU)和Amplex red(Invitrogen No.22177)的混合物加入来自于终止板的样品。将该混合物在室温温育30分钟，并在560/610nm激发/发射波长处测量荧光。
ELISA定量测定法使用在用纯化的野生型EG接种的兔中产生的酶特异性多克隆抗体，测量表达的蛋白质的浓度。将真菌表达的蛋白质在PBS中稀释并转移到NUNC Immuno Maxisorp板中结合过夜。第二天，向样品加入封闭试剂，随后与第一抗体和第二抗体(Sigma的带有过氧化物酶的在山羊中生长的抗兔抗体完整分子)的优化稀释液温育。加入SureBlue TMB检测试剂，然后加入终止试剂(1M磷酸)，并在450nm处读取吸光值。
对甘蔗渣活性和ELISA数据进行分析，以计算每种变体与野生型对照相比的比活性。选择显示出比对照更高的比活性的样品用于二级筛选。
对于二级筛选来说，从冷冻的存档真菌孢子板挑取一式四份初筛命中物，并将其在96孔PALL板中在液体培养物中再次生长，用于收获上清液。对这些上清液进行上面描述的活性和ELISA测定。对数据进行分析以选择命中物用于三级筛选。
实施例4–三级和剂量响应筛选
将二级筛选命中物在50mL摇瓶黑曲霉培养物中生长起来。在收获和回收后，使用凝胶密度测量术，针对纯化的野生型EG标准品测量命中物的蛋白质浓度，以确定准确浓度。三级筛选反应在10ml小管中在35℃下进行，一式两份。反应体积为5ml，使用蒸汽爆破的甘蔗渣，载量为50mM pH5.2乙酸钠中5％的固形物，并加入1mM叠氮化钠以防止污染。向每个小管加入两个不锈钢BB，然后将小管加盖、密封，并置于300rpm的振摇培养箱中。在野生型CBHI和CBHII存在下，将EG变体与野生型EG进行比较。总的酶剂量为10mg酶/g纤维素，具有2:2:1的比率(EG:CBHI:CBHII)。时间点被取为T0、24、48和72小时，并通过HPLC使用示差折光检测(RID)进行分析，以测量糖产物(葡萄糖、纤维二糖等)。结果示出在图2和表2中。
将来自于三级筛选的性能靠前的命中物，遵照非常类似的格式在剂量响应测定法中试验，区别在于EG变体以1x、0.75x和0.5x的浓度装载，同时保持CBHI和CBHII剂量恒定。剂量响应测定法的目的是确定产生与1x野生型EG剂量相同的性能的EG变体所容许的剂量降低。
表2
归一化至24小时时间点的WT

Claims (20)

1.一种家族5的糖苷水解酶变体，所述变体由野生型亲代多核苷酸的突变形式编码，所述突变形式与SEQ ID NO：1的(cDNA)核苷酸序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高或完全的序列同一性，并包含至少一种下列核苷酸残基变化：
157至159位处的核苷酸是TCT；
175至177位处的核苷酸是AAG；
175至177位处的核苷酸是CAT；
181至183位处的核苷酸是CCT；
190至192位处的核苷酸是AAT；
208至210位处的核苷酸是ATG；
259至261位处的核苷酸是CAT；
259至261位处的核苷酸是ATG；
274至276位处的核苷酸是GCT；
547至549位处的核苷酸是TTG；
550至552位处的核苷酸是GAG；
574至576位处的核苷酸是AAT；
589至591位处的核苷酸是GCT；
595至597位处的核苷酸是ATG；
598至600位处的核苷酸是GTT；和
898至900位处的核苷酸是GCG；
其中所述变体具有至少一种下列活性：内切葡聚糖酶活性，β-甘露聚糖酶活性，外切-1,3-葡聚糖酶活性，内切-1,6-葡聚糖酶活性，木聚糖酶活性和神经节苷脂内切糖苷酶活性；并且其中所述变体的活性高于由具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列的野生型亲代多核苷酸编码的多肽。
2.权利要求1的家族5的糖苷水解酶变体，其中所述家族5的糖苷水解酶变体具有内切葡聚糖酶活性。
3.一种表达盒、载体或克隆载体，其包含权利要求1的野生型亲代多核苷酸序列SEQ ID NO：1的突变形式，
其中任选地所述克隆载体包含病毒载体、质粒、噬菌体、噬粒、粘粒、福斯质粒、细菌噬菌体或人工染色体，
并且任选地所述病毒载体包含腺病毒载体、反转录病毒载体或腺相关病毒载体，并且任选地所述克隆载体包含细菌人工染色体(BAC)、质粒、细菌噬菌体P1衍生载体(PAC)、酵母人工染色体(YAC)或哺乳动物人工染色体(MAC)。
4.一种转化的细胞，其包含含有权利要求1的野生型亲代多核苷酸序列SEQ ID NO：1的突变形式的核酸，
其中任选地所述细胞是细菌细胞、哺乳动物细胞、真菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或植物细胞。
5.一种转化的细胞，其包含权利要求3的表达载体。
6.权利要求5的转化的细胞，其中所述细胞是细菌细胞、哺乳动物细胞、真菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或植物细胞。
7.权利要求6的转化的细胞，其中所述细菌细胞选自运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)、大肠埃希式杆菌(Escherichia coli)和产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)。
8.权利要求6的转化的细胞，其中所述酵母细胞选自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、假热带假丝酵母(Candida pseudotropicalis)和嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tannophilus)。
9.权利要求6的转化的细胞，其中所述真菌细胞选自曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、根霉属(Rhizopus)、金孢霉属(Chrysosporium)、毁丝霉属(Myceliophthora)、木霉属(Trichoderma)、腐质霉属(Humicola)、支顶孢属(Acremonium)或镰孢菌属(Fusarium)。
10.权利要求9的转化的细胞，其中所述真菌细胞是黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、里氏木霉(Trichodermareesei)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)或米根霉(Rhizopus oryzae)。
11.权利要求6的转化的细胞，其中所述酵母细胞选自酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、克勒克酵母属(Klockera)、许旺酵母属(Schwanniomyces)或亚罗酵母属(Yarrowia)。
12.权利要求11的转化的细胞，其中所述酵母细胞是酿酒酵母(S.cerevisiae)、博伊丁酵母(S.bulderi)、S.barnetti、啤酒酵母(S.exiguus)、葡萄汁酵母(S.uvarum)、S.diastaticus、乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)或脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)。
13.一种成熟的家族5的糖苷水解酶变体，所述变体具有野生型亲代多肽的突变形式，所述突变形式与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高或完全的序列同一性，并包含至少一种下列氨基酸残基变化：
53位处的脯氨酸被丝氨酸置换；
59位处的脯氨酸被组氨酸置换；
59位处的脯氨酸被赖氨酸置换；
61位处的苏氨酸被脯氨酸置换；
64位处的赖氨酸被天冬酰胺置换；
70位处的甘氨酸被甲硫氨酸置换；
87位处的苏氨酸被组氨酸置换；
87位处的苏氨酸被甲硫氨酸置换；
92位处的甘氨酸被丙氨酸置换；
183位处的丝氨酸被亮氨酸置换；
184位处的苏氨酸被谷氨酸置换；
192位处的赖氨酸被天冬酰胺置换；
197位处的谷氨酰胺被丙氨酸置换；
199位处的赖氨酸被甲硫氨酸置换；
200位处的丝氨酸被缬氨酸置换；和
300位处的赖氨酸被丙氨酸置换；
其中所述变体具有至少一种下列活性：内切葡聚糖酶活性，β-甘露聚糖酶活性，外切-1,3-葡聚糖酶活性，内切-1,6-葡聚糖酶活性，木聚糖酶活性和神经节苷脂内切糖苷酶活性；并且其中所述变体的活性高于具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的野生型亲代多肽。
14.权利要求13的变体，其中所述变体具有内切葡聚糖酶活性。
15.一种用于水解纤维素的方法，所述方法包括将生物质与权利要求13的多肽相接触。
16.权利要求15的方法，其中所述生物质在与所述多肽相接触之前经历预处理过程。
17.权利要求16的方法，其中所述预处理过程包括将所述生物质加热到至少50℃的步骤。
18.权利要求16的方法，其中所述预处理过程包括将所述生物质与水性溶液相接触的步骤。
19.权利要求18的方法，其中所述水性溶液具有低于7的pH。
20.权利要求18的方法，其中所述水性溶液具有高于7的pH。
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