CN102286599A - 多菌种发酵生产红枣营养有机酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种多菌种发酵生产红枣营养有机酸的方法，属于利用红枣发酵生产有机酸的技术领域，所要解决的问题是提供一种利用红枣为主要原料，用多菌种发酵生产有机酸的方法，采用的方案为：多菌种发酵生产红枣营养有机酸的方法，按照以下步骤进行：先制备枣浆，将枣浆糖含量调至150g/L—200g/L；然后加入米曲霉、黑曲霉双菌等一次发酵原料共酵制备一次红枣营养有机酸；最后，一次红枣营养有机酸中加入乳酸菌等二次发酵原料进行二次发酵制备红枣营养有机酸；本发明可广泛应用到红枣为原料制备有机酸的领域中。

Description

多菌种发酵生产红枣营养有机酸的方法

技术领域

本发明多菌种发酵生产红枣营养有机酸的方法，属于利用红枣发酵生产有机酸的技术领域。

背景技术

微生物发酵法生产有机酸，以代替从水果和蔬菜等植物中提取有机酸，是近年来由于社会及市场的需要而开发出的方法。由于食品、医药、化学合成等工业的发展，有机酸需求骤增。

有机酸发酵工业已经成为生物工程领域中的一个至关重要且较为成熟的分支，在世界经济发展中，占有一定的地位。有机酸在传统发酵食品中早已得到广泛应用。以微生物发酵法生产且达工业生产规模的产品已达十几种。

我国是世界上最早利用和发酵生产有机酸的国家之一，由于有机酸发酵是生物体内的基本代谢过程，又和人民群众的生活密切相关，近40年来，有机酸工业从无到有，尤其是近20年出现了蓬勃发展的趋势。

有机酸在医药、食品工业等领域有着广泛的用途，近年来，该类产品在国际市场上呈持续增长、产销两旺之势。有机酸种类繁多，作为代表性的有柠檬酸、乳酸、苹果酸、抗坏血酸（即Vc）、醋酸、葡萄糖酸等，除具有各自的酸味特征外，大多具有不同的生理保健功能，经过将不同有机酸复配，可以达到更理想的酸味品质和保健功效。

柠檬酸和乳酸系列产品已进入国际市场，从质量及产量两方面皆具有较强的市场竞争能力；苹果酸和衣康酸已进入市场开发和大规模生产；葡萄糖酸的发酵生产已进入成熟阶段；其他新型有机酸产品的研究开发正受到国家和相关企业的高度重视、新产品和新用途将会层出不穷。

综上所述，随着有机酸新用途不断被发现，今后以柠檬酸为首的国际有机酸市场将呈不断增长之势，其市场前景令人乐观。

我国枣树种植面积不断扩大，红枣的产量大幅度提高。但由于鲜枣含有约70%的水分，不易保存，不易运输，据近十年资料统计，鲜枣每年因腐烂损失的数量高达20%～30%。因此，红枣的加工尤为重要。

红枣营养丰富，具有很高的滋补作用和药用价值。传统加工往往只注重色泽、风味及外观形状，这种传统加工方法使红枣产业在原料输出和粗加工的道路上徘徊，难以发挥红枣作为一种优良营养、保健、药用资源应有的作用，而对有效营养成分的最大限度保存及相应加工方法与工艺改进研究与实践不多，特别是利用高新技术对红枣中的有效因子提取还是空白，制约了资源丰富的红枣生产的产业化和有效开发利用。

目前的红枣加工主要将红枣制成干枣、蜜枣、乌枣、酒枣、枣蓉、枣泥、枣糕、枣酒、枣茶、枣饮料、枣醋等，这些产品工艺简单，设备简陋，大多数属作坊式生产，技术含量低，附加值不高。例如红枣的干制主要是采用风吹日晒的自然干制和常规热风干制方法，由于工作时间长，受温度和氧化的双重影响，成品枣颜色深、有苦味、焦味、复水性差，营养物质损失也很严重。又如蜜枣加工过程中的分级划线、糖煮、烘烤等主要工序，传统的生产方式既难以有效控制质量，加工时间又太长，生产效率低，由于产品含糖量高，市场呈逐渐萎缩态势

因此，为适应市场不同消费者的口味需求、提高产品的市场竞争力和附加值，就必须根据枣的成分特点和营养组成，充分发掘枣产品的营养功能，改进传统的加工方式，利用高新技术手段提高枣产品加工的生产效率和质量控制水平，走营养型、功能性、通用性食品的开发之路。

红枣的加工，除以上所述外，还有两大突出的问题，使红枣加工的进一步深入研究显得迫切和必要。

一是残次枣问题。目前红枣加工中，残次枣及下脚料问题突出。一般制干枣、鲜枣等枣加工产品，选用的是等级以上枣，蜜枣加工中去核工序产生大量带有果肉的枣核，这些枣及加工下脚料，或者作为饲料利用，或者干脆白白浪费掉，每年这部分原料约占红枣总量的20～30%，如果不能充分利用，直接影响到红枣产业的经济效益。

二是裂果问题。近年来，裂果问题在枣业中的危害越来越突出，与枣疯病、缩果病一起，成为威胁枣业发展的三大灾害。正常年裂果损失在20%左右，遇成熟期下雨，裂果现象更加严重，2003年和2007年，沿黄枣区因成熟期遇连阴雨造成整个枣区90%以上的裂果腐烂，损失惊人。如果能将裂果及时进行加工，会减少损失的发生。

以上两个突出的问题，使残次枣、枣加工下脚料、裂果枣的加工利用成为摆在枣业科研人员面前的迫切的、重要的课题，有待重拳攻克。

发明内容

本发明克服现有技术的不足，所要解决的问题是提供一种利用红枣为主要原料，用多菌种发酵生产有机酸的方法。

为了解决上述问题，本发明采用的方案为：多菌种发酵生产红枣营养有机酸的方法，按照以下步骤进行：

第一步，制备枣浆，将枣浆糖含量调至150g/L—200g/L；

第二步，一次发酵：

先分别发酵制备一级米曲霉种子、一级黑曲霉种子、一级乳酸杆菌种子；

接着分别用摇瓶发酵所述的一级米曲霉种子、一级黑曲霉种子、一级乳酸杆菌种子制备二级米曲霉种子、二级黑曲霉种子、二级乳酸杆菌种子；

按以下重量份配置一次发酵原料，并加入到发酵罐中，发酵温度在28-36℃，发酵液pH为5-7，搅拌速度150-300 r/min，发酵时间50-100h，即得一次红枣营养有机酸；

一次发酵原料：枣浆为1000份，黄豆粉为20-50份，CaCO₃为50-100份，二级黑曲霉种子为3-8份，二级米曲霉种子为4-12份。

所述的一次红枣营养有机酸中加入二次发酵原料进行二次发酵，发酵温度在45-55℃，静止发酵时间60-80h，即得二次发酵后的红枣营养有机酸；

二次发酵原料的重量份如下：一次红枣营养有机酸为1000份，黄豆粉为8-15份，CaCO₃为10-30份，二级乳酸菌种子为4-10份。

所述一次发酵原料的重量份：枣浆为1000份，黄豆粉为30-40份，CaCO₃为70-80份，二级黑曲霉种子为6-7份，二级米曲霉种子为8-10份。

所述二次发酵原料的重量份如下：一次红枣营养有机酸为1000份，黄豆粉为10-12份，CaCO₃为20-25份，二级乳酸菌种子为6-8份。

所述方法还包括在所述一次发酵后的红枣营养有机酸和/或二次发酵后的红枣营养有机酸经过过滤、酸化除硫酸钙、活性炭脱色脱糖、超滤处理得红枣营养有机酸。

所述的一次发酵分为以下三个阶段：

第一阶段，发酵开始至20-28小时，无菌空气流量0.1-1m³/min，维持温度29±1℃之间；

第二阶段，第一阶段结束至60小时，升温至33±3℃，无菌空气通气量为0.1-0.3 m³/min；

第三阶段，第二阶段结束至100小时，温度维持在33±3℃，无菌空气通气量为0.2-0.5 m³/min。

活性炭脱色脱糖步骤中，活性炭添加量为进行脱色脱糖混合物总重量的5-8%，吸附作用时间1.5-2.5h，吸附温度45-55℃，搅拌速度100-120rpm，pH为5.5-6.5。

本发明与现有技术相比具有以下有益效果：

双菌共同一次发酵分为以下三个阶段：

第一阶段，发酵开始至20-28小时，无菌空气流量0.1-1m³/min，维持温度29±1℃之间，此阶段为黑曲霉发酵生成葡萄糖酸的主要时期，该过程是好氧发酵。黑曲霉在较高的糖度条件下，糖酸转化率高。此时米曲霉处于生长期，也需要大量的氧气；第二阶段，第一阶段结束至60小时，升温至33±3℃，无菌空气通气量为0.1-0.3 m³/min，高温、低氧抑制了黑曲霉发酵，但有利于米曲霉发酵生成L-苹果酸的累积。且此时发酵液中的糖度有利于L-苹果酸发酵。进入米曲霉产酸阶段，CO₂固定反应的无氧代谢途径起主要作用,对氧的需求大大下降； 

第三阶段，第二阶段结束至100小时，温度维持在33±3℃，无菌空气通气量为0.2-0.5 m³/min；菌丝需氧呈现回升，这是经过一段时间的耗损，菌丝体需要能量及代谢的中间物质维持一定的生长以得到修复。此阶段为中等需氧阶段， 96h后，发酵液中的糖含量约为30 g/L，产酸基本停止，结束共发酵。

整个一次发酵过程，需通过添加碳酸钙维持发酵液pH在5.8-6.2范围内。在糖质原料直接发酵生产L-苹果酸时，培养基中碳酸钙的存在是L-苹果酸有效积累的必要条件，碳酸钙的作用一是作为中和剂中和代谢生成的L-苹果酸形成L-苹果酸钙，维持相对稳定的pH值，保证发酵的正常进行，二是形成的L-苹果酸与碳酸钙反应放出CO₂，为CO₂固定支路提供CO₂，促进L-苹果酸的积累。

乳酸菌发酵：共酵结束，升温至50℃，接种5%乳酸菌种子悬液，发酵时间约12小时。此时黑曲霉和米曲霉基本停止代谢，主要进行乳酸发酵。乳酸发酵为厌氧发酵，为使发酵液均匀，防止碳酸钙沉淀，避免碳酸钙对细菌细胞产生包埋现象，发酵罐中进行间隙搅拌。发酵温度控制在50±5℃。发酵液中的糖含量约为5 g/L时，结束发酵。

发酵结束后，发酵液中葡萄糖酸的含量约为45 g/L，L-苹果酸的含量约为85 g/L， L-乳酸的含量约为20 g/L，产酸率为15.5%，转化率为86%，碳酸钙的添加总量约为100 g/L。 

双菌共酵及乳酸菌二次发酵说明：黑曲霉以产葡萄糖酸为主，作用底物以葡萄糖为主，发酵最适温度为28～30℃，与米曲霉相比较低，在较高糖度条件下产酸能力强，而且其酶系具有分解果胶的能力，分解果胶后，可降低粘度，提高糖度；米曲霉以产L-苹果酸为主，可利用葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、半乳糖、甘露糖等多种糖源，高糖浓度对其发酵产酸有抑制作用，最适发酵糖度为100～120g/L，发酵最适温度较高，为35±1℃。两个菌种对发酵醪pH条件的要求都在5.8～6.2之间。采取分段控制温度的方法，可以使两菌种协同作用，比单菌种发酵可提高原料利用率、提高产酸率、减少发酵时间、节约能源。

黑曲霉和米曲霉发酵结束后，还有约30g/L的残糖，为了进一步提高产酸率，同时乳酸在复合有机酸产品中，对于协调酸味、提高酸味品质有微妙作用，因此，又进行了乳酸菌发酵。

通过三种菌株的协同作用，适应红枣的糖分组成特点，糖分利用率高，产酸率高，产酸比例适宜，酸味品质好。

通过发明以红枣为主要原料利用黑曲霉和米曲霉两种菌种共同发酵生产含L-苹果酸、葡萄糖酸、乳酸、柠檬酸等的营养复合有机酸。 并有效提取和富集了红枣自有的抗坏血酸等有机酸，以及红枣中的环磷酸腺苷、多糖、黄酮、三萜酸、核苷酸等营养成分，与食品中常用的酸味剂柠檬酸相比，酸味更好，营养价值更高，都很有特色，产品具有首创性。

本发明采用双菌共酵，一般微生物制造，都是单菌种发酵，多菌种发酵很难考虑到各菌种的特点，反应参数参以确定和控制。本技术采用双菌共酵，充分研究了这两个菌种的特点，采取的工艺路线能够按照设计的线路和产品顺利进行，这点在多菌共酵上是个难点，也是个创新。另一方面，本发明采用二次发酵，既充分利用了残糖，又产生了新的有机酸乳酸，且产率较高， 而且原料中原有的有机酸和功能性成分也得到有效保留，营养价值是红枣营养成分和发酵有机酸的功能有效叠加，并相互作用，使其营养价值成倍递增。使复合有机酸的风味更好，品质更佳。

该项研究不仅为红枣深加工增加了新的品种，拓展了红枣产品的市场空间，而且充分利用残次枣，解决了原料的转化，为红枣产业创造了新的经济增长点。

红枣富含糖类物质，含糖量居各类果品之首，比制糖原料甘蔗、甜菜还高，可以利用红枣糖分通过微生物发酵生产附加值更高、市场前景更好的有机酸；同时红枣自身含有功能性有机酸如Vc和三萜酸等，其中Vc含量为所有栽培类水果之首，与发酵产生的有机酸组合，形成独具特色的复合有机酸；另外，红枣还含有环核苷酸、黄酮、多糖、皂苷等功能因子。采用多菌种混合发酵，以红枣为原料生产营养复合有机酸，不仅配比合理，酸味协调柔和，而且具有突出的营养保健功能。

以红枣为原料，特别是以残次枣（包括裂果及加工下脚料）生产有机酸，不仅使红枣中各种等级的原料得到充分的利用，原料来源丰富，生产成本低，而且产品安全性好，附加值高，经济效益好，同时红枣中原有的功能性成分在产品中得到保留和富集，使产品与单纯的有机酸产品相比，风味更好、品质更优、营养价值更高，市场更广阔。

具体实施方式

第一步：枣浆的制备

将干枣清洗、浸泡、破碎、去核制成枣浆，按试验所需调配成总糖含量150g/L—200g/L之间的枣浆液。

第二步：培养基的制备

   （1）米曲霉种子培养基

按重量份配置的豆饼粉为60份，蔗糖为20份，NaNO₃为3份，K₂HPO₄为1份，KCL为1份，MgSO₄·7H₂O为0.3份, FeSO₄·7H₂O为0.5份, 调pH值为6.0，于120℃，0.1 MPa的条件下湿热灭菌20min。接种量为总重量的3%-10%。

   （2）黑曲霉种子培养基

按重量份配置的葡萄糖为40份, 麸皮为32份, (NH₄)₂HPO₄为0.4份,  KH₂PO4为0.2份, MgSO₄·7H₂O 为0.2份,CaCO₃为10份, 调pH值为6.0,于120℃、0.1 MPa湿热灭菌20min。接种量为总重量的3%-10%。

   （3）乳酸杆菌种子培养基

按重量份配置的葡萄糖20份，蛋白脉10份，牛肉膏10份，酵母膏5份，乙酸钠5份，吐温为0.08份，柠檬酸二胺2份，K₂HPO₄ 2份，MgSO₄·7H2O 0.2份，MnSO₄为0.05份，调pH值为6.5,于120℃，0.1 MPa湿热灭菌20min。接种量为总重量的3%-10%。

 上述菌种培养基为最佳培养基，也可用常规培养基代替。

一次发酵：先分别发酵制备一级米曲霉种子、一级黑曲霉种子、一级乳酸杆菌种子；可按照上述最佳培养基制备，也可以按照常规培养基制备。

接着分别用摇瓶发酵所述的一级米曲霉种子、一级黑曲霉种子、一级乳酸杆菌种子制备二级米曲霉种子、二级黑曲霉种子、二级乳酸杆菌种子；

可采用摇瓶发酵培养基的二级菌种：按重量份配置的枣浆液为1000份, 黄豆粉为20份 , CaCO₃为60份 (单独灭菌)， 调PH值为6.0，于120℃，0.1 MPa的条件下湿热灭菌20min。接种量为总重量的3%-10%。

实施例1：按以下重量份配置一次发酵原料，并加入到发酵罐中，发酵温度在28-32℃，保持发酵液PH为5-6，搅拌速度300 r/min，发酵时间80h，即得一次红枣营养有机酸；

一次发酵原料：枣浆为1000份，黄豆粉为20份，CaCO₃为50份，二级黑曲霉种子为3份，二级米曲霉种子为4份。

在所得的一次红枣营养有机酸中加入二次发酵原料进行二次发酵，发酵温度在50-55℃，静止发酵时间80h，即得二次发酵后的红枣营养有机酸；

二次发酵原料的重量份如下：一次红枣营养有机酸为1000份，黄豆粉为8份，CaCO₃为10份，二级乳酸菌种子为4份。

     实施例2：

按以下重量份配置一次发酵原料，并加入到发酵罐中，发酵温度30-36℃，保持发酵液PH为6-7，搅拌速度180r/min，发酵时间65h，即得一次红枣营养有机酸；

一次发酵原料：枣浆为1000份，黄豆粉为50份，CaCO₃为100份，二级黑曲霉种子为8份，二级米曲霉种子为12份。

在所得的一次红枣营养有机酸中加入二次发酵原料进行二次发酵，发酵温度在45-50℃，静止发酵时间70h，即得二次发酵后的红枣营养有机酸；

二次发酵原料的重量份如下：一次红枣营养有机酸为1000份，黄豆粉为15份，CaCO₃为30份，二级乳酸菌种子为10份。

实施例3：

按以下重量份配置一次发酵原料，并加入到发酵罐中，发酵温度在30-33℃，保持发酵液PH为5-7，搅拌速度220 r/min，发酵时间50h，即得一次红枣营养有机酸；

一次发酵原料：枣浆为1000份，黄豆粉为30份，CaCO₃为60份，二级黑曲霉种子为5份，二级米曲霉种子为10份。

在所得的一次红枣营养有机酸中加入二次发酵原料进行二次发酵，发酵温度在47-53℃，静止发酵时间60h，即得二次发酵后的红枣营养有机酸；

二次发酵原料的重量份如下：一次红枣营养有机酸为1000份，黄豆粉为11份，CaCO₃为18份，二级乳酸菌种子为8份。

实施例4：

按以下重量份配置一次发酵原料，并加入到发酵罐中，发酵温度在28-36℃，保持发酵液PH为6-7，搅拌速度250 r/min，发酵时间70h，即得一次红枣营养有机酸；

一次发酵原料：枣浆为1000份，黄豆粉为35份，CaCO₃为75份，二级黑曲霉种子为4份，二级米曲霉种子为6份。

在所得的一次红枣营养有机酸中加入二次发酵原料进行二次发酵，发酵温度在45-55℃，静止发酵时间70h，即得二次发酵后的红枣营养有机酸；

二次发酵原料的重量份如下：一次红枣营养有机酸为1000份，黄豆粉为10份，CaCO₃为20份，二级乳酸菌种子为9份。

实施例5：

按以下重量份配置一次发酵原料，并加入到发酵罐中，发酵温度在29-34℃，保持发酵液PH为5.8-6.2，搅拌速度280r/min，发酵时间75h，即得一次红枣营养有机酸；

一次发酵原料：枣浆为1000份，黄豆粉为45份，CaCO₃为75份，二级黑曲霉种子为4份，二级米曲霉种子为7份。

在所得的一次红枣营养有机酸中加入二次发酵原料进行二次发酵，发酵温度在49-55℃，静止发酵时间78h，即得二次发酵后的红枣营养有机酸；

二次发酵原料的重量份如下：一次红枣营养有机酸为1000份，黄豆粉为14份，CaCO₃为23份，二级乳酸菌种子为9份。

实施例6：

按以下重量份配置一次发酵原料，并加入到发酵罐中，发酵温度在30-36℃，保持发酵液PH为5.5-6.5，搅拌速度215r/min，发酵时间55h，即得一次红枣营养有机酸；

一次发酵原料：枣浆为1000份，黄豆粉为25份，CaCO₃为90份，二级黑曲霉种子为7份，二级米曲霉种子为12份。

在所得的一次红枣营养有机酸中加入二次发酵原料进行二次发酵，发酵温度在45-52℃，静止发酵时间63h，即得二次发酵后的红枣营养有机酸；

二次发酵原料的重量份如下：一次红枣营养有机酸为1000份，黄豆粉为14份，CaCO₃为15份，二级乳酸菌种子为5份。

实施例7：

按以下重量份配置一次发酵原料，并加入到发酵罐中，发酵温度在28-31℃，保持发酵液PH为5.3-6.8，搅拌速度220 r/min，发酵时间70h，即得一次红枣营养有机酸；

一次发酵原料：枣浆为1000份，黄豆粉为40份，CaCO₃为50份，二级黑曲霉种子为3份，二级米曲霉种子为5份。

在所得的一次红枣营养有机酸中加入二次发酵原料进行二次发酵，发酵温度在50-55℃，静止发酵时间78h，即得二次发酵后的红枣营养有机酸；

二次发酵原料的重量份如下：一次红枣营养有机酸为1000份，黄豆粉为15份，CaCO₃为10份，二级乳酸菌种子为5份。

实施例8

按以下重量份配置一次发酵原料，并加入到发酵罐中，发酵温度在30-34℃，保持发酵液PH为5-6，搅拌速度260 r/min，发酵时间70h，即得一次红枣营养有机酸；

一次发酵原料：枣浆为1000份，黄豆粉为40份，CaCO₃为75份，二级黑曲霉种子为6份，二级米曲霉种子为10份。

在所得的一次红枣营养有机酸中加入二次发酵原料进行二次发酵，发酵温度在48-53℃，静止发酵时间70h，即得二次发酵后的红枣营养有机酸；

二次发酵原料的重量份如下：一次红枣营养有机酸为1000份，黄豆粉为11份，CaCO₃为22份，二级乳酸菌种子为7份。

实施例9

按以下重量份配置一次发酵原料，并加入到发酵罐中，发酵温度在31-36℃，保持发酵液PH为5-7，搅拌速度250 r/min，发酵时间70h，即得一次红枣营养有机酸；

一次发酵原料：枣浆为1000份，黄豆粉为30份，CaCO₃为70份，二级黑曲霉种子为7份，二级米曲霉种子为9份。

在所得的一次红枣营养有机酸中加入二次发酵原料进行二次发酵，发酵温度在45-55℃，静止发酵时间71h，即得二次发酵后的红枣营养有机酸；

二次发酵原料的重量份如下：一次红枣营养有机酸为1000份，黄豆粉为10份，CaCO₃为20份，二级乳酸菌种子为6份。

实施例10

按以下重量份配置一次发酵原料，并加入到发酵罐中，发酵温度在28-36℃，保持发酵液PH为6-7，搅拌速度230r/min，发酵时间68h，即得一次红枣营养有机酸；

一次发酵原料：枣浆为1000份，黄豆粉为40份，CaCO₃为80份，二级黑曲霉种子为6份，二级米曲霉种子为8份。

在所得的一次红枣营养有机酸中加入二次发酵原料进行二次发酵，发酵温度在50-55℃，静止发酵时间68h，即得二次发酵后的红枣营养有机酸；

二次发酵原料的重量份如下：一次红枣营养有机酸为1000份，黄豆粉为12份，CaCO₃为25份，二级乳酸菌种子为8份。

以上实施例经过常规的过滤、酸化除硫酸钙、活性炭脱色脱糖、超滤处理得红枣营养有机酸。

其中活性炭脱色脱糖步骤中，活性炭添加量为进行脱色脱糖混合物总重量的5-8%，吸附作用时间1.5-2.5h，吸附温度45-55℃，搅拌速度100-120rpm，pH为5.5-6.5。

经过上述工艺步骤后，本发明制备的红枣营养有机酸的脱糖率达90.3%，脱色率达96.5%，有机酸损失率为5.8%。

本发明先后进行了下列研究：

（一）     黑曲霉菌发酵枣浆生产葡萄糖酸的特性研究

发酵枣浆产葡萄糖酸黑曲霉菌株比选、接种量对黑曲霉发酵枣浆产葡萄糖酸的影响、枣浆糖度对黑曲霉发酵枣浆产葡萄糖酸的影响、发酵温度对黑曲霉发酵枣浆产葡萄糖酸的影响

（二）     米曲霉菌发酵枣浆生产L-苹果酸的特性研究

发酵枣浆产L-苹果酸米曲霉菌株比选、接种量对米曲霉发酵枣浆产L-苹果酸的影响、枣浆糖度对米曲霉发酵枣浆产L-苹果酸的影响、发酵温度对米曲霉发酵枣浆产L-苹果酸的影响。

（三）     米曲霉菌和黑曲霉菌共同发酵枣浆生产有机酸的特性研究

混菌发酵是利用不同菌株作用效果的差异，混菌间互利共栖，使酶系比例协调，使得混菌发酵能力大大高于单一菌株，提高了产率。由于米曲霉菌和黑曲霉菌生长环境相似，为两者共同发酵提供了前提条件。同时，试验所用的两菌系在糖的利用上有所偏重，黑曲霉以葡萄糖为主要碳源，而米曲霉以果糖为主要碳源。再者，不同糖浓度条件下糖转化率存在着明显差异。在分析两者发酵特性的基础上提出混菌共发酵，以期提高枣浆糖转化率和有机酸产率。

得出了采用混合菌共培养明显提高了糖转化率，且发酵生成有机酸的总含量增加。这说明单一菌酶系组分协调性差，混合菌培养有利于改善降解菌酶系组分的协调性，提高了糖生物转化率。且混菌发酵可增大有机酸产量，获得以葡萄糖酸和L-苹果酸为主的有机酸产物。这说明两菌株在共生条件下，仍以原有的有机酸代谢途径为主，故黑曲霉菌和黄曲霉菌混合发酵枣浆可有效提高枣汁发酵生产L-苹果酸和葡萄糖酸的效率。

采用SAS 9.1.3软件中的中心组合一致精度的设计来模拟反应面模型,以初始枣浆糖度、CaCO3添加量、温度、转速为自变量,以糖转化率为响应值,设计4因素5水平,共31个试验点(α取值为2),7个中心点重复试验，得出了最佳条件：枣浆糖度186.0 g/L, CaCO3添加量89.7 g/L，温度31.2℃,摇瓶速率245.7 r/min下,分别进行曲霉共发酵试验,共做3批,每批3个试验,结果表明，在最佳条件下,曲霉共发酵试验数据稳定,且糖转化率比始条件高,平均达84%,由此可知,预测模型能较好反映曲霉共发酵的实际情况。

（四）乳酸菌二次发酵条件优化

    共发酵结束后，发酵液中的糖含量为40g/L，为了进一步降低发酵液中的含糖量，使有机酸产品风味更佳，且增加制品微生物学稳定性,我们进行了乳酸菌的比选及二次发酵的试验条件摸索。从表1中，可以看到共发酵结束后营养组分的变化，其中残糖量为40g/L。乳酸菌A的糖转化率最高。从各种有机酸组分分析结果来看，乳酸菌发酵进一步改变了发酵液中有机酸的组成，使其组分结构更趋合理，风味更佳。枣发酵液功能成分分析结果表明乳酸菌发酵不破坏枣液功能成分。

表1：乳酸菌发酵液营养成分分析

二次发酵条件优化方法同上，结果表明，枣浆糖含量为40g/L，黄豆粉为10g/L，CaCO₃添加量为20g/L。接种量为5%，固定发酵温度35℃，静止发酵时间72h。

本发明采用的干枣：加工免洗干枣的剩余枣产品或裂果枣或者普通枣；米曲霉菌购于上海工业微生物研究所；黑曲霉菌购于武汉大学菌种保藏中心；乳酸杆菌购于中国科学院微生物研究所；CAMP标准品为江苏徐州万邦生化制药厂提供。其他试剂购于安徽芜湖甙尔塔生物制品有限公司。

采用本方法制备的红枣营养有机酸的各项指标如下：

红枣营养有机酸与市售的柠檬酸对照结果见表2-4。

表2  红枣营养有机酸与柠檬酸感官指标比较

表3  红枣营养有机酸与柠檬酸理化指标比较

从表2可知，红枣营养有机酸与柠檬酸相比，颜色上看，前者为浅粉色，稍深于后者，清亮度和含杂质程度上二者无差异；组织形态上，前者为流动性良好的液态物质，食用性能好；气味上，前者还保留轻微的枣蜜味，原因是所选取的原料本身固有的风味，但属于天然成分，除非特殊需要的产品外，一般产品和多数消费者还是认可的，甚至是喜欢的，不会影响其作为酸味剂的应用，相反柠檬酸产品无任何气味。

从表3可知，红枣营养有机酸组成中，但皂苷、桦木酸、熊果酸、齐墩果酸、五环三萜类化合物等也随之进入有机酸液中，使之营养更全面。

表4 红枣营养有机酸与柠檬酸卫生指标比较

从表4可知红枣发酵有机酸卫生指标均可与柠檬酸相比，因为生产选用的原、辅料均都经过检验为合格品，加工过程中严格执行操作规程，按照规范工艺，未带来任何新的污染。

Claims (7)

1.多菌种发酵生产红枣营养有机酸的方法，其特征在于按照以下步骤进行：

第一步，制备枣浆，将枣浆糖含量调至150g/L—200g/L；

第二步，一次发酵：

先分别发酵制备一级米曲霉种子、一级黑曲霉种子、一级乳酸杆菌种子；

接着分别用摇瓶发酵所述的一级米曲霉种子、一级黑曲霉种子、一级乳酸杆菌种子制备二级米曲霉种子、二级黑曲霉种子、二级乳酸杆菌种子；

按以下重量份配置一次发酵原料，并加入到发酵罐中，发酵温度在28-36℃，发酵液pH为5-7，搅拌速度150-300 r/min，发酵时间50-100h，即得一次红枣营养有机酸；

一次发酵原料：枣浆为1000份，黄豆粉为20-50份，CaCO₃为50-100份，二级黑曲霉种子为3-8份，二级米曲霉种子为4-12份。

2.根据权利要求1所述的多菌种发酵生产红枣营养有机酸的方法，其特征是在所述的一次红枣营养有机酸中加入二次发酵原料进行二次发酵，发酵温度在45-55℃，静止发酵时间60-80h，即得二次发酵后的红枣营养有机酸；

二次发酵原料的重量份如下：一次红枣营养有机酸为1000份，黄豆粉为8-15份，CaCO₃为10-30份，二级乳酸菌种子为4-10份。

3.根据权利要求1所述的多菌种发酵生产红枣营养有机酸的方法，其特征在于所述一次发酵原料的重量份：枣浆为1000份，黄豆粉为30-40份，CaCO₃为70-80份，二级黑曲霉种子为6-7份，二级米曲霉种子为8-10份。

4.根据权利要求2所述的多菌种发酵生产红枣营养有机酸的方法，其特征在于所述二次发酵原料的重量份如下：一次红枣营养有机酸为1000份，黄豆粉为10-12份，CaCO₃为20-25份，二级乳酸菌种子为6-8份。

5.根据权利要求1-3任意一项所述的多菌种发酵生产红枣营养有机酸的方法，其特征在于：所述方法还包括在所述一次发酵后的红枣营养有机酸和/或二次发酵后的红枣营养有机酸经过过滤、酸化除硫酸钙、活性炭脱色脱糖、超滤处理得红枣营养有机酸。

6.根据权利要求1或3所述的多菌种发酵生产红枣营养有机酸的方法，其特征在于所述的一次发酵分为以下三个阶段：

第一阶段，发酵开始至20-28小时，无菌空气流量0.1-1m³/min，维持温度29±1℃之间；

第二阶段，第一阶段结束至60小时，升温至33±3℃，无菌空气通气量为0.1-0.3 m³/min；

第三阶段，第二阶段结束至100小时，温度维持在33±3℃，无菌空气通气量为0.2-0.5 m³/min。

7.根据权利要求5所述的多菌种发酵生产红枣营养有机酸的方法，其特征在于活性炭脱色脱糖步骤中，活性炭添加量为进行脱色脱糖混合物总重量的5-8%，吸附作用时间1.5-2.5h，吸附温度45-55℃，搅拌速度100-120rpm，pH为5.5-6.5。