CN114075517A - 马克斯克鲁维酵母工程菌株及其制备方法和生产乙醇的方法 - Google Patents

马克斯克鲁维酵母工程菌株及其制备方法和生产乙醇的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因工程技术领域,特别涉及马克斯克鲁维酵母工程菌株及其制备方法和生产乙醇的方法。该马克斯克鲁维酵母工程菌株为转入KmGCR1基因和KmGCR2基因的马克斯克鲁维酵母。与改造其他的转录因子相比,KmGcr1p、KmGcr2p更加具有全局性,不仅可以促进糖酵解过程,还可以提高菊粉酶活力以提高底物利用率、加快生长速率以缩短生产周期、维持细胞的高耐热性以减少生产成本和发酵罐使用的地域限制和季节限制、增加发酵过程中抗逆物质的产量以抵御不良环境。超表达KmGCR1和KmGCR2基因是得到在40℃以上利用非粮食作物高产乙醇的马克斯克鲁维酵母的可选策略。

Description

马克斯克鲁维酵母工程菌株及其制备方法和生产乙醇的方法
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域,特别涉及马克斯克鲁维酵母工程菌株及其制备方法和生产乙醇的方法。
背景技术
随着人们生活水平的逐渐提高,化石燃料的使用量也逐渐增加,导致了全球变暖和世界性的环境污染问题,这促使我们找到一种环境友好型的可持续生物燃料来代替化石燃料。生物乙醇就是一种使用最为广泛的生物燃料,它是通过微生物的发酵过程将各种生物质转化为燃料乙醇。生物乙醇与汽油相比,具有更高的辛烷值、更宽的可燃性极限和更高的汽化热;与石油相比,生物乙醇的毒性更小、产生的环境污染更少。酵母在生物乙醇的发酵中起十分重要的作用,它具有乙醇产量高、乙醇耐受性强、易于培养等特点。在诸多酵母中,酒精酵母具有乙醇产量高、耐受pH范围广、安全性强等特点,在几千年前就被选出应用于酿酒行业了,现在更是成为了生物乙醇制备的工业菌株。但是,与此同时它又有局限性。一方面,在乙醇发酵过程中,微生物大量代谢热的产生使整个发酵罐的温度达到40℃以上,而酒精酵母的最高生长温度为35℃。为了保证发酵过程的顺利进行,必须在发酵过程中通入大量冷凝水以降低发酵体系的温度。尤其是对于处于热带区域的国家而言,全年的高温更是大大提高了冷凝水带来的生产成本。酒精酵母这一局限性使得发酵罐运行受到了地域限制和季节限制。另一方面,酒精酵母多利用粮食作物为原料进行乙醇发酵,如甜高粱、玉米等。在全球人口日益增多的今天,必须对乙醇发酵的原料进行革新,否则只会加剧粮食紧缺的现象。
马克斯克鲁维酵母的耐高温能力很强,大部分可以在48℃的条件下生长,极个别种类的耐受温度可达52℃,在45℃的高温下仍可以产生乙醇。并且它的底物来源很广,既包括葡萄糖、果糖等常规碳源,还包括乳糖、木糖、菊粉等非常规碳源。但是马克斯克鲁维酵母的乙醇产量限制了其在高温乙醇发酵中的应用。所以筛选出可以在40℃以上利用非粮食作物高产乙醇的马克斯克鲁维酵母成为急需要解决的关键技术问题。
马克斯克鲁维酵母的耐高温能力很强,在45℃的高温下仍可以产生乙醇。它的底物来源很广,可以利用菊粉作为底物用于乙醇发酵。菊粉来源广泛、价格便宜,主要是从菊芋、菊苣等非粮食作物中提取的,它们的耐寒、耐旱能力强,可以在贫瘠的土地生长,也不会与粮食作物竞争耕种地。菊粉酶可以水解菊粉的β-2,1-果糖苷键,其水解产物果糖和葡萄糖可以直接通过糖酵解途径生成乙醇。菊粉酶主要来源于微生物,并且在真菌中,马克斯克鲁维酵母的菊粉酶活力是最高的。菊粉酶的最适作用温度为50—55℃,即使在温度超过40℃的发酵罐中仍可保持高活性。综上所述,以菊粉为底物,利用马克斯克鲁维酵母进行高温乙醇发酵是很有潜力的。Kanlayani筛选得到了一株耐热K.marxianus Y-102,利用菊芋块茎在40℃下进行高温乙醇发酵,并对其碳源浓度和发酵pH进行优化,最终可以在总糖浓度230g/L,pH5.5~6.0的条件下产生85.41g/L乙醇;Hu筛选得到了一株耐热K.marxianus PT-1,以菊粉为底物在进行40℃在进行高温乙醇发酵。在菊粉浓度为100g/L和200g/L时的乙醇产量分别达到43g/L和69.6g/L。
但是马克斯克鲁维酵母的乙醇耐受性比较差,较低的乙醇产量限制了其在高温乙醇发酵中的应用。发酵过程中积累的乙醇会抑制细胞的生长,影响细胞不同的转运系统,改变细胞膜的流动性和通透性,从而扰乱蛋白质构象。乙醇耐受性是一个十分复杂的调控过程,涉及许多基因共同作用,很难通过一两个基因的改变而得以提升,具体的分子机制至今也没有完全被研究清楚。之前很多工作是通过适应性进化或诱变技术来提高马克斯克鲁维酵母的乙醇产量。但是适应性进化是一个较为耗时的过程,诱变技术带来的突变大多是有害的和中性的。因此需要找到更合理有效的改造手段。
微生物较为复杂的表型很大程度上是依赖于转录因子的,转录因子可以调控很多基因的遗传信息从DNA到mRNA传递。所以近几年来,改变转录因子的表达量来实现细胞代谢的重新编程成为提高酵母的乙醇产量的新策略。酒精酵母HAP4基因编码的转录激活因子可以调节线粒体呼吸相关基因的表达。Akinori敲除酒精酵母的HAP4基因后,与野生菌株相比,敲除菌株的乙醇产率和乙醇产量都得到了提升;Wu等人对酒精酵母77个非必须转录因子进行了筛选,发现转录因子Ace2和Swi5的敲除可以大幅度提升乙醇产量,是乙醇发酵的负调节因子;为了提高酒精酵母的高温乙醇产量,Li将马克斯克鲁维酵母中的转录因子KmMsn2和KmHsf1导入酒精酵母中进行异源表达,实验结果表明:表达KmMsn2和KmHsf1后,有105个基因的表达水平发生了变化。其中KmHsf1可能通过调节与转运蛋白活性相关的基因来促进葡萄糖的摄取,从而增加乙醇的产生。而KmMsn2可能通过调节糖酵解、糖异生相关的基因来促进乙醇发酵。改变转录因子的表达量来实现细胞代谢的重新编程成为提高酵母的乙醇产量更为有效的手段。
糖酵解途径是酵母细胞碳化合物代谢的主要途径,Gcr1p是糖酵解相关基因高水平表达所必须的,通过与糖酵解基因启动子上CT-box(CT/ATCC)特异性结合来激活它们的表达。此外,Gcr1p作为全局调控因子,它还调控己糖转运、TCA循环、呼吸链、核糖体蛋白表达和细胞周期等过程。Gcr1p的转录激活作用需要Gcr2p的辅助。但是Gcr2p没有DNA结合结构域,人们已经通过双杂交实验证明它是通过C端的亮氨酸拉链结构与Gcr1p结合共同发挥作用的。当Gcr2p与Gcr1p结合成为一个复合体时,Gcr2p为复合体提供转录激活结构域,并且Gcr2p会改变Gcr1p的磷酸化状态或构像。Kim等人通过在酒精酵母中超表达GCR1基因提高了细胞的生长速率和葡萄糖摄取率,提高了酒精酵母合成乙醇、乙酸等化合物的能力;Sasaki在酒精酵母中构建了GCR1基因和GCR2基因的突变体,结果发现相比于原始菌株,突变体中的大部分糖酵解基因的表达水平都显著下降了,而编码TCA循环代谢酶的基因表达水平显著上升。这暗示着在Gcr突变体中,碳源的消耗更倾向于用于菌体生长而不是乙醇发酵。Sasaki测量了不同菌株的乙醇产率,发现相比于原始菌株,Gcr1p、Gcr2p突变体的乙醇产率分别下降了23%和52%;Mónica的研究则表明,在乳酸克鲁维酵母中敲除Gcr1p,会降低葡萄糖利用能力和乙醇发酵产量,但转化子的氧化应激能力变强。上述公开技术均是针对酒精酵母中GCR1基因和/或GCR2基因的改造方案。目前,还没有公开技术对马克斯克鲁维酵母中GCR1基因和GCR2基因进行研究,针对马克斯克鲁维酵母中GCR1基因和/或GCR2基因的改造效果也没有进行验证。
发明内容
有鉴于此,本发明提供了马克斯克鲁维酵母工程菌株及其制备方法和生产乙醇的方法。本发明同时超表达KmGCR1和KmGCR2基因,以显著提高KmGcr1p的转录活性以及目标基因的表达量,得到在40℃以上利用非粮食作物高产乙醇的马克斯克鲁维酵母。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供了一种马克斯克鲁维酵母工程菌株,该马克斯克鲁维酵母工程菌株为转入KmGCR1基因和KmGCR2基因的马克斯克鲁维酵母。
本申请以转录因子KmGcr1p和KmGcr2p为研究对象,探究其对马克斯克鲁维酵母高温乙醇发酵的调控作用。值得注意的是,本发明对KmGcr1p进行同源比对时发现,KmGcr1p具有一段谷氨酰胺富集区,这段序列是马克斯克鲁维酵母的KmGcr1p所特有的,这更加引起了发明人的研究兴趣。
本申请研究发现,超表达KmGcr1p可以提高菌株的菊粉酶活力、生长速率、抗逆物质的合成,并有利于维持细胞的强耐热性,有利于马克斯克鲁维酵母的高温乙醇发酵。在超表达KmGcr1p的基础上同时超表达KmGcr2p可以显著提高KmGcr1p的转录活性,进一步激活糖酵解作用以及目标基因的表达,是筛选出可以在40℃以上利用非粮食作物高产乙醇的马克斯克鲁维酵母的可选策略。
作为优选,KmGCR1基因的碱基序列如SEQ ID NO:1所示,或者KmGCR1基因的碱基序列为在SEQ ID NO:1所示碱基序列基础上插入、缺失、替换一个或多个碱基、功能维持不变的碱基序列。
作为优选,KmGCR2基因的碱基序列如SEQ ID NO:2所示,或者KmGCR2基因的碱基序列为在SEQ ID NO:2所示碱基序列基础上插入、缺失、替换一个或多个碱基、功能维持不变的碱基序列。
在本发明提供的具体实施例中,马克斯克鲁维酵母工程菌株的起始改造菌株为K.marxianus KM-0菌株。但起始改造菌株并非限定于此,本领域技术人员认可的起始改造菌株均在本发明的保护范围之内。
本发明还提供了该马克斯克鲁维酵母工程菌株的制备方法,包括如下步骤:
将KmGCR1基因连入表达载体中,得到含有KmGCR1基因的表达载体;
将含有KmGCR1基因的表达载体转化入起始改造菌株,得到超表达转化子;
将KmGCR2基因连入表达载体中,得到含有KmGCR2基因的表达载体;
将含有KmGCR2基因的表达载体转化入超表达转化子,得到马克斯克鲁维酵母工程菌株。
在本发明提供的具体实施例中,表达载体为pMD-rDNA-G418或pMD-rDNA-NAT。但表达载体并非限定于此,本领域技术人员认可的表达载体均在本发明的保护范围之内。
本发明还提供了一种生产乙醇的方法,包括:以菊粉为底物,采用上述马克斯克鲁维酵母工程菌株进行发酵培养生产乙醇。
作为优选,发酵培养的温度为40~48℃。
在本发明提供的具体实施例中,发酵培养的温度为42℃。
作为优选,发酵培养的菊粉浓度为50~300g/L。
在本发明提供的具体实施例中,发酵培养的菊粉浓度为150g/L。
本发明提供了马克斯克鲁维酵母工程菌株及其制备方法和生产乙醇的方法。该马克斯克鲁维酵母工程菌株为转入KmGCR1基因和KmGCR2基因的马克斯克鲁维酵母。本发明具有的技术效果为:
1、与适应性进化或诱变技术相比,本发明省时高效,目前还未发现给超表达菌株带来有害变异,并且许多性状是得到优化的;
2、与改造其他的转录因子相比,KmGcr1p、KmGcr2p更加具有全局性,不仅可以促进糖酵解过程,还可以提高菊粉酶活力以提高底物利用率、加快生长速率以缩短生产周期、维持细胞的高耐热性以减少生产成本和发酵罐使用的地域限制和季节限制、增加发酵过程中抗逆物质的产量以抵御不良环境。这种综合性多方面的影响在其他转录因子中还未见报道。同时超表达KmGCR1和KmGCR2基因是得到在40℃以上利用非粮食作物高产乙醇的马克斯克鲁维酵母的可选策略。
附图说明
图1 KmGCR1基因序列及其编码序列;
图2 KmGCR1基因敲除载体;
图3 KmGcr1p超表达载体和Q-rich基序敲除载体的构建过程;
图4转化子的PCR验证结果;
图5不同菌株的生长曲线;
图6不同菌株的菊粉酶活力,其中*表示相对于原始KM-0菌株差异性显著;**表示差异性极显著;
图7不同菌株的细胞耐热性比较;
图8不同菌株的海藻糖产量,其中*表示相对于原始KM-0菌株差异性显著;**表示差异性极显著;
图9不同菌株的甘油产量,其中*表示相对于原始KM-0菌株差异性显著;**表示差异性极显著;
图10不同转化子的高温乙醇产量,其中*表示相对于原始KM-0菌株差异性显著;**表示差异性极显著;
图11 KmGCR2基因序列及其编码序列;
图12 KmGCR2基因超表达载体构建过程;
图13利用引物NATs、NATa对转化子进行PCR验证;
图14不同转化子的高温乙醇产量,其中*表示相对于原始KM-0菌株差异性显著;**表示差异性极显著。
具体实施方式
本发明公开了马克斯克鲁维酵母工程菌株及其制备方法和生产乙醇的方法,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
本发明提供的马克斯克鲁维酵母工程菌株及其制备方法和生产乙醇的方法中所用载体、菌株、试剂或仪器均可由市场购得。
下面结合实施例,进一步阐述本发明:
实施例1
1.KmGCR1基因克隆和分析
本实验室保藏的K.marxianus KM-0菌株是一株高产菊粉酶的工业发酵菌株,菌株编号为MCCC2E001023。它所产的菊粉酶具有很好的耐热性和较高的活力。用YPD培养基培养KM-0菌株,提取基因组DNA,设计特异扩增KmGCR1基因的引物(GCR1s:TCCCACTTTATTCTTATCCCTCC和GCRa:TTATTCATTATCATCTTGCGAGTAA)。扩增的KmGCR1基因(碱基序列如SEQ ID NO:1所示)以及根据该碱基序列推导出的氨基酸序列如图1所示。该基因大小为2439bp,编码812个氨基酸,在48~89氨基酸序列处含有1个谷氨酰胺富集基序(Q-rich基序),这段序列是马克斯克鲁维酵母的KmGcr1p所特有的;在354~389氨基酸残基之间存在1个亮氨酸拉链结构;在514~556氨基酸残基之间是一个丝氨酸脯氨酸富集区域;在氨基酸序列C端处具有一段高度保守的DNA结合结构域。
KmGCR1基因:
ATGGACAAAGACAATTTGAATATCAATTTGCAGGACTGGCTTAATGACCCGATGTTAGCGGCGCAGCTAAACCGTCCTCAGTCTGCCACGCCGACAATATACAACGGTATCGATGGTTCGAATACCAATGGGGCTGTGGTACAAACGCAACAACAATCGGACCAGCAGCAGCAACAGCAGCAGCAGCAGCAGGAACAACAACAACAGCAACAGCAACAGATTCAAATACAAGTCCAACAGCAACAACAGGAACAACAGAATAAGAATGCAGCAGGAAAATCTGTAGACCAAGCATCTACATCGGAGCTCTCTAGCTTTTTAATGAACTCGAGGCTCAACTTGGGAACTTTGATGAAGTTCGTCTGCATCGAATTCTTCAAGTGTAATAAGGACGAGCTAGCTAATCTTCGGTTAATTGACTTGACTCAAGATTCCACCTTCCCTCAAACTCTTACTCTCAGAAATATGCAAACGGAAAATTCGCATTACAAGTTCTTCAACACCATCAATCGGGACAAATTTATTACCAGTTGTCCTGTCTTCGCAGTAGCACTCTACTCCTTTATCACATGGAAACATACAGCCATCTCTTGGAAAAATTTCGTCAATTTACCGCTAATATTCGATTCAAAAGACATCATAATGCTTCAAGGTAATAGCCAAAATCGAGCGCCTGTATATACCAATAAGATTGTAAGGATATCGGTATCTCCAAAGAAGGAATTACTCTGCTACGTGTTCCCTTGGTTACCTGCATTAGAAAGAGATTACTTGAGTCATGATAGATCAAACTACATCCTCTTCTCGCTAGTAGAATTATTCAATTTTTTGGCTAAAGTCATACTTCAAGACTTTGCCTTCCTACAATGCACGGGTCAACTACCTCACTTGCAAGAGTTGATCAAATCTGAATTGGGGTGGCAGTTTTTAGAGTCTGATGACTGGAACCAGTTCAAGGATGAAATGCAACGGCATATTGATGATGAACTTTTACAACTAGACTGGTTCAACTCTGTCTGTGGGAAAATTGAAGATAAGTTCATAAACTTATCTAAGGACTTGGTGTCCGAAAATGACAAGCTGTCTAAAGAGATTAATTCAATGAAATCTCAGATCGCATCAATGAACACTATGATCAGTCAGATGTTTCAAACGCAACGGCAACTTTTATCTTATCAAGTTAATTATCCTGCATCGGTTATGAATAACCAAATATCAAACTATTCCAACCAACAAATAAGTGGTCAGCATAATTTATCTTCTAATGATAACAATAATGTTGGCGTAAATAGTATGATTAATGCAAACAACGTCCGTATGGCCGTAACTGCAGAAGGTCTGAATCCAAACACAAATGCAAATGCAAATACAAATACGTCATTAATGAATTCTGTGAATAACTACCGGAAAATACCAAATGAGAAAAGAAATATGTACCCCCAAGCAGCCATTAACTCCATCAAGCGAGTAAAGCTAGACGGAAAGGATATGTCCAATTTCAATAGCACTTCAAGAAGATTGTCTCAACCTCAACCACAATCTCCGTTGCAAATAGGGTCTCCTTTAGAAGCTTTATTGTCAAAACCAATGCCGTCTCCAAAGATTACGGTTGCTATGTTGAACAACTCTGTAGCCTCTCCACCTCCTAACCCACTAACAATGTCGCCTTTACCCTCTATTTCCGAGCCTCTGGCTCTAGGAAATAATACCAACAACATACTTACCGAAGCGAATCAAACAAATATGAACGAAGGAAGCGCACCTGCATTAAATCCAATAGAAAAGAGAAGCAATCTCAGAAATAGCACGGCTTCAAAAAGTGACTCAACAGAGGGAGAGGATGATAGTTATCGAAATGAGAATGATGAATCGGAGGGATCAAAAGCGCTTGTTAGGCGAAACAGTAAAAACAAGAGAAGTGGAAATCCGAATAGAGATATTAAATATAAACTTTCTCGTGATAATAAAACCATTTGGGACTTGTACAATGAATGGTATCATGGACTAAATGGCAAACTTTCCATCAAAGAACTTATCGAAAAGTACGGATATAGACGTTGGAAGGTAGCTGAAGATTCCCACTTTTTTCCTACAAGAAGGGTTATCATCGATTACATCGAAACTGAAATCGACAGAAGCTTGAACTTGAATAGGTTTGACAAAAATAGCCCTCTTATTAACGATAGAACAGCTTTAAGAAAGCAAATTGTAAAGGACTTGGAAACATTTAGAGAAGATAACGGTTTGACCTTGAATTCACTATCTTTGTATTTCCGGAATTTGACAAGATGGGGCAAAGAAATCTGTATATATAATAACTTTAATGACTGGTCGCTAGTGACAATGAGCGATGAGGATAAAATCAAATTCTGCAAACGGAAAATGTTATCGACTAAAGAAACCAGAGAAGATAATTACTCGCAAGATGATAATGAATAA
2.KmGCR1基因敲除、超表达、KmGcr1p中Q-rich基序的敲除
为了验证KmGCR1基因、KmGcr1p中Q-rich基序在马克斯克鲁维酵母高温乙醇发酵中的作用,本发明中对KM-0菌株中的KmGCR1基因、KmGcr1p中Q-rich基序进行敲除。
KmGCR1基因敲除载体见图2所示。以KmGCR1基因的序列为模板,设计引物扩增该基因的同源臂,即5’arm和3’arm。将扩增得到的两个同源臂分别置于NAT抗性表达框的上游和下游,将同源臂与抗性基因一起插入PMD-19T载体,完成敲除载体的构建。设计引物时,选择合适的酶切位点添加至引物的5’-端,用于后续的酶切连接。构建过程中所用引物如表1所示。
表1用于构建KmGCR1基因敲除载体所用引物
引物名称 引物序列(5’-3’)
Pmd-3arm CTGAAATCGACAGAAGCTTG<u>CTGCAG</u>GCATGCAAGCTTGG(PstI)
Pmd-5arm TTCGATGCAGACGAACTTCA<u>GGTACC</u>GAGCTCGAATTCAC(KpnI)
5arm-pmd GAATTCGAGCTCGGTACCCGGTGAAGTTCGTCTGCATCG
5arm-nat GGCAATAACACACAGCATGCACTGGTTCCAGTCATCAGAC
nat-5arm GTCTGATGACTGGAACCAGTGCATGCTGTGTGTTATTGCC
nat-3arm GTTGTTCAACATAGCAACCGTAACTAGTCTATGGCTAGCTAGC
3arm-nat GCTAGCTAGCCATAGACTAGTTACGGTTGCTATGTTGAACAACTC
3arm-pmd CCAAGCTTGCATGCCTGCAGCAAGCTTCTGTCGATTTCAG
注:表中下划线部分为酶切位点。
敲除载体构建成功后,用电转法对KM-0菌株进行酵母转化。得到了KmGCR1基因部分敲除菌株Pkgcr1-4、KmGCR1基因完全敲除菌株Ckgcr1-81。完全敲除菌株Ckgcr1-81是在以甘油和酸作为碳源的YPGL培养基中筛选获得的,实验证明Ckgcr1-81失去了在发酵碳源上生长的能力。
KmGcr1p的超表达和Q-rich基序的敲除过程如图3所示,将KmGCR1基因和去除编码Q-rich基序序列的KmGCR1基因分别连入本实验已有的表达载体pMD-rDNA-G418中,得到表达载体pMD-rDNA-G418-KmGCR1与pMD-rDNA-G418-KmGCR1ΔQ。表达载体pMD-rDNA-G418构建成功后对KM-0进行转化,pMD-rDNA-G418-KmGCR1ΔQ载体构建成功后对Ckgcr1-81进行转化,分别得到KmGcr1p超表达转化子Egcr1-9和Q-rich基序的敲除转化子ΔQgcr1-3。构建过程中所用引物和对转化子进行PCR验证所用引物如表2所示。
表2构建KmGcr1p超表达载体和Q-rich基序敲除载体所用引物
Figure BDA0002642109400000091
Figure BDA0002642109400000101
注:表中下划线部分为酶切位点
上述实验中,对转化子的PCR验证结果如图4所示。其中A图是对KmGCR1基因敲除转化子的验证结果,所用引物为5arm-pmd和3arm-pmd。B图是对转化子Ckgcr1-81、Egcr1-9、ΔQgcr1-3的验证结果,所用引物为polyQs和polyQa。
3.转化子生长速率、菊粉酶活力、甘油海藻糖产量、细胞耐热性、高温乙醇产量的测定
菌株的生长速率、底物利用率、耐热能力、对环境压力的抵御能力都会影响酵母细胞的高温乙醇发酵能力。为了验证KmGCR1基因、KmGcr1p中Q-rich基序在马克斯克鲁维酵母高温乙醇发酵中的作用,本实施例在不同转化子中对上述参数进行了测定。
4.3.1转化子生长速率测定
在28℃条件下,每隔4小时对KM-0、ΔQgcr1-3、Pkgcr1-4、Pkgcr1-81和Egcr1-9菌株在OD600nm条件下的吸光值进行测定,绘制生长曲线,如图5所示。相比于原始菌株KM-0,KmGcr1p的部分敲除以及Q-rich重复基序的缺失都能造成细胞生长变缓,超表达菌株Egcr1-9的生长速率得到略微提升。同时也进一步验证了完全敲除菌株Pkgcr1-81确实丧失了利用葡萄糖等发酵碳源的能力,所以本发明是利用部分敲除菌株和Q-rich重复基序敲除菌株来代替完全敲除菌株研究KmGcr1p的作用。
4.3.2转化子菊粉酶活力测定
将KM-0、ΔQgcr1-3、Pkgcr1-4和Egcr1-9菌株接入菊粉发酵培养基,摇瓶培养60h后测量菊粉酶活力。结果如图6所示,与原始菌株KM-0(120.46U/ml)相比,ΔQgcr1-3、Pkgcr1-4菊粉酶活力分别下降了36.2%和48.6%,达到76.78U/ml和61.85U/ml;Egcr1-9菌株菊粉酶活力为170.16U/ml,提高了41.25%。
4.3.3转化子耐热能力测定
将KM-0、ΔQgcr1-3、Pkgcr1-4和包括Egcr1-9在内的3株超表达菌株进行了平板耐热实验,将平板分别倒置于28℃、40℃、45℃、48℃、50℃条件下培养16小时后观察并拍照。结果如图7所示,不同菌株在28℃下的生长情况一致,无明显区别。但在高温条件下,相比于原始菌株,ΔQgcr1-3、Pkgcr1-4菌株的生长态势变差,并且这种趋势随着温度的逐渐升高而越发明显。而超表达菌株Egcr1-9等在高温下的生长状况相比于原始菌株KM-0并没有出现明显优势。之所以出现这种的原因是,K.marxianus本身就具有强耐热性,其细胞耐热能力的再提升,对胞内诸多催化酶、结构蛋白、细胞膜与细胞骨架的稳定性都是一种挑战。Henderson指出,酵母细胞膜中,有几种脂质的组成是呈温度依赖性的。所以高温可以改变细胞膜的组分从而影响细胞膜的透过性和发生在细胞膜上的生化反应;Qiu指出,温度过高的培养环境会对细胞壁的结构造成破坏,使其几丁质和β-1,3-葡聚糖的结构发生改变。所以很难使K.marxianus的耐热性在原本强耐热的基础上得到进一步提升。
4.3.4转化子抗逆物质甘油、海藻糖合成能力测定
在乙醇发酵过程中,微生物面临高渗、高温、有机酸和氧胁迫等种种压力。甘油和海藻糖是酵母常见的抗逆物质,可以减少发酵过程中的不良环境环境对细胞带来的破坏。甘油是一种专一性保护剂,可以减少发酵过程中的氧胁迫压力;而海藻糖是一种多功能的保护剂,对提高酵母细胞的耐热性、耐氧胁迫能力、耐高渗能力都有作用。本实施例测定了KM-0、ΔQgcr1-3、Pkgcr1-4和Egcr1-9菌株在28℃、48℃条件下的甘油海藻糖合成能力,结果如图8和图9所示。
不同菌株在28℃震荡培养的条件下,海藻糖的产量较为接近,无明显差异。但在48℃的高温条件下,相对于原始菌株的10.76μg/mg,超表达菌株Egcr1-9的海藻糖产量上升24.5%,达到13.4μg/mg;而部分敲除菌株kgcr1-4和Q-rich重复基序敲除菌株ΔQgcr1-3的产量分别下降22.21%和17.43%。
不同菌株在28℃震荡培养的条件下,甘油的产量较为接近,无明显差异。但在48℃条件下,相比于原始菌株的295μg/mg,超表达菌株Egcr1-9的甘油产量上升29.15%,达到381μg/mg;而部分敲除菌株kgcr1-4和Q-rich重复基序敲除菌株ΔQgcr1-3的产量分别下降36.61%和36.27%。
4.3.5转化子高温乙醇产量测定
对以上参数进行测定后,实验结果表明:KmGcr1p及其Q-rich重复基序可以在菌体生长、抗逆物质甘油和海藻糖合成中发挥促进作用;KmGcr1p对菊粉酶基因的表达具有转录激活作用,可以提高底物利用率,Q-rich重复基序对维持KmGcr1p的转录激活作用具有重要意义;同时KmGcr1p及其Q-rich重复基序是菌株保持高耐热性所必须的。KmGcr1p及其Q-rich重复基序可能通过影响马克斯克鲁维菌株的生长速率、底物利用率、耐热能力、对环境压力的抵御能力来影响它的高温乙醇发酵能力。
有了上述理论支持后,本发明测定了转化子在42℃、菊粉浓度为150g/L条件下的高温乙醇产量。结果如图10所示:原始菌株KM-0发酵3天后的乙醇产量为32.75g/L;Pkgcr1-4相比于原始菌株的乙醇产量下降了50%,产量为16.36g/L;ΔQgcr1-3菌株相比于原始菌株的乙醇产量下降了65%,产量为11.49g/L;超表达菌株Egcr1-9的产量达到了35.15g/L,相对于KM-0菌株提升了7.32%。
随后本发明在高温乙醇发酵条件下对不同菌株的总RNA进行提取,通过荧光定量实验计算得到了各菌株中乙醇发酵相关基因的表达量,结果如表3所示。相对于KM-0菌株,在菌株Egcr1-9中,大部分乙醇发酵相关基因的表达水平是上升的,而这些基因的表达水平在菌株ΔQgcr1-3和Pkgcr1-4中是下降的。这一实验现象从表达水平验证了高温乙醇发酵的实验结果,KmGcr1p可以转录激活糖酵解基因的表达,Q-rich重复基序对维持KmGcr1p的转录激活作用具有重要意义。例如HXK基因、TDH基因、PDC基因、ADH1基因在Egcr1-9菌株的表达量分别上升了25.17%、128.3%、18.6%和130.21%,在Pkgcr1-4菌株中分别下降了74.24%、9.14%、35.42%、和66.49%,在ΔQgcr1-3菌株中分别下降了78.93%、12.15%、16.11%和82.51%。
表3转化子的基因表达量分析
Figure BDA0002642109400000121
Figure BDA0002642109400000131
注:*表示基因表达水平相对于原始KM-0菌株差异性显著;**表示差异性极显著。
4.KmGCR2基因克隆与分析
通过上述实验发现,超表达KmGCR1基因可以提高马克斯克鲁维酵母高温乙醇发酵能力,但是提高幅度较小,只提高了7.32%。为了筛选出可以在40℃以上利用非粮食作物高产乙醇的马克斯克鲁维酵母,本实施例在菌株Egcr1-9的基础上进行了KmGCR1、KmGCR2基因的同时超表达。首先本实施例对KmGCR2基因(碱基序列如SEQ ID NO:2所示)克隆与分析,结果如图11所示。KmGCR2基因序列长1131bp,编码376个氨基酸,有3个保守区域,C端的保守结构中含有KmGcr2p与KmGcr1p结合所必须的亮氨酸拉链,中间部分的保守结构域可能提供了KmGcr2p在细胞核中定位的信号,N端保守结构域的功能目前还未见报道。
N端的保守结构用红色框标注,中间的保守结构用蓝色标注,C端的亮氨酸保守结构用黑色下划线表示。
KmGCR2基因:
ATGTCTGAGATAGGAAGTACTGAACATAGTAGTCCTACCGGTATTATGCACCATCAAGGAAAACTCGATGTATTTTTAATTAGAGGATACCAGCTGATATCGAATGGCGAGGTATTGAATCTATCCGAGTTGTTGAGCAGCTCGATCAATGCGAACCAGCAATCTCCAATATCGATGAAACGGTTGGACAATAGACATTTGGAGTATTTCCAGAAACTCTCACAATTGTACAACGCACTAGTGTCTGTGGTACCGTTGGATGAGCAATCAAGCGTGCCGAAATCGAACATAGAGCTCTTCCAGAGGTTTCAGCAGATCTTGAAGGAGATTCTTCTCAGCTATGAGGAGAGCCCTTACAACCGGTACTTTTTAAGGTTGGACGAGCAAAGTTGGAAGATCAGGGACGATGTAGAGGACCCATTGTGGCAGATCCTTACGTTGAATATTGATAAGGTCTACGATAGGAAAACCGGAACAATTGGTCCTTTGCGCCAACGTAAAAGCACGACAACCTCCGCAAGGGAATCACCTGTGTTGGCCCCGCGAAGAAAATCTGCCATCACGTCACCGGGTTTCACACTAGCACAAGTAGACAACAAACTAGAGCAAGTGGGGCGTGGACAAGACCAAGACTACTATACAAATATACAAACAAGCGCACACCATACGCCCAATGGTCAATTTGAGTGGCCCAGTGCCATGGCAATCAGTAACAACGTAAGCAAAATCATAGAAAAGTCCAACTCCGAGGGCCAAACGACGAGAAAAAGGCCAAGAATATACGGAGATGTAAACTCGAGAGAAGAAGAAGTCGTCGAAGAGTTGCTACAACTCAGGAACCCGCAGGGCACCAACCATTCCCAACCTACATCAACAGCTACCGCACCACCAACAGTAGCCCCCATGAATTCCCTCGAGGATAGTCACCAAAAAAAGGGACAGCAGCATACAACTCCCGACGTAACAATAAGTGCCTACGAACGGCTACTCAAAGAAAAAGATCAGCGTATATCGATACTTCAAAATGACTTGGAGCAGCAACGTAAAGAAATTATCTGGTTAAAGAAGCTTTTAATGGAAGACATGAAGTACCTGCGCTCATCCTTAAGCGCAAACACCAACAATCGCTGA
5.KmGCR1、KmGCR2基因同时超表达
将KmGCR2基因连入本实验已有的表达载pMD-rDNA-NAT中,得到表达载体pMD-rDNA-NAT-KmGCR2。载体构建成功后对Egcr1-9菌株进行转化,得到转化子Ogcr1+2。构建过程及构建所用引物和对转化子进行PCR验证所用引物分别如图12和表4所示,转化子PCR验证结果如图13所示。
表4 KmGCR2基因超表达载体构建引物和转化子PCR验证引物
引物名称 引物序列(5’-3’)
GCR2Pst AA<u>CTGCAG</u>TGAAGCTCTTGTCTTTTCCTCTT(PstI)
GCR2BamH CG<u>GGATCC</u>TCAGCGATTGTTGGTGTTTGC(BamHI)
NATs ATGACCACTTTGGACGATACCGC
NATa TGGACATGGCATGGACATGTAC
注:下划线为酶切位点。
6.转化子高温乙醇产量测定
本发明比较了KM-0、Egcr1-9、Ogcr1+2菌株在42℃、菊粉浓度为150g/L条件下的高温乙醇产量。结果如图14所示:将KmGCR1和KmGCR2基因同时超表达后,高温乙醇产量达到41.75g/L。相比于Egcr1-9菌株与KM-0菌株分别提高了18.77%和27.48%。
随后本发明在高温乙醇发酵条件下对上述菌株的总RNA进行提取,通过荧光定量实验计算得到了各菌株中乙醇发酵相关基因的表达量,结果如表4所示。相对于菌株Egcr1-9而言,Ogcr1+2菌株中流向乙醇发酵的相关糖酵解基因的表达量得到了更为显著的提升。从表达水平进一步认证了在超表达KmGcr1p的基础上同时超表达KmGcr2p可以进一步激活糖酵解作用,使KM-0菌株的高温乙醇产量得到进一步提高。例如与菌株Egcr1-9相比,HXK基因、TPI1基因、PYK1基因、ADH1基因表达量在Ogcr1+2菌株中分别提升了21.6%、22.66%、20%和26.52%。
表4转化子的基因表达量分析
Figure BDA0002642109400000151
注:*表示基因表达水平相对于原始KM-0菌株差异性显著;**表示差异性极显著。
Yu将胡萝卜渣用果胶酶处理后,用K.marxianus菌株进行42℃条件下的乙醇发酵,产量最高可达到37g/L。Tomas利用农业废弃物小麦秸秆为原料,通过K.marxianus CECT-10875菌株进行42℃乙醇发酵,乙醇产量为36.2g/L。Sivarathnakumar将农业废弃物预处理后,利用K.marxianus进行41℃高温乙醇发酵,乙醇浓度可达到21.45g/L。综上所述,在超表达KmGcr1p的基础上同时超表达KmGcr2p可以显著提高KmGcr1p的转录活性,进一步激活糖酵解作用以及目标基因的表达,使KM-0菌株的高温乙醇产量在马克斯克鲁维酵母中达到较高水平,是筛选出可以在40℃以上利用非粮食作物高产乙醇的马克斯克鲁维酵母的可选策略。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国海洋大学
<120> 马克斯克鲁维酵母工程菌株及其制备方法和生产乙醇的方法
<130> MP2014738
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2439
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggacaaag acaatttgaa tatcaatttg caggactggc ttaatgaccc gatgttagcg 60
gcgcagctaa accgtcctca gtctgccacg ccgacaatat acaacggtat cgatggttcg 120
aataccaatg gggctgtggt acaaacgcaa caacaatcgg accagcagca gcaacagcag 180
cagcagcagc aggaacaaca acaacagcaa cagcaacaga ttcaaataca agtccaacag 240
caacaacagg aacaacagaa taagaatgca gcaggaaaat ctgtagacca agcatctaca 300
tcggagctct ctagcttttt aatgaactcg aggctcaact tgggaacttt gatgaagttc 360
gtctgcatcg aattcttcaa gtgtaataag gacgagctag ctaatcttcg gttaattgac 420
ttgactcaag attccacctt ccctcaaact cttactctca gaaatatgca aacggaaaat 480
tcgcattaca agttcttcaa caccatcaat cgggacaaat ttattaccag ttgtcctgtc 540
ttcgcagtag cactctactc ctttatcaca tggaaacata cagccatctc ttggaaaaat 600
ttcgtcaatt taccgctaat attcgattca aaagacatca taatgcttca aggtaatagc 660
caaaatcgag cgcctgtata taccaataag attgtaagga tatcggtatc tccaaagaag 720
gaattactct gctacgtgtt cccttggtta cctgcattag aaagagatta cttgagtcat 780
gatagatcaa actacatcct cttctcgcta gtagaattat tcaatttttt ggctaaagtc 840
atacttcaag actttgcctt cctacaatgc acgggtcaac tacctcactt gcaagagttg 900
atcaaatctg aattggggtg gcagttttta gagtctgatg actggaacca gttcaaggat 960
gaaatgcaac ggcatattga tgatgaactt ttacaactag actggttcaa ctctgtctgt 1020
gggaaaattg aagataagtt cataaactta tctaaggact tggtgtccga aaatgacaag 1080
ctgtctaaag agattaattc aatgaaatct cagatcgcat caatgaacac tatgatcagt 1140
cagatgtttc aaacgcaacg gcaactttta tcttatcaag ttaattatcc tgcatcggtt 1200
atgaataacc aaatatcaaa ctattccaac caacaaataa gtggtcagca taatttatct 1260
tctaatgata acaataatgt tggcgtaaat agtatgatta atgcaaacaa cgtccgtatg 1320
gccgtaactg cagaaggtct gaatccaaac acaaatgcaa atgcaaatac aaatacgtca 1380
ttaatgaatt ctgtgaataa ctaccggaaa ataccaaatg agaaaagaaa tatgtacccc 1440
caagcagcca ttaactccat caagcgagta aagctagacg gaaaggatat gtccaatttc 1500
aatagcactt caagaagatt gtctcaacct caaccacaat ctccgttgca aatagggtct 1560
cctttagaag ctttattgtc aaaaccaatg ccgtctccaa agattacggt tgctatgttg 1620
aacaactctg tagcctctcc acctcctaac ccactaacaa tgtcgccttt accctctatt 1680
tccgagcctc tggctctagg aaataatacc aacaacatac ttaccgaagc gaatcaaaca 1740
aatatgaacg aaggaagcgc acctgcatta aatccaatag aaaagagaag caatctcaga 1800
aatagcacgg cttcaaaaag tgactcaaca gagggagagg atgatagtta tcgaaatgag 1860
aatgatgaat cggagggatc aaaagcgctt gttaggcgaa acagtaaaaa caagagaagt 1920
ggaaatccga atagagatat taaatataaa ctttctcgtg ataataaaac catttgggac 1980
ttgtacaatg aatggtatca tggactaaat ggcaaacttt ccatcaaaga acttatcgaa 2040
aagtacggat atagacgttg gaaggtagct gaagattccc acttttttcc tacaagaagg 2100
gttatcatcg attacatcga aactgaaatc gacagaagct tgaacttgaa taggtttgac 2160
aaaaatagcc ctcttattaa cgatagaaca gctttaagaa agcaaattgt aaaggacttg 2220
gaaacattta gagaagataa cggtttgacc ttgaattcac tatctttgta tttccggaat 2280
ttgacaagat ggggcaaaga aatctgtata tataataact ttaatgactg gtcgctagtg 2340
acaatgagcg atgaggataa aatcaaattc tgcaaacgga aaatgttatc gactaaagaa 2400
accagagaag ataattactc gcaagatgat aatgaataa 2439
<210> 2
<211> 1131
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgtctgaga taggaagtac tgaacatagt agtcctaccg gtattatgca ccatcaagga 60
aaactcgatg tatttttaat tagaggatac cagctgatat cgaatggcga ggtattgaat 120
ctatccgagt tgttgagcag ctcgatcaat gcgaaccagc aatctccaat atcgatgaaa 180
cggttggaca atagacattt ggagtatttc cagaaactct cacaattgta caacgcacta 240
gtgtctgtgg taccgttgga tgagcaatca agcgtgccga aatcgaacat agagctcttc 300
cagaggtttc agcagatctt gaaggagatt cttctcagct atgaggagag cccttacaac 360
cggtactttt taaggttgga cgagcaaagt tggaagatca gggacgatgt agaggaccca 420
ttgtggcaga tccttacgtt gaatattgat aaggtctacg ataggaaaac cggaacaatt 480
ggtcctttgc gccaacgtaa aagcacgaca acctccgcaa gggaatcacc tgtgttggcc 540
ccgcgaagaa aatctgccat cacgtcaccg ggtttcacac tagcacaagt agacaacaaa 600
ctagagcaag tggggcgtgg acaagaccaa gactactata caaatataca aacaagcgca 660
caccatacgc ccaatggtca atttgagtgg cccagtgcca tggcaatcag taacaacgta 720
agcaaaatca tagaaaagtc caactccgag ggccaaacga cgagaaaaag gccaagaata 780
tacggagatg taaactcgag agaagaagaa gtcgtcgaag agttgctaca actcaggaac 840
ccgcagggca ccaaccattc ccaacctaca tcaacagcta ccgcaccacc aacagtagcc 900
cccatgaatt ccctcgagga tagtcaccaa aaaaagggac agcagcatac aactcccgac 960
gtaacaataa gtgcctacga acggctactc aaagaaaaag atcagcgtat atcgatactt 1020
caaaatgact tggagcagca acgtaaagaa attatctggt taaagaagct tttaatggaa 1080
gacatgaagt acctgcgctc atccttaagc gcaaacacca acaatcgctg a 1131

Claims (9)

1.一种马克斯克鲁维酵母工程菌株,其特征在于,所述马克斯克鲁维酵母工程菌株为转入KmGCR1基因和KmGCR2基因的马克斯克鲁维酵母。
2.根据权利要求1所述的马克斯克鲁维酵母工程菌株,其特征在于,所述KmGCR1基因的碱基序列如SEQ ID NO:1所示,或者所述KmGCR1基因的碱基序列为在SEQ ID NO:1所示碱基序列基础上插入、缺失、替换一个或多个碱基、功能维持不变的碱基序列。
3.根据权利要求1所述的马克斯克鲁维酵母工程菌株,其特征在于,所述KmGCR2基因的碱基序列如SEQ ID NO:2所示,或者所述KmGCR2基因的碱基序列为在SEQ ID NO:2所示碱基序列基础上插入、缺失、替换一个或多个碱基、功能维持不变的碱基序列。
4.根据权利要求1所述的马克斯克鲁维酵母工程菌株,其特征在于,所述马克斯克鲁维酵母工程菌株的起始改造菌株为K.marxianus KM-0菌株。
5.如权利要求1至4中任一项所述马克斯克鲁维酵母工程菌株的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
将KmGCR1基因连入表达载体中,得到含有KmGCR1基因的表达载体;
将含有KmGCR1基因的表达载体转化入起始改造菌株,得到超表达转化子;
将KmGCR2基因连入表达载体中,得到含有KmGCR2基因的表达载体;
将含有KmGCR2基因的表达载体转化入所述超表达转化子,得到马克斯克鲁维酵母工程菌株。
6.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,所述表达载体为pMD-rDNA-G418或pMD-rDNA-NAT。
7.一种生产乙醇的方法,其特征在于,包括:以菊粉为底物,采用权利要求1至4中任一项所述马克斯克鲁维酵母工程菌株进行发酵培养生产乙醇。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,所述发酵培养的温度为40~48℃。
9.根据权利要求7或8所述的方法,其特征在于,所述发酵培养的菊粉浓度为50~300g/L。
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