WO2022172968A1 - バイオマス資源からのテレフタル酸の製造方法及びバイオマス資源からのポリエステルの製造方法 - Google Patents

バイオマス資源からのテレフタル酸の製造方法及びバイオマス資源からのポリエステルの製造方法 Download PDF

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    • C12Y102/01007—Benzaldehyde dehydrogenase (NADP+) (1.2.1.7)
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    • C12Y114/13—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with NADH or NADPH as one donor, and incorporation of one atom of oxygen (1.14.13)
    • C12Y114/13002—4-Hydroxybenzoate 3-monooxygenase (1.14.13.2)

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing terephthalic acid from biomass resources and a method for producing polyester from biomass resources.
  • Terephthalic acid which is a raw material for polyester, is conventionally produced by chemically oxidizing p-xylene after obtaining p-xylene through a pyrolysis process of naphtha derived from crude oil, which is a fossil resource, followed by a distillation process. ing.
  • crude oil which is a fossil resource
  • biomass resources are renewable resources and can fix carbon dioxide in the atmosphere through photosynthesis. A reduction in carbon footprint is expected compared to acids and polyesters. Therefore, methods for producing terephthalic acid and polyester from biomass resources have been proposed (see, for example, Patent Documents 1 to 3 and Non-Patent Documents 1 to 3).
  • Polyester is one of the most widely used synthetic resins in the world for various fibers, films, sheets, containers, etc., due to its excellent mechanical strength, chemical stability, transparency, and low cost.
  • Polyester is a polymer compound obtained by polycondensation of polyhydric carboxylic acid and polyhydric alcohol.
  • Polyesters using terephthalic acid as polycarboxylic acid include polyethylene terephthalate (PET), polytrimethylene terephthalate (PTT), polybutylene terephthalate (PBT), polybutylene adipate terephthalate (PBAT), polybutylene terephthalate succinate (PETS ), etc.
  • PET is used for fibers, PET bottles, films, and the like.
  • PTT is used for fibers and the like, and PBT is used for injection molded parts and the like.
  • PBAT and PETS are utilized as biodegradable polymers.
  • Patent Documents 1 to 3 and Non-Patent Documents 1 to 3 a thermal decomposition reaction at a high temperature of several hundred degrees is performed in the process for obtaining p-xylene from biomass resources.
  • a large amount of energy is consumed due to the steps, dehydration reaction step, cyclization reaction step, aromatization step, and the like.
  • Patent Document 3 discloses a method for producing p-tolualdehyde from biomass resources, the aromatization step reaction is performed at a high temperature of 400 ° C. as in the above, so energy consumption is large. There is a problem.
  • Patent Documents 1 to 3 and Non-Patent Documents 1 to 3 above have a problem that the number of steps is large in the process of producing terephthalic acid from biomass resources.
  • the chemical conversion process is as long as 3 steps, so the chemical conversion requires large-scale equipment and a large economic burden.
  • the p-xylene production process disclosed in Patent Document 2 since the chemical conversion process is two steps, the equipment and economic burden for the chemical conversion are similarly large.
  • Non-Patent Document 3 since there are five chemical conversion steps from furfural to terephthalic acid, large-scale equipment and a large economic burden are required as in the above case.
  • Patent Documents 2 and 3 which disclose a method for producing p-xylene from biomass resources, at least one additional chemical conversion step is required for the production of terephthalic acid.
  • the present invention is a method for producing terephthalic acid, which includes a step of converting a biomass resource or a compound derived from a biomass resource into p-tolualdehyde by a microorganism in a short process with low energy consumption. , found a method of making polyester.
  • a group of genes encoding four types of enzymes: benzaldehyde dehydrogenase, toluate methyl monooxygenase, 4-carboxybenzyl alcohol dehydrogenase, and 4-carboxybenzaldehyde dehydrogenase.
  • benzaldehyde dehydrogenase toluate methyl monooxygenase
  • 4-carboxybenzyl alcohol dehydrogenase 4-carboxybenzaldehyde dehydrogenase.
  • terephthalic acid could be biotransformed from p-tolualdehyde produced in the transformant using the resulting transformant.
  • the present invention has been completed
  • a method for producing terephthalic acid which comprises a step of converting a biomass resource or a compound derived from a biomass resource into p-tolualdehyde using a microorganism.
  • the biomass resource-derived compound is at least one of shikimic acid, 1-p-tolylethanol, p-methylacetophenone, and p-methylbenzyl alcohol.
  • the biomass resource is a biomass resource treated by a pretreatment step, a saccharification step, or both.
  • the above [ 1] The method for producing terephthalic acid according to any one of [3].
  • the edible biomass comprises at least one kind of biomass selected from corn, sweet potato, rice, potato, wheat, barley, tapioca, sugarcane, beet, molasses, and high test molasses.
  • the non-edible biomass contains at least one type of biomass selected from herbaceous biomass, woody biomass, paper, pulp, waste paper, bagasse, and corn stover. Production method.
  • [7] The method for producing terephthalic acid according to any one of [1] to [6] above, which comprises adding at least one enzyme selected from amylase, cellulase, hemicellulase, and ligninolytic enzyme to the medium. .
  • [8] The method for producing terephthalic acid according to any one of [1] to [7] above, wherein p-tolualdehyde is biologically oxidized using microorganisms to produce terephthalic acid.
  • the microorganism is the same as the microorganism used for the production of p-tolualdehyde, and four types of benzaldehyde dehydrogenase, toluate methyl monooxygenase, 4-carboxybenzyl alcohol dehydrogenase, and 4-carboxybenzaldehyde dehydrogenase;
  • a method for producing polyester comprising a step of reacting terephthalic acid produced by the method for producing terephthalic acid according to any one of [1] to [10] above with a diol compound to produce polyester.
  • the aforementioned microorganism (hereinafter sometimes referred to as "the subject microorganism") capable of producing p-tolualdehyde from the compound derived from it.
  • the benzaldehyde dehydrogenase has at least 90% sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19 and retains benzaldehyde dehydrogenase activity; said toluate methyl monooxygenase has at least 90% sequence identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 20 and retains toluate methyl monooxygenase activity; said 4-carboxybenzyl alcohol dehydrogenase has at least 90% sequence identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 21 and retains 4-carboxybenzyl alcohol dehydrogenase activity; said 4-carboxybenzaldehyde dehydrogenase has at least 90% sequence identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 22 and retains 4-carboxybenzaldehyde dehydrogenase activity;
  • the microorganism according to [12] or [13] above, wherein the microorganism is Phlebia uda or Hydnophlebia chrysorhiza.
  • the gene cluster comprising the step of introducing into a microorganism a gene cluster encoding four types of enzymes: benzaldehyde dehydrogenase, toluate methyl monooxygenase, 4-carboxybenzyl alcohol dehydrogenase, and 4-carboxybenzaldehyde dehydrogenase;
  • a method for producing a gene-introduced microorganism, wherein the microorganism is a microorganism capable of producing p-tolualdehyde from a biomass resource or a compound derived from a biomass resource hereinafter referred to as the "method for producing a microorganism" Sometimes).
  • the benzaldehyde dehydrogenase has at least 90% sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19 and retains benzaldehyde dehydrogenase activity; said toluate methyl monooxygenase has at least 90% sequence identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 20 and retains toluate methyl monooxygenase activity; said 4-carboxybenzyl alcohol dehydrogenase has at least 90% sequence identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 21 and retains 4-carboxybenzyl alcohol dehydrogenase activity; said 4-carboxybenzaldehyde dehydrogenase has at least 90% sequence identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 22 and retains 4-carboxybenzaldehyde dehydrogenase activity; The method according to [15] above. [17] The method of [15] or [16] above, wherein the microorganism is Phlebia uda or Hydn
  • biomass resources can be converted into p-tolualdehyde at room temperature by using a fermentation method using microorganisms, so energy consumption can be greatly reduced.
  • p-tolualdehyde having the same carbon skeleton as terephthalic acid can be produced from biomass resources in one step by fermentation of microorganisms, so that the number of steps in producing terephthalic acid can be reduced. can.
  • terephthalic acid can be biotransformed from p-tolualdehyde produced in the transformant, so that terephthalic acid can be produced from biomass resources in one step, greatly reducing energy consumption. can be reduced to Therefore, compared with other known methods, equipment costs can be suppressed, and the economic burden is small. Furthermore, it becomes possible to provide a method for producing the polyester produced by this method.
  • FIG. 1(a) is a diagram for explaining the conventional method
  • FIG. 1(b) is a diagram for explaining the method of the present invention.
  • polyester polyethylene terephthalate (PET) will be described.
  • Terephthalic acid is produced by oxidizing p-xylene by supplying air in the presence of a catalyst such as cobalt, manganese or bromine.
  • PET Polyethylene terephthalate
  • the method of the present invention uses biomass resources or compounds derived from biomass resources instead of fossil resources as raw materials.
  • the method of the present invention includes a step of culturing microorganisms in the presence of biomass resources or compounds derived from biomass resources.
  • Such culturing includes, for example, solid culturing microorganisms on biomass; standing on culture media solidified by agar, gellan gum, agarose, etc.; shaking in the culture medium of .
  • Cultivation can be performed under conditions such as an appropriate culture medium, an appropriate culture temperature, an appropriate culture period, and the like.
  • the culture medium is not particularly limited as long as it allows the survival and growth of microorganisms. Examples include potato dextrose agar (PDA) medium, malt extract agar (MA) medium, LB agar medium, LB liquid medium, YM liquid medium, TB liquid medium, and the like.
  • the culture temperature is not particularly limited, and is, for example, within the range of 15 to 40°C, preferably 20 to 38°C, more preferably 22 to 30°C, and even more preferably 24 to 28°C.
  • the culture period is not particularly limited, and is, for example, within the range of 4 to 40 days, preferably 5 to 35 days, more preferably 5 to 30 days, and even more preferably 10 to 20 days.
  • the shaking speed when culturing microorganisms under shaking conditions is, for example, within the range of 60 to 300 rpm, preferably 80 to 120 rpm.
  • Microorganisms use their own enzymes to decompose or change biomass resources or compounds derived from biomass resources, and produce p-tolualdehyde, which has the same carbon skeleton as terephthalic acid, as an intermediate product. Therefore, another embodiment of the present invention is a method for producing p-tolualdehyde, which comprises the step of culturing microorganisms in the presence of biomass resources or compounds derived from biomass resources. After carrying out such a production method, the p-tolualdehyde-containing culture medium is heated and then cooled by a condenser or the like, whereby the p-tolualdehyde-containing solution can be recovered.
  • p-tolualdehyde can be recovered while the microorganism is being cultured by cooling the exhaust gas from the culture tank in which the microorganism is being cultured using a condenser or the like.
  • p-tolualdehyde can be recovered from a culture medium containing p-tolualdehyde by extraction with an organic solvent. Any kind of organic solvent may be used as long as it is not completely miscible with water, such as petroleum ether, hexane, ethyl acetate, chloroform, and 4-methyltetrahydropyran.
  • these organic solvents may be added at the time of culturing as long as they do not significantly inhibit the growth of microorganisms.
  • Purification methods such as chromatography, distillation, etc. can be used to increase the p-tolualdehyde to the desired concentration. After that, the obtained p-tolualdehyde is oxidized to produce terephthalic acid. At this time, air may be supplied and chemically oxidized as described above, but from the viewpoint of producing terephthalic acid with low energy consumption and in a short process, microorganisms (preferably A method of biological oxidation using the same microorganisms used for production is preferred.
  • p-tolualdehyde When p-tolualdehyde is biologically oxidized to terephthalic acid, p-tolualdehyde after purification may be oxidized to terephthalic acid by the above method, or a microorganism that produces p-tolualdehyde may be oxidized to terephthalic acid. , p-tolualdehyde may be oxidized to terephthalic acid by co-culturing with a microorganism that oxidizes p-tolualdehyde to terephthalic acid.
  • p-tolualdehyde produced in microorganisms is oxidized by chemical reactions represented by the following formulas (I) to (IV). , methods of biotransforming terephthalic acid.
  • the microorganisms include four enzymes (benzaldehyde dehydrogenase [BZDH] that catalyzes the chemical reaction shown in the following formula (I); ) toluate methylmonooxygenase [TsaMB; toluate methylmonooxygenase] that catalyzes the chemical reaction shown in ); Those that express 4-CBA dehydrogenase [TsaD], which catalyzes a chemical reaction, are preferred (reference “Nat Commun. 2017 May 31;8:15689.”).
  • BZDH benzaldehyde dehydrogenase
  • microorganism When the microorganism is not a microorganism that expresses the above four types of enzymes (BZDH, TsaMB, TsaC, and TsaD), a microorganism into which genes encoding the above four types of enzymes have been introduced, biomass resources or biomass resources A microorganism capable of producing p-tolualdehyde from the compound from which it is derived (ie, the subject microorganism) is preferred.
  • the present microorganism is a method comprising the step of introducing a group of genes (polynucleotides) encoding the above four types of enzymes into a microorganism capable of producing p-tolualdehyde from biomass resources or compounds derived from biomass resources (i.e., the present microorganism method).
  • Methods for such gene introduction include, for example, a method using calcium ions, a general competent cell transformation method, a protoplast transformation method, and an electroporation method.
  • the gene group encoding the above-mentioned four enzymes to be introduced into the microorganism is in a vector (the same vector or separate vectors) linked so that the promoter is operable upstream thereof.
  • vectors include those further containing the nucleotide sequences of enhancer regions and ribosome binding sites (RBS) in order to further increase gene expression efficiency, and those containing a carboxin-resistant gene, It may further contain drug resistance genes (selection marker genes) such as spectinomycin resistance gene, chloramphenicol resistance gene, tetracycline resistance gene, kanamycin resistance gene, ampicillin resistance gene and the like.
  • the enhancer region is usually placed upstream of the promoter, and the RBS is usually placed between the promoter and the gene group encoding the above four enzymes.
  • promoter means a region where RNA polymerase (preferably RNA polymerase and basic transcription factors) binds and initiates transcription of mRNA encoded by a gene located downstream thereof.
  • BZDH from Novosphingobium (Sphingomonas) aromaticivorans a gene encoding a polypeptide having the same identity and benzaldehyde dehydrogenase activity [specifically, the activity of catalyzing the chemical reaction represented by the above formula (I)] (Preferably, it has at least 90% sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23 and retains benzaldehyde dehydrogenase activity [specifically, the activity to catalyze the chemical reaction shown in formula (I) above] polypeptide), orthologues of these genes, and the like, and in the case of a gene encoding TsaMB, for example, TsaMB derived from Comamonas testosteroni (preferably, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20 and at least 90% and a polypeptide having toluate methyl monooxygenase activity [specifically, the activity of cata
  • Nucleotide sequences of genes encoding the above four types of enzymes can be obtained by those skilled in the art by referring to the amino acid sequences of the above four types of enzymes and known codon tables corresponding to various microorganisms. can be specifically and unambiguously identified as the nucleotide sequence corresponding to the amino acid sequence of
  • a conventional method can be used to produce polyethylene terephthalate (PET) from terephthalic acid.
  • Ethylene glycol that can be used in the present invention may be ethylene glycol derived from fossil resources, but in order to reduce carbon dioxide emissions that cause global warming, bioethanol-derived bioethylene glycol produced from biomass resources should be used.
  • biomass resources are used as raw materials and terephthalic acid is produced by culturing microorganisms. amount can be significantly reduced. Moreover, since an expensive apparatus such as a furnace for thermal decomposition is not required, terephthalic acid and polyester can be produced at low cost.
  • FIG. 2 is a diagram showing a first example of the production flow of terephthalic acid and polyester.
  • edible biomass containing sugars is used as the biomass resource
  • sugars are used as the biomass resource-derived compound.
  • Edible biomass is a biomass resource that grows through photosynthesis and that can be eaten (edible).
  • Saccharides are monosaccharides or disaccharides that are nutrients that serve as energy sources for organisms, and include, for example, glucose, fructose, galactose, mannose, arabinose, xylose, sucrose, and maltose.
  • oligosaccharides may be included in the saccharides.
  • the edible biomass containing a large amount of sugars is not particularly limited, and examples include sugarcane, grapes, beets, molasses, and high test molasses.
  • examples include sugarcane, grapes, beets, molasses, and high test molasses.
  • the edible biomass containing saccharides only one of the above types may be used, or two or more types may be used.
  • step 101 edible biomass containing sugars is added to a culture device in which microorganisms are cultured.
  • a culture apparatus includes a reaction vessel having a medium for culturing microorganisms. Thereafter, the culture device or medium components may be sterilized by autoclaving, steam, or the like.
  • biomass resource-derived shikimic acid, 1-p-tolylethanol, p-methylacetophenone, and p-methylbenzyl alcohol may be added to the culture apparatus.
  • saccharides derived from biomass resources can be produced by fermentation of microorganisms according to the present invention. can be prepared.
  • step 102 microorganisms in the culture apparatus produce p-tolualdehyde from sugars contained in edible biomass.
  • the microorganism to be cultured may be any microorganism as long as it can produce p-tolualdehyde from sugars. Also, shikimic acid, 1-p-tolylethanol, p-methylacetophenone, and p-methylbenzyl alcohol may be added to the culture apparatus.
  • Microorganisms that can be used in the present invention are not particularly limited as long as they use biomass resources or compounds derived from biomass resources as raw materials and have the ability to produce p-tolualdehyde.
  • Examples of microorganisms belonging to the family Meruliaceae include the genus Abortiporus, the genus Amaurohydnum, the genus Amauromyces, the genus Aquascypha, the genus Aurantiopileus, the genus Aurantiporus, the genus Bjerkandera, the genus Bulbillomyces, the genus Ceriporiopsis, the genus Cerocorticium, the genus Chrysoderma.
  • microorganisms can be obtained by isolating them from nature. It can also be obtained from ATCC (American Type Culture Collection) or the like. Alternatively, these microorganisms may be subjected to physical or chemical mutation treatments to prepare p-tolualdehyde high-producing strains, and the prepared high-producing strains may be used.
  • p-tolualdehyde obtained by culturing microorganisms can be purified to increase its purity before conversion to terephthalic acid. Any method for purifying p-tolualdehyde can be used as long as it is a method for increasing the purity of p-tolualdehyde.
  • p-tolualdehyde can be purified by any one or a combination of methods for purifying chemical products such as solid-liquid separation, distillation, crystallization, decolorization, and desalting. Purification methods can also be carried out using separation techniques such as membrane separation and chromatography.
  • the medium composition is charged into the reaction vessel 10 at the start of fermentation, the medium components are sterilized by autoclaving, steam, etc., and then the microorganisms are added to the medium 11. It is a method of inoculating and culturing microorganisms while adjusting pH, oxygen concentration, temperature and the like.
  • the reaction tank 10 is provided with an agitator 12 for keeping the concentration of the culture medium 11 and the dissolved oxygen concentration uniform and for supplying oxygen to the culture medium. Also, it is desirable to supply sterilized air from the bottom of the reaction vessel 10 .
  • the batch culture method does not add a carbon source or the like that serves as a nutrient for the microorganism, the depletion of the nutrient stops the proliferation and growth of the microorganism. For this reason, in the batch culture method, microorganisms go through a lag phase, a logarithmic growth phase, and finally enter a stationary phase in which the growth rate decreases or stops.
  • the induction period is a stage in which microorganisms have not adapted to the environment, and there is little growth.
  • the exponential growth phase is the period during which microbial growth occurs exponentially or logarithmically.
  • Carbon sources include saccharides contained in edible biomass, shikimic acid added to the reactor, and the like.
  • the cultured cells can be aseptically recovered and used for the next batch culture.
  • the fed-batch culture method is a method in which the carbon source is gradually added as the fermentation process progresses. Therefore, in the fed-batch culture method, as shown in FIG.
  • the fed-batch culture method is useful when the metabolism of microorganisms tends to be suppressed by catabolite suppression and it is preferable to limit the amount of carbon source in the medium.
  • catabolite suppression is a phenomenon in which the carbon source added to the medium reduces the rate of synthesis of a specific enzyme.
  • the continuous culture method is a method in which a predetermined amount of culture medium is continuously supplied to the reaction tank at a constant rate, while simultaneously withdrawing the same amount of culture solution. For this reason, in the continuous culture method, as shown in FIG.
  • the continuous culture method can continuously replace part or all of the medium to replenish nutrients and prevent the accumulation of metabolic by-products and dead cells that can adversely affect the growth of microorganisms. can.
  • the microorganisms used in the present invention can be used after being immobilized using known methods such as the carrier binding method, the cross-linking method, and the entrapment method.
  • the culture apparatus used in the present invention an aeration stirring type culture tank, an air lift type culture tank, a packed tank type culture tank, a fluidized bed type culture tank, or the like can be used.
  • the nutrients used for culturing microorganisms are not limited to carbon sources, but may include nitrogen sources, various salts, vitamins, minerals, etc.
  • Nitrogen sources include, for example, yeast extract, peptone, various amino acids, soybean meal, corn steep liquor, urea, and nitrogen compounds such as various inorganic nitrogens.
  • terephthalic acid is produced from p-tolualdehyde.
  • Terephthalic acid is produced from p-tolualdehyde by a chemical oxidation method or a biological oxidation method.
  • the chemical oxidation method include a method of oxidation with an oxygen-containing gas using a heavy metal salt or a bromine compound as a catalyst (see, for example, JP-A-51-86437).
  • a method of biological oxidation for example, a method using genetically engineered Escherichia coli (for example, Luo, Z., Lee, S. Biotransformation of p-xylene into terephthalic acid by engineered Escherichia coli. Nat Common 8, 15689 (2017) (see http://doi.org/10.1038/ncomms15689)).
  • terephthalic acid is purified in order to improve the purity of terephthalic acid.
  • the purification method can be carried out by any one or a combination of methods for purifying chemical products such as solid-liquid separation, distillation, crystallization, decolorization, and desalting. Purification methods can also be carried out using separation techniques such as membrane separation and chromatography.
  • polyester is produced by polymerizing the refined terephthalic acid and the diol compound, and the work ends in step 106.
  • Polyesters produced include polyethylene terephthalate (PET), polytrimethylene terephthalate (PTT), polybutylene terephthalate (PBT), polybutylene adipate terephthalate (PBAT), polybutylene terephthalate succinate (PETS), and the like.
  • PET polyethylene terephthalate
  • PBT polytrimethylene terephthalate
  • PBT polybutylene terephthalate
  • PBAT polybutylene adipate terephthalate
  • PETS polybutylene terephthalate succinate
  • Fig. 4 is a diagram showing a second example of the production flow of terephthalic acid and polyester.
  • edible biomass containing polysaccharides is used as biomass resources, and polysaccharides are used as compounds derived from biomass resources.
  • polysaccharides include cellulose, starch, hemicellulose, pectin, and the like.
  • Edible biomass containing polysaccharides is, for example, edible biomass containing starch, which is one of polysaccharides (starch-based edible biomass).
  • the starch-based edible biomass is not particularly limited, and examples include corn, sweet potato, rice, potato, wheat, barley, and tapioca. Only one type of the starch-based edible biomass may be used, or two or more types may be used.
  • the starch-based edible biomass is preferably gelatinized by adding water and heating.
  • step 201 polysaccharides contained in edible biomass are hydrolyzed to monosaccharides.
  • a microorganism can be used as a raw material even if the polysaccharide is intact, but the production rate of p-tolualdehyde produced by the microorganism in the present invention is better if the polysaccharide is hydrolyzed into a monosaccharide and then added to the medium. is faster, which is preferable.
  • Oligosaccharides may also be contained after hydrolysis of the starch-based edible biomass.
  • the hydrolysis from polysaccharides to monosaccharides may be hydrolysis with an acid such as hydrochloric acid, sulfuric acid, or phosphoric acid, or may be hydrolysis with an enzyme produced by microorganisms.
  • Enzymes produced by microorganisms are amylase and the like.
  • As the amylase used in preparing the glucose used in the present invention from starch-based edible biomass at least one of liquefying amylase ( ⁇ -amylase), saccharifying amylase ( ⁇ -amylase), pullulanase, glucoamylase, and the like. It is desirable to contain it, and depending on the type of enzyme, the pH and temperature suitable for the enzymatic reaction can be selected.
  • amylase-producing microorganisms for example, microorganisms belonging to the genus Aspergills, Bacillus, and Pseudomonas can be used. Hydrolysis may be carried out in a tank separate from the reaction tank, or may be carried out in the reaction tank. When carried out in a reaction vessel, an enzyme such as amylase can be added to the medium in which the microorganism is cultured.
  • Step 202 and subsequent steps are the same as the processing from step 101 and subsequent steps shown in FIG. 2, so description thereof will be omitted here.
  • step 202 when adding edible biomass to the culture apparatus, microorganisms that produce enzymes such as amylase may be added. Microorganisms that produce enzymes such as amylase may also be cultured together with microorganisms that produce p-tolualdehyde from sugars.
  • Fig. 5 is a diagram showing a third example of the production flow of terephthalic acid and polyester.
  • non-edible biomass is used as the biomass resource.
  • Non-edible biomass is biomass that cannot be eaten, unlike edible biomass.
  • Non-edible biomass is not particularly limited, and examples thereof include woody biomass and herbaceous biomass.
  • Woody biomass includes, for example, coniferous trees such as pine, cedar, fir, spruce, Douglas fir, and radiata pine, and broadleaf trees such as beech, birch, alder, maple, eucalyptus, poplar, acacia, lauan, aspen, and rubber. can be mentioned.
  • herbaceous biomass examples include kenaf, Manila hemp, corn stover, corn cob, bamboo, bagasse, rice straw, rice husk, wheat straw, cotton linter, reed, flax, erianthus, mulberry, mitsumata, soybean residue, sweet potato stems and leaves, etc. can be mentioned.
  • the non-edible biomass is not limited to using only one type, and multiple types may be used.
  • non-edible biomass When using non-edible biomass as a raw material, it is desirable to use it in a physically crushed state instead of using wood as it is. This is to facilitate the permeation of chemicals when using chemicals to reduce the content of lignin bound to cellulose, which is one of the polysaccharides that constitute wood and the like.
  • non-edible biomass is pretreated.
  • Paper, waste paper, pulp, etc. can also be used as raw materials.
  • Paper, waste paper, and pulp can be those produced by known methods such as chemical pulping, mechanical pulping, and semi-chemical pulping (for example, Sambrook, J et al., Molecular Cloning 2nd ed., 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. Press (1989)).
  • the pulp preferably contains a large amount of cellulose and hemicellulose, and may contain lignin.
  • the material can be made into small pieces, the specific surface area can be increased, and chemicals can easily permeate, but any other method can be adopted as long as the lignin content can be reduced.
  • a known chemical pulp manufacturing method can be used (see, for example, Paper Pulp Manufacturing Technology Series, Vol. 1 Kraft Pulp, Vol. 2 Mechanical Pulp, edited by Pulp and Paper Technology Association).
  • the chemical used in the pretreatment may be any chemical as long as it can reduce the lignin content, such as sodium hydroxide, sodium sulfide, sodium sulfite, calcium sulfite, ozone, oxygen, chlorine, Hypochlorous acid, hydrogen peroxide, chlorine dioxide, or a combination of at least two of these can be used.
  • a method of treating non-edible biomass under high temperature and pressure in the presence or absence of chemicals may be adopted. This is for improving the separation and recovery of lignin.
  • a chemical having a quinone structure such as anthraquinone or a surfactant may be added at the same time to increase the separation and recovery rate of lignin.
  • Non-edible biomass can also be hydrolyzed using acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid and the like. It can also be hydrolyzed by enzymes produced by microorganisms. In the case of non-edible biomass, microorganisms that produce enzymes such as cellulase, hemicellulase, and ligninolytic enzymes can be used as enzymes.
  • the hydrolysis may be carried out in a tank separate from the reaction tank, or may be carried out in the reaction tank.
  • enzymes such as cellulase, hemicellulase, and lignolytic enzymes can be added to the medium in which the microorganism is cultured. Only one type of these enzymes may be added, or two or more types may be added.
  • Step 303 and subsequent steps are the same as steps 101 shown in FIG. 2 and 202 and subsequent steps shown in FIG. 4, so the description is omitted here.
  • step 303 when adding non-edible biomass, microorganisms that produce enzymes such as cellulase, hemicellulase, and ligninolytic enzymes may be added.
  • microorganisms that produce enzymes such as cellulase, hemicellulase, and lignolytic enzymes may also be cultured together with microorganisms that produce p-tolualdehyde from sugars.
  • cellulase-producing microorganisms include bacteria such as Acetobacter xylinum, Cellulomonas fimi, and Clostridium thermocellum.
  • bacteria such as Acetobacter xylinum, Cellulomonas fimi, and Clostridium thermocellum.
  • filamentous fungi for example, Aspergillus aculeatus, Aspergillus niger, Humicola grisea, Humicola insolens, Trichoderma reesei, Trichoderma viridii (Trichoderma viridie) and the like.
  • Cellulases produced by these microorganisms can also be used as enzymes.
  • Enzymes that constitute cellulases include endoglucanase, cellobiohydrolase, cellobiose dehydrogenase, ⁇ -glucosidase, and the like.
  • the enzyme may be composed of only one of these types, or may be composed of two or more types.
  • cellulase commercially available cellulases such as Cellic Ctec3 (manufactured by Novozemes) and Accellerase (DuPont Industrial Biosciences) can be used.
  • Cellic Ctec3 manufactured by Novozemes
  • Accellerase DuPont Industrial Biosciences
  • the hemicellulase it is desirable to mainly include xylanase when the non-edible biomass is broad-leaved trees or non-edible herbaceous biomass. If the non-edible biomass is softwood, it preferably contains primarily mannanase.
  • lignin-degrading enzymes basidiomycete-derived manganese peroxidase, lignin peroxidase, laccase, versatile peroxidase, etc. can be used.
  • manganese peroxidase, lignin peroxidase, or versatile peroxidase it is desirable to add hydrogen peroxide for efficient enzymatic reaction.
  • sequence identity means that the sequence identity to the entire subject sequence is 90% or more, preferably 91% or more, more preferably 92% or more, and further Preferably 93% or more, even more preferably 94% or more, particularly preferably 95% or more, especially more preferably 98% or more, most preferably 100% identity.
  • sequence identity refers to the degree of amino acid sequence similarity (which is determined by matching the query sequence to other, preferably identical, sequences (protein sequences)).
  • GCG BLAST Basic Local Alignment Search Tool
  • Example 1 Mycoacia uda (ATCC76971) was cultured in the presence of edible biomass containing a large amount of sugars to produce p-tolualdehyde, followed by chemical synthesis to produce terephthalic acid and polyester.
  • Pre-culture If the isolated microorganisms are inoculated into a large volume medium from the beginning, the induction period will be long and the growth of the microorganisms will take time. Increase the medium volume. Pre-cultivation is the work of inoculating a small amount of medium before inoculating a large-capacity medium to grow the microorganisms.
  • Mycoacia uda (ATCC76971) as a microorganism, it was precultured on a potato dextrose agar (PDA) medium at a temperature of 26°C for 1 week (7 days). After that, 10 cells were punched out with a cork polarizer having a diameter of 7 mm, and sterilized in an autoclave (121 ° C., 20 minutes) YM liquid medium (yeast extract 0.3%, malt extract 0.3%, glucose 1 %, peptone 0.5%, pH 6.2) were inoculated into three 300 mL Erlenmeyer flasks containing 100 mL. After that, the medium was agitated for 7 days with a shaker culture machine (26° C., 100 rpm) for pre-culture.
  • PDA potato dextrose agar
  • the culture solution after the pre-culture was filtered through Miracloth (Merck), and the obtained cells were crushed with 100 mL of sterilized water in a Waring blender.
  • the cell lysate was cultured at 26°C for 2 weeks in a 3L jar fermentation medium (manufactured by ABLE) using a medium containing 5% blackstrap molasses and a yeast nitrogen base (no amino acids) as a nitrogen source. did
  • toluene was distilled off under reduced pressure (reduced pressure distillation) using a rotary evaporator (manufactured by Buchi). Further, p-tolualdehyde was purified by silica gel chromatography using a mixture of hexane and ethyl acetate at a ratio of 9:1 as a developing solvent.
  • Terephthalic acid is produced by oxidizing p-tolualdehyde. Therefore, purified p-tolualdehyde is oxidized, and the method described in JP-A-51-86437 was employed as the oxidation method.
  • a titanium pressure-resistant reactor (capacity 2.5 L) equipped with a reflux condenser, a stirring device, and a heating device, and having a raw material inlet, a raw material gas inlet, a gas outlet, and a reactant outlet, and a reaction Continuous oxidation of p-tolualdehyde was carried out in a continuous oxidation reactor having two reactant receivers connected in series to a reactant outlet.
  • Acetic acid containing a predetermined amount of catalyst metal and bromine compound (water content: 5 wt%) was charged into the reactor in advance, pressurized to about 1 MPa with nitrogen, and then heated to 210°C. After raising the temperature to 210° C., under conditions of about 1.8 MPa, p-tolualdehyde and acetic acid containing 0.0283 wt % cobalt, 0.0567 wt % manganese, and 0.121 wt % amount of 0.03 wt %) was continuously fed at a feed rate resulting in a ratio of 225 g/hr of p-tolualdehyde and 1120 g/hr of acetic acid. Acetic acid containing cobalt, manganese, and bromine was prepared using cobalt acetate tetrahydrate, manganese acetate, and tetrabromoethane.
  • the reaction product was continuously extracted from the reactor in a slurry state, filtered, and the cake was washed twice each with acetic acid and water and dried to obtain terephthalic acid.
  • the yield of terephthalic acid thus obtained was calculated to be 5.2% of the sugars contained in the blackstrap molasses.
  • the yield is a value obtained by multiplying the ratio of the amount of terephthalic acid actually obtained (yield) to the maximum amount of terephthalic acid that can be theoretically obtained (theoretical yield) by 100 and expressed as a percentage of 100.
  • PET polyethylene terephthalate
  • the temperature was raised to 220°C to distill off excess ethylene glycol. After 20 minutes from raising the temperature to 220° C., the temperature was raised to 280° C. and maintained at that temperature for 15 minutes. After that, a vacuum adapter was attached, and the pressure was gradually reduced to 0.4 hPa. After 3 hours, the reactor was cooled while introducing nitrogen gas. After cooling, vacuum drying was performed at 150° C. for 12 hours.
  • the obtained biomass resource-derived PET had good polymer properties, spinning stability, and dye exhaustion rate.
  • Example 2 Terephthalic acid and polyester were produced using starch-based edible biomass.
  • saccharification was performed because it is desirable to hydrolyze polysaccharides into monosaccharides by saccharification.
  • glucoamylase Allcoholase II L400, manufactured by Alltech
  • Example 1 After saccharification, in the main culture in Example 1, instead of blackstrap molasses, starch after enzymatic saccharification was added so that the glucose concentration was 10 wt%. Except for this, the same method as in Example 1 was used to produce terephthalic acid and polyester. The yield of terephthalic acid thus obtained was 5.1% of the added starch. In addition, the obtained biomass resource-derived PET had good polymer properties, spinning stability, and dye exhaustion rate.
  • Example 3 Terephthalic acid and polyester were produced using non-edible biomass. When non-edible biomass was used, pretreatment and saccharification treatment reduced lignin content and hydrolyzed polysaccharides to monosaccharides.
  • Example 4 Terephthalic acid and polyester were produced from p-methylacetophenone, which is a raw material derived from biomass resources.
  • the pre-culture was performed in the same manner as in Example 1, and in the main culture, p-methylacetophenone derived from biomass resources was added so that the concentration in the medium was 1 wt%.
  • Biomass resource-derived p-methylacetophenone was obtained by oxidizing citral obtained from biomass resource lemon. Oxidation of citral is performed by the method described in the literature (Ueno et al., Formation Mechanism of p-Methylacetophenone from Citral via a tert-Alkoxy Radical Intermediate. J. Agric. Food Chem., 52, 5677-5684 (2004)). gone. As a result, the yield of terephthalic acid was 1.5% of the added citral.
  • the obtained biomass resource-derived PET had good polymer properties, spinning stability, and dye exhaustion rate.
  • the yield is 1.5 to 5.2%. It was found that terephthalic acid can be produced with a yield almost equal to that produced by terephthalic acid.
  • Example 5 Benzaldehyde dehydrogenase gene, Toluate methylmonooxygenase gene, 4-carboxybenzyl alcohol dehydrogenase gene, and 4-carboxy A 4-carboxybenzaldehyde dehydrogenase gene was prepared.
  • benzaldehyde dehydrogenase a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19
  • the base sequence of the benzaldehyde dehydrogenase gene derived from Pseudomonas putida was genetically primed based on the codon usage frequency in basidiomycetes.
  • DNA was chemically synthesized and named MuBZDH.
  • MuBZDH was cloned into pUC18 (manufactured by Takara Bio Inc.) and named pMuBZDH.
  • tsaMB toluate methyl monooxygenase gene
  • tsaC 4-carboxybenzyl alcohol dehydrogenase gene
  • tsaD 4-carboxybenzaldehyde dehydrogenase gene
  • Toluate methyl monooxygenase (polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20), 4-carboxybenzyl alcohol dehydrogenase (polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21), and 4-carboxybenzaldehyde efficiently in basidiomycetes
  • dehydrogenase a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 22
  • the toluate methyl monooxygenase gene (tsaMB) derived from Comamonas testosteroni (Comamonas testosteroni), 4, based on the codon usage frequency in basidiomycetes.
  • DNA encoding toluate methyl monooxygenase optimized for basidiomycetes is MutsaMB
  • DNA encoding 4-carboxybenzyl alcohol dehydrogenase optimized for basidiomycetes is MutsaC
  • 4-carboxybenzaldehyde optimized for basidiomycetes DNAs encoding dehydrogenases were named MutsaD, respectively.
  • MutsaMB, MutsaC, and MutsaD were cloned into pUC18 (manufactured by Takara Bio Inc.), respectively, and named pMutsaMB, pMutsaC, and pMutsaD, respectively.
  • MuBZDH, MutsaMB, MutsaC, and MutsaD expression vectors were constructed using the promoter and 3′ end region of the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene (gpd) from the basidiomycete [Mycoacia uda].
  • benzaldehyde dehydrogenase gene (MuBZDH) prepared in (5-1) above in a basidiomycete [Mycoacia uda]
  • Mycoacia uda a promoter of Mycoacia uda (M. uda) glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GPD) gene promoter region was used.
  • GPD glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
  • the enzyme used for PCR was KOD plus sold by Toyobo, and the PCR reaction was carried out under the conditions of 30 cycles of 94°C for 1 minute, 60°C for 1 minute, and 72°C for 2 minutes.
  • a 1 kbp DNA fragment amplified by the PCR reaction was purified using a QIAquick PCR Purification Kit (manufactured by QIAGEN).
  • the enzyme used for PCR was KOD plus sold by Toyobo, and the PCR reaction was carried out under the conditions of 30 cycles of 94°C for 1 minute, 60°C for 1 minute, and 72°C for 2 minutes.
  • a DNA fragment amplified by the PCR reaction was purified using a QIAquick PCR Purification Kit (manufactured by QIAGEN).
  • the 3' terminal region (0.8 kbp) of the GPD gene of M. uda was used to stabilize the expression of MuBZDH.
  • a primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5 and a primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6 were used using the genomic DNA of M. uda as a template.
  • a PCR reaction was performed. KOD plus sold by Toyobo Co., Ltd. is used for the enzyme used for PCR, and the PCR reaction is carried out under the conditions of 30 cycles of 94°C for 1 minute, 60°C for 1 minute, and 72°C for 1 minute. rice field.
  • the obtained 0.8 kbp DNA fragment was purified using QIAquick PCR Purification Kit (manufactured by QIAGEN).
  • the promoter region of the Mycoacia uda glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene (gpd) amplified by the above PCR (2) the benzaldehyde dehydrogenase gene optimized for basidiomycetes, and (3) a PCR reaction was performed using the 3' terminal region of the GPD gene of Mycoacia uda. KOD plus sold by Toyobo was used as the enzyme for PCR, and the PCR reaction was carried out under the conditions of 30 cycles of 94°C for 1 minute, 60°C for 10 minutes, and 72°C for 5 minutes.
  • the DNA fragment after PCR was purified using QIAquick PCR Purification Kit (manufactured by QIAGEN).
  • a PCR reaction was performed using a primer consisting of SEQ ID NO: 1 and a primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6.
  • KOD plus sold by Toyobo Co., Ltd. was used as the PCR enzyme, and the PCR reaction was carried out under the conditions of 30 cycles of 94°C for 1 minute, 60°C for 1 minute, and 72°C for 5 minutes.
  • the DNA fragment after PCR was purified using QIAquick PCR Purification Kit (manufactured by QIAGEN).
  • cloning was performed using TOPO TA Cloning Kit (manufactured by Invitrogen).
  • the resulting vector was named pGPDMuBZDH.
  • the obtained DNA fragment was subjected to a PCR reaction using a nucleotide sequence analysis reagent manufactured by Applied Biosystems, and the reaction product was subjected to a DNA sequencer ABI PRISM 310 automated nucleotide sequencer manufactured by Applied Biosystems. was analyzed using
  • (6-2) a toluate methyl monooxygenase gene expression vector using the promoter and 3' end region of the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene (gpd) derived from a basidiomycete [Mycoacia uda], Construction of 4-carboxybenzyl alcohol dehydrogenase gene expression vector and 4-carboxybenzaldehyde dehydrogenase gene expression vector 4-carboxybenzyl alcohol dehydrogenase gene (MutsaC) for the basidiomycete [Mycoacia uda)] and 4-carboxybenzaldehyde dehydrogenase gene (MutsaD) for the basidiomycete [Mycoacia uda].
  • gpd glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene
  • the promoter of the GPD gene derived from Mycoacia uda is ligated, and the 3' terminal region of the GPD gene derived from Basidiomycete [Mycoacia uda] is ligated to the 3' end of each of these genes, and toluate is added.
  • a methylmonooxygenase gene expression vector pGPDMutsaMB
  • pGPDMutsaC 4-carboxybenzyl alcohol dehydrogenase gene expression vector
  • pGPDMutsaD 4-carboxybenzaldehyde dehydrogenase gene expression vector
  • a vector containing a toluate methyl monooxygenase gene (pMutsaMB) and a 4-carboxybenzyl alcohol dehydrogenase gene are used instead of pMuBZDH in the above (6-1) method for producing pGPDMuBZDH.
  • a vector (pMutsaC) containing 4-carboxybenzaldehyde dehydrogenase gene and a vector (pMutsaD) containing the 4-carboxybenzaldehyde dehydrogenase gene were used as templates for PCR reaction.
  • a primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7 were used to amplify the gpd promoter of Mycoacia uda.
  • a primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 8 and a primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9 were used to generate Mycosia uda (M uda)
  • a primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6 and a primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 10 were used to amplify GPDMutsaMB.
  • a primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6 were used.
  • the PCR reaction conditions other than the primers are the same as in (6-1) above.
  • the DNA fragment after the PCR reaction was purified using QIAquick PCR Purification Kit (manufactured by QIAGEN) and then cloned using TOPO TA Cloning Kit (manufactured by Invitrogen).
  • the resulting vector was named pGPDMutsaMB.
  • a primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 11 were used to amplify the gpd promoter of Mycoacia uda.
  • a primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 12 and a primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 13 were used to obtain Mycosia uda.
  • Amplification of the 3′-terminal region (0.8 kbp) of the gpd gene of (M. uda) was performed using a primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6 and a primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 14.
  • GPDMutsaC For the amplification of , a primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6 were used.
  • the PCR reaction conditions other than the primers are the same as in (6-1) above.
  • the DNA fragment after PCR reaction was purified using QIAquick PCR Purification Kit (manufactured by QIAGEN) and then cloned using TOPO TA Cloning Kit (manufactured by Invitrogen).
  • the resulting vector was named pGPDMutsaC.
  • a primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 15 were used for amplification of the gpd promoter of Mycoacia uda.
  • a primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 16 and a primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 17 were used to generate Mycosia uda (M uda)
  • a primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6 and a primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 18 were used to amplify GPDMutsaD.
  • a primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6 were used.
  • the PCR reaction conditions other than the primers are the same as in (6-1) above.
  • the DNA fragment after PCR reaction was purified using QIAquick PCR Purification Kit (manufactured by QIAGEN).
  • cloning was performed using TOPO TA Cloning Kit (manufactured by Invitrogen).
  • the resulting vector was named pGPDMutsaD.
  • Example 7 A transformed strain of Mycoacia uda was prepared for the biosynthesis of terephthalic acid from biomass resources.
  • SMY medium 200 mL of SMY medium is dispensed into a 1-L Erlenmeyer flask, a rotor is added, and after sterilization, the pre-cultured mycelium is filtered through a nylon mesh (30 ⁇ m pore size), and the entire amount is inoculated and cultured at 26°C. did.
  • the mycelium was finely divided by stirring with a stirrer for about 2 hours a day. This culture was carried out for 7 days.
  • the precipitate was suspended in 500 ⁇ L of a solution of 20 mM MES buffer (pH 6.4) containing 1 M sorbitol and 40 mM calcium chloride to form a protoplast suspension. This suspension was stored at 4°C. Protoplast concentration was determined by direct microscopy using a hemocytometer. All centrifugation was performed in a swing rotor at 1,000 g for 5 minutes at room temperature.
  • benzaldehyde dehydrogenase gene expression vector (pGPDMuBZDH), toluate methyl monooxygenase gene expression vector (pGPDMutsaMB), 4-carboxybenzyl alcohol dehydrogenase gene expression vector (pGPDMutsaC), and 4-carboxybenzaldehyde dehydrogenase gene expression vector (pGPDMutsaD ) Transformation of Mycoacia uda using (6-1) and (6-2) for 100 ⁇ L of the protoplast suspension of about 100/100 ⁇ L purified in (7-3) above Benzaldehyde dehydrogenase gene expression vector (pMuBZDH), toluate methyl monooxygenase gene expression vector (pGPDMutsaMB), 4-carboxybenzyl alcohol dehydrogenase gene expression vector (pGPDMutsaC), and 4-carboxybenzaldehyde dehydrogenase gene expression vector (pGPDMutsaD
  • Benzaldehyde dehydrogenase gene expression vector (pGPDMuBZDH), toluate methyl monooxygenase gene expression vector (pGPDMutsaMB), 4-carboxybenzyl alcohol dehydrogenase gene expression vector (pGPDMutsaC) using the basidiomycete [Mycoacia uda]-derived GPD promoter , and a 4-carboxybenzaldehyde dehydrogenase gene expression vector (pGPDMutsaD) were cultured in the presence of sugar-rich edible biomass to produce terephthalic acid.
  • the transformant prepared in (7-4) above was cultured on a potato dextrose agar medium at 26°C and then stored at 4°C. Preculture and main culture were performed in the same manner as in Example 1. Terephthalic acid contained in the culture medium in the main culture was quantified by HPLC analysis according to a known method [Luo, Z., Lee, S. Biotransformation of p-xylene into terephthalic acid by engineered Escherichia coli. 8, 15689 (2017).)].
  • the yield of terephthalic acid was 5.0% of the sugars contained in blackstrap molasses.
  • the obtained biomass resource-derived PET had good polymer properties, spinning stability, and dyeability.
  • a transformant produced as a comparative example into which only the carboxin-resistant gene derived from Mycoasia uda was introduced did not produce terephthalic acid.
  • Hydnophlebia chrysorhiza was cultured in the presence of the used edible biomass containing a large amount of sugars, p-tolualdehyde was produced, and then terephthalic acid and polyester were produced by chemical synthesis.
  • Example 1 Instead of the microorganism (Mycoacia uda ATCC76971) used in Example 1, Hydnophlebia chrysorhiza FD-282 was used, and terephthalic acid and polyester were produced using blackstrap molasses as the raw material in the same manner as in Example 1.
  • the yield of terephthalic acid was 4.8% of the sugars contained in the blackstrap molasses.
  • the obtained biomass resource-derived PET had good polymer properties, spinning stability, and dyeability.
  • the method of the present invention can produce terephthalic acid with a relatively high yield, can be produced at a mild temperature, and reduces energy consumption compared to conventional methods. be able to.
  • the method of the present invention can produce terephthalic acid or produce terephthalic acid in a small number of steps, such as a step of converting a biomass resource or a compound derived from a biomass resource into p-tolualdehyde by a microorganism, compared to a conventional method.
  • Terephthalic acid can be produced in one step by biotransforming terephthalic acid from the p-tolualdehyde produced therein. Since expensive furnaces, fractionators, etc.
  • p-tolualdehyde and terephthalic acid are produced by culturing microorganisms, it is also possible to provide cultured and proliferated microorganisms.

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Abstract

本発明の課題は、エネルギー消費量を低減させつつ、工程数が少なく、テレフタル酸の収率を向上させ、安価にバイオマス資源からテレフタル酸を製造できる方法及びポリエステルを製造する方法を提供することにある。　テレフタル酸の製造方法は、バイオマス資源、あるいはバイオマス資源由来の化合物を、微生物によりｐ－トルアルデヒドに変換する工程を含む。ポリエステルの製造方法は、バイオマス資源から製造されたテレフタル酸とジオール化合物を反応させてポリエステルを製造する工程を含む。

Description

バイオマス資源からのテレフタル酸の製造方法及びバイオマス資源からのポリエステルの製造方法
　本発明は、バイオマス資源からテレフタル酸を製造する方法及びバイオマス資源からポリエステルを製造する方法に関する。
　ポリエステルの原料であるテレフタル酸は、従来、化石資源である原油由来のナフサの熱分解工程とその後の蒸留工程によりｐ－キシレンを得た後、ｐ－キシレンを化学的に酸化することで製造されている。化石資源は、将来的に枯渇の懸念があるのに加え、燃焼時に地球温暖化の原因となる二酸化炭素排出量を増加させるという問題がある。
　一方、バイオマス資源は、再生可能な資源であるのに加え、光合成により大気中の二酸化炭素を固定化することができるため、バイオマス資源から製造したテレフタル酸及びポリエステルは、化石資源を原料としたテレフタル酸及びポリエステルと比較して、二酸化炭素排出量の削減が見込まれる。このため、バイオマス資源からテレフタル酸及びポリエステルを製造する方法が提案されている（例えば、特許文献１～３、非特許文献１～３参照）。
　ポリエステルは、機械的強度、化学的安定性、透明性に優れ、かつ安価であるために、各種の繊維、フィルム、シート、容器等として世界中で最も多く使用されている合成樹脂の一つである。ポリエステルは、多価カルボン酸と多価アルコールとが重縮合することにより得られる高分子化合物である。多価カルボン酸としてテレフタル酸を利用したポリエステルには、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリトリメチレンテレフタレート（ＰＴＴ）、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）、ポリブチレンアジペートテレフタレート（ＰＢＡＴ）、ポリブチレンテレフタレートサクシネート（ＰＥＴＳ）等がある。ＰＥＴは繊維、ペットボトルやフィルム等に利用されている。また、ＰＴＴは繊維などに、ＰＢＴは射出成形部品等に利用されている。ＰＢＡＴ及びＰＥＴＳは生分解性ポリマーとして利用されている。
特開２０１４－１２５７号公報 特開２０１５－１９３６４７号公報 国際公開第２０１３／１１１７８２号
"植物由来原料１００％使用ペットボトルの開発に向けた実証プラントを米国で建設決定"、[online]、サントリーホールディングス株式会社　サントリー食品インターナショナル株式会社、［令和２年１２月１５日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：https://www.suntory.co.jp/news/article/12563.html＞ "東レ、植物１００％の合成繊維"、[online]、株式会社　日本経済新聞社、［令和２年１２月１５日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：https://www.nikkei.com/nkd/company/article/?DisplayType=1&ng=DGKKZO55934740R20C20A2TJC000&scode=3401&ba=1＞ "ＰＥＴ樹脂の原料を食用に適さないバイオマス資源から作る方法を開発"、[online]、国立研究開発法人科学技術振興機構（ＪＳＴ）　国立大学法人群馬大学、［令和２年１２月１５日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：https://www.jst.go.jp/pr/announce/20150204/index.html＞
　上記のように、バイオマス資源を原料として用いてテレフタル酸を製造する方法、バイオマス資源から製造したテレフタル酸を用いたポリエステルの製造法が開示されているが、これらの方法はいずれもテレフタル酸製造時のエネルギー消費量が多く、工程数が多いという問題がある。
　テレフタル酸製造時のエネルギー消費量に関しては、上記特許文献１～３及び非特許文献１～３に記載の方法では、バイオマス資源からｐ－キシレンを得るための工程において数百度の高温による熱分解反応工程、脱水反応工程、環化反応工程、芳香族化工程等を行うため、エネルギー消費量が多いという問題がある。また、上記特許文献３においては、バイオマス資源からｐ－トルアルデヒドの製造方法が開示されているが、上記と同様に４００℃の高温により芳香族化工程の反応を行うため、エネルギー消費量が多いという問題がある。
　また、上記特許文献１～３及び非特許文献１～３に記載の方法では、バイオマス資源からテレフタル酸を製造する工程において、工程数が多いという問題がある。特許文献２で開示されているｐ－キシレン製造方法では化学変換工程が３工程と長いため、化学変換に大掛かりな設備と大きな経済的負担が必要となる。また、特許文献２で開示されているｐ－キシレン製造工程においては、化学変換工程が２工程であるため、同じく化学変換への設備と経済的負担が大きい。非特許文献３においては、フルフラールからテレフタル酸の化学変換工程が５工程あるため、上記と同じく大掛かりな設備と大きな経済的負担が必要となる。バイオマス資源からｐ－キシレンの製造方法が開示されている上記特許文献２、３においては、テレフタル酸の製造のために、少なくとも更なる１つの化学変換工程が必要である。
　本発明は、上記課題に鑑み鋭意検討を行った結果、低エネルギー消費量、短工程でバイオマス資源あるいはバイオマス資源由来の化合物を、微生物によりｐ－トルアルデヒドに変換する工程を含むテレフタル酸の製造方法、ポリエステルの製造方法を見いだした。また、ｐ－トルアルデヒドを生産する微生物に、ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ、トルエートメチルモノオキシゲナーゼ、４－カルボキシベンジルアルコールデヒドロゲナーゼ、及び４－カルボキシベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼの４種類の酵素をコードする遺伝子群を遺伝子導入することにより得られた形質転換体を用いると、形質転換体中で生成されたｐ－トルアルデヒドから、テレフタル酸をバイオトランスフォーメーションできることも確認した。本発明はこれらの知見に基づき、完成するに至ったものである。
　すなわち、本発明は以下のとおりである。
〔１〕バイオマス資源、あるいはバイオマス資源由来の化合物を、微生物によりｐ－トルアルデヒドに変換する工程を含む、テレフタル酸の製造方法。
〔２〕前記バイオマス資源由来の化合物が、シキミ酸、１－ｐ－トリルエタノール、ｐ－メチルアセトフェノン、ｐ－メチルベンジルアルコールの少なくとも１つである、上記〔１〕に記載のテレフタル酸の製造方法。
〔３〕前記バイオマス資源が前処理工程若しくは糖化工程又はその両方の工程により処理されたバイオマス資源である、上記〔１〕又は〔２〕に記載のテレフタル酸の製造方法。
〔４〕前記バイオマス資源が、可食性バイオマス、可食性バイオマス由来の単糖類若しくは多糖類、非可食性バイオマス、非可食性バイオマス由来の単糖類若しくは多糖類のいずれか１つ以上である、上記〔１〕～〔３〕のいずれかに記載のテレフタル酸の製造方法。
〔５〕前記可食性バイオマスが、トウモロコシ、サツマイモ、米、ジャガイモ、コムギ、オオムギ、タピオカ、サトウキビ、ビート、糖蜜、ハイテスト・モラセスから選択される少なくとも１種類のバイオマスを含む、上記〔４〕に記載のテレフタル酸の製造方法。
〔６〕前記非可食性バイオマスが、草本系バイオマス、木質系バイオマス、紙、パルプ、古紙、バガス、コーンストーバーから選択される少なくとも１種類のバイオマスを含む、上記〔４〕に記載のテレフタル酸の製造方法。
〔７〕アミラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、リグニン分解酵素から選択される少なくとも１種類の酵素を培地に添加する工程を含む、上記〔１〕～〔６〕のいずれかに記載のテレフタル酸の製造方法。
〔８〕前記ｐ－トルアルデヒドを、微生物を利用して生物学的に酸化し、テレフタル酸を製造する、上記〔１〕～〔７〕のいずれかに記載のテレフタル酸の製造方法。
〔９〕前記微生物が、ｐ－トルアルデヒドの生成に使用した微生物と同じであり、かつ、ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ、トルエートメチルモノオキシゲナーゼ、４－カルボキシベンジルアルコールデヒドロゲナーゼ、及び４－カルボキシベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼの４種類の酵素をコードする遺伝子群が遺伝子導入された微生物である、上記〔８〕に記載のテレフタル酸の製造方法。
〔１０〕前記微生物が、フレビア　ウダ（Phlebia uda）又はヒイロハリタケ（Hydnophlebia chrysorhiza）である、上記〔１〕～〔９〕のいずれかに記載のテレフタル酸の製造方法。
〔１１〕上記〔１〕～〔１０〕のいずれかに記載のテレフタル酸の製造方法により製造されたテレフタル酸とジオール化合物を反応させてポリエステルを製造する工程を含む、ポリエステルの製造方法。
〔１２〕ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ、トルエートメチルモノオキシゲナーゼ、４－カルボキシベンジルアルコールデヒドロゲナーゼ、及び４－カルボキシベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼの４種類の酵素をコードする遺伝子群が遺伝子導入された微生物であって、バイオマス資源又はバイオマス資源由来の化合物からｐ－トルアルデヒドを生産できる、前記微生物（以下、「本件微生物」ということがある）。
〔１３〕前記ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼが、配列番号１９に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつ、ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を保持し、
前記トルエートメチルモノオキシゲナーゼが、配列番号２０に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつ、トルエートメチルモノオキシゲナーゼ活性を保持し、
前記４－カルボキシベンジルアルコールデヒドロゲナーゼが、配列番号２１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつ、４－カルボキシベンジルアルコールデヒドロゲナーゼ活性を保持し、
前記４－カルボキシベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼが、配列番号２２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつ、４－カルボキシベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を保持する、
上記〔１２〕に記載の微生物。
〔１４〕前記微生物が、フレビア　ウダ（Phlebia uda）又はヒイロハリタケ（Hydnophlebia chrysorhiza）である、上記〔１２〕又は〔１３〕に記載の微生物。
〔１５〕ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ、トルエートメチルモノオキシゲナーゼ、４－カルボキシベンジルアルコールデヒドロゲナーゼ、及び４－カルボキシベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼの４種類の酵素をコードする遺伝子群を、微生物に遺伝子導入する工程を含む、前記遺伝子群が遺伝子導入された微生物を作製する方法であって、前記微生物が、バイオマス資源又はバイオマス資源由来の化合物からｐ－トルアルデヒドを生産できる微生物である、前記方法（以下、「本件微生物の作製方法」ということがある）。
〔１６〕前記ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼが、配列番号１９に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつ、ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を保持し、
前記トルエートメチルモノオキシゲナーゼが、配列番号２０に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつ、トルエートメチルモノオキシゲナーゼ活性を保持し、
前記４－カルボキシベンジルアルコールデヒドロゲナーゼが、配列番号２１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつ、４－カルボキシベンジルアルコールデヒドロゲナーゼ活性を保持し、
前記４－カルボキシベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼが、配列番号２２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつ、４－カルボキシベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を保持する、
上記〔１５〕に記載の方法。
〔１７〕前記微生物が、フレビア　ウダ（Phlebia uda）又はヒイロハリタケ（Hydnophlebia chrysorhiza）である、上記〔１５〕又は〔１６〕に記載の方法。
　本発明によれば、微生物を用いた発酵法を用いることにより常温でバイオマス資源をｐ－トルアルデヒドに変換することができるため、エネルギー消費量を大幅に低減させることができる。また、本発明では、バイオマス資源から微生物の発酵による１工程によりテレフタル酸と同じ炭素骨格を有するｐ－トルアルデヒドを生産することができるため、テレフタル酸を生産する際の工程数を少なくすることができる。また、ｐ－トルアルデヒドを生産する微生物に、ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ、トルエートメチルモノオキシゲナーゼ、４－カルボキシベンジルアルコールデヒドロゲナーゼ、及び４－カルボキシベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼの４種類の酵素をコードする遺伝子群を遺伝子導入することにより得られた形質転換体を用いると、形質転換体中で生成されたｐ－トルアルデヒドから、テレフタル酸をバイオトランスフォーメーションできるため、バイオマス資源から１工程でテレフタル酸を製造でき、エネルギー消費量を大幅に低減させることができる。このため、他の公知の方法と比べて設備費を抑制することができ、経済的負担が少ない。さらには、本方法により製造されたポリエステルの製造法の提供も可能となる。
テレフタル酸及びポリエステルの製造方法の概略を説明する図。 テレフタル酸及びポリエステルの製造フローの第１の例を示した図。 培養装置の構成例を示した図。 テレフタル酸及びポリエステルの第２の製造フローの第２の例を示した図。 テレフタル酸及びポリエステルの第３の製造フローの第３の例を示した図。
　図１を参照して、テレフタル酸及びポリエステルの製造方法の概略を説明する。図１（ａ）は、従来の方法を説明する図で、図１（ｂ）は、本発明の方法を説明する図である。なお、ここでは、ポリエステルの一例として、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）を製造するものとして説明する。
　従来の方法では、テレフタル酸の原料として原油等の化石資源が使用される。原油を精製して得られるナフサ等を原料として用い、高温で熱分解し、分留装置により分留し、中間生成物としてｐ－キシレンを得る。ｐ－キシレンをコバルト、マンガン、臭素等の触媒下で空気を供給して酸化し、テレフタル酸を製造する。
　製造されたテレフタル酸を、エチレンから生成されたエチレングリコールに溶解させ、重縮合させることにより、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）を製造する。
　一方、本発明の方法は、原料として化石資源ではなく、バイオマス資源又はバイオマス資源由来の化合物を使用する。具体的には、本発明の方法は、微生物をバイオマス資源又はバイオマス資源由来の化合物の存在下で培養する工程を含むものである。かかる培養は、例えば、微生物を、バイオマス上に固体培養する；寒天、ゲランガム、アガロース等により固化した培養培地の上に静置する；及び／又は、液体状の培養培地中に静置若しくは液体状の培養培地中で振盪する；ことにより行うことができる。また、培養は、適切な培養培地、適切な培養温度、適切な培養期間などの条件下で行うことができる。上記培養培地としては、微生物の生存、増殖可能な培地であれば特に制限されず、例えば、ポテトデキストロース寒天（ＰＤＡ）培地、麦芽エキス寒天（ＭＡ）培地、ＬＢ寒天培地、ＬＢ液体培地、ＹＭ液体培地、ＴＢ液体培地等を挙げることができる。
　上記培養温度としては、特に制限されず、例えば、１５～４０℃の範囲内であり、好ましくは２０～３８℃、より好ましくは２２～３０℃、さらに好ましくは２４～２８℃である。
　上記培養期間としては、特に制限されず、例えば、４～４０日間の範囲内、好ましくは５～３５日間、より好ましくは５～３０日間、さらに好ましくは１０～２０日間である。
　微生物を振盪条件下で培養する場合の振盪速度としては、例えば、６０～３００ｒｐｍの範囲内、好ましくは８０～１２０ｒｐｍである。
　微生物が自己の酵素でバイオマス資源又はバイオマス資源由来の化合物を分解あるいは変化させ、中間生成物としてテレフタル酸と同じ炭素骨格を有するｐ－トルアルデヒドを生成する。したがって、本発明の実施の他の形態として、微生物をバイオマス資源又はバイオマス資源由来の化合物の存在下で培養する工程を含む、ｐ－トルアルデヒドの生成方法を挙げることができる。かかる生成方法を実施後、ｐ－トルアルデヒドを含む培養液は、加熱後、コンデンサー等により冷却することでｐ－トルアルデヒドを含む溶液を回収することができる。また、微生物を培養している培養槽の排出ガスを、コンデンサー等を用いて冷却することで、培養を行いながらｐ－トルアルデヒドを回収することができる。また、有機溶剤による抽出より、ｐ－トルアルデヒドを含む培養液からｐ－トルアルデヒドの回収を行うことができる。有機溶剤の種類としては、水と完全に混和しなければどのようなものでもよく、例えば石油エーテル、ヘキサン、酢酸エチル、クロロホルム、４－メチルテトラヒドロピランを利用できる。また、微生物の生育を大きく阻害しなければ、培養時にこれらの有機溶剤を添加してもよい。ｐ－トルアルデヒドを所望の濃度に増加させるには、クロマトグラフィー、蒸留等の精製方法を用いることができる。その後、得られたｐ－トルアルデヒドを酸化し、テレフタル酸を製造する。このとき、上記のように空気を供給して化学的に酸化してもよいが、テレフタル酸を低エネルギー消費量でかつ、短工程で製造する観点から、微生物（好ましくは、ｐ－トルアルデヒドの生成に使用した同じ微生物）を利用して生物学的に酸化する方法が好ましい。ｐ－トルアルデヒドを生物学的にテレフタル酸に酸化をする場合には、上記の方法で精製後のｐ－トルアルデヒドをテレフタル酸に酸化してもよいし、ｐ－トルアルデヒドを生成する微生物と、ｐ－トルアルデヒドをテレフタル酸に酸化する微生物とを共培養することで、ｐ－トルアルデヒドをテレフタル酸に酸化してもよい。
　ｐ－トルアルデヒドを、微生物を利用して生物学的に酸化する方法としては、例えば、以下の式（Ｉ）～（IV）に示す化学反応により、微生物中で生成されたｐ－トルアルデヒドから、テレフタル酸をバイオトランスフォーメーションする方法を挙げることができる。この方法を利用してテレフタル酸を製造する場合、上記微生物としては、４種類の酵素（以下の式（Ｉ）に示す化学反応を触媒するベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ［ＢＺＤＨ；benzaldehyde dehydrogenase］；以下の式（II）に示す化学反応を触媒するトルエートメチルモノオキシゲナーゼ［ＴｓａＭＢ；toluate methylmonooxygenase］；以下の式（III）に示す化学反応を触媒する４－ＣＢＡＬデヒドロゲナーゼ［ＴｓａＣ］；及び以下の式（IV）に示す化学反応を触媒する４－ＣＢＡデヒドロゲナーゼ［ＴｓａＤ］）を発現するものが好ましい（文献「Nat Commun. 2017 May 31;8:15689.」）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
　微生物が、上記４種類の酵素（ＢＺＤＨ、ＴｓａＭＢ、ＴｓａＣ、及びＴｓａＤ）を発現する微生物でない場合、上記４種類の酵素をコードする遺伝子群が遺伝子導入された微生物であって、バイオマス資源又はバイオマス資源由来の化合物からｐ－トルアルデヒドを生産できる微生物（すなわち、本件微生物）が好ましい。本件微生物は、上記４種類の酵素をコードする遺伝子（ポリヌクレオチド）群を、バイオマス資源又はバイオマス資源由来の化合物からｐ－トルアルデヒドを生産できる微生物に遺伝子導入する工程を含む方法（すなわち、本件微生物の作製方法）を実施することにより得ることができる。かかる遺伝子導入する方法としては、例えば、カルシウムイオンを用いる方法、一般的なコンピテントセル形質転換法、プロトプラスト形質転換法、エレクトロポレーション法を挙げることができる。
　微生物に遺伝子導入する上記４種類の酵素をコードする遺伝子群は、より具体的には、その上流にプロモーターが作動可能となるように連結されたベクター（同一のベクター、又はそれぞれ別々のベクター）中に含まれる。かかるベクターとしては、遺伝子発現効率をさらに高めるために、エンハンサー領域やリボソーム結合領域（ＲＢＳ；ribosome binding site）の塩基配列をさらに含むものや、形質転換株のスクリーニングのために、カルボキシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子（選択マーカー遺伝子）をさらに含むものであってもよい。エンハンサー領域は、通常プロモーターの上流に配置され、ＲＢＳは、通常プロモーターと上記４種類の酵素をコードする遺伝子群の間に配置される。
　本明細書において、「プロモーター」とは、ＲＮＡポリメラーゼ（好ましくは、ＲＮＡポリメラーゼ及び基本転写因子）が結合し、その下流に位置する遺伝子がコードするｍＲＮＡの転写を開始させる領域を意味する。
　上記４種類の酵素をコードする遺伝子の由来としては、特に制限されず、例えば、ＢＺＤＨをコードする遺伝子の場合、Pseudomonas putida由来のＢＺＤＨ（好ましくは、配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつ、ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性［具体的には、上記式（Ｉ）に示す化学反応を触媒する活性］を保持するポリペプチド）をコードする遺伝子、Novosphingobium（Sphingomonas） aromaticivorans由来のＢＺＤＨ（好ましくは、配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつ、ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性［具体的には、上記式（Ｉ）に示す化学反応を触媒する活性］を保持するポリペプチド）をコードする遺伝子、これら遺伝子のオーソログ等を挙げることができ、また、ＴｓａＭＢをコードする遺伝子の場合、例えば、Comamonas testosteroni由来のＴｓａＭＢ（好ましくは、配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつ、トルエートメチルモノオキシゲナーゼ活性［具体的には、上記式（II）に示す化学反応を触媒する活性］を保持するポリペプチド）をコードする遺伝子、かかる遺伝子のオーソログ等を挙げることができ、また、ＴｓａＣをコードする遺伝子の場合、例えば、Comamonas testosteroni由来のＴｓａＣ（好ましくは、配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつ、４－カルボキシベンジルアルコールデヒドロゲナーゼ活性［具体的には、上記式（III）に示す化学反応を触媒する活性］を保持するポリペプチド）をコードする遺伝子、かかる遺伝子のオーソログ等を挙げることができ、また、ＴｓａＤをコードする遺伝子の場合、例えば、Comamonas testosteroni由来のＴｓａＤ（好ましくは、配列番号２２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつ、４－カルボキシベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性［具体的には、上記式（IV）に示す化学反応を触媒する活性］を保持するポリペプチド）をコードする遺伝子、かかる遺伝子のオーソログ等を挙げることができる。
　上記４種類の酵素をコードする遺伝子のヌクレオチド配列は、上記４種類の酵素のアミノ酸配列と、各種微生物に対応する公知のコドン表を参照することにより、当業者であれば、上記４種類の酵素のアミノ酸配列に対応するヌクレオチド配列を具体的かつ明確に把握することができる。
　テレフタル酸からポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）を製造する方法は、従来の方法を用いることができる。本発明で用いることができるエチレングリコールは、化石資源由来のエチレングリコールでもよいが、地球温暖化の要因となる二酸化炭素排出量を軽減させるために、バイオマス資源から製造したバイオエタノール由来のバイオエチレングリコールを用いることが望ましい。
　このように、本発明の方法では、原料としてバイオマス資源を使用し、微生物の培養を利用してテレフタル酸を製造するため、従来の高温での熱分解等の反応を行う必要がなく、エネルギー消費量を大幅に低減させることができる。また、熱分解を行う炉等の高価な装置を必要としないため、安価でテレフタル酸及びポリエステルを製造することができる。
　以下、図を参照して、本発明の方法を詳細に説明する。図２は、テレフタル酸及びポリエステルの製造フローの第１の例を示した図である。図２に示す例では、バイオマス資源として、糖類を含む可食性バイオマスを使用し、バイオマス資源由来の化合物として、糖類を使用する。可食性バイオマスは、光合成により成長するバイオマス資源であって、食べることができる（食用の）バイオマス資源である。糖類は、生物のエネルギー源となる栄養素である単糖類若しくは二糖類で、例えば、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、アラビノース、キシロース、スクロース、マルトース等である。また、糖類にはオリゴ糖を含んでいてもよい。
　糖類を多く含む可食性バイオマスとしては、特に制限されず、例えば、サトウキビ、ブドウ、ビート、糖蜜、ハイテスト・モラセス等を挙げることができる。糖類を含む可食性バイオマスは、上記のいずれか１種類のみを使用してもよいし、２種類以上を使用してもよい。
　ステップ１００から開始し、ステップ１０１では、微生物が培養される培養装置に、糖類を含む可食性バイオマスを添加する。培養装置は、微生物を培養する培地を有する反応槽を含む。その後、オートクレーブや蒸気等により培養装置又は培地成分を滅菌してもよい。培養装置には、糖類を含む可食性バイオマスのほか、バイオマス資源由来のシキミ酸、１－ｐ－トリルエタノール、ｐ－メチルアセトフェノン、ｐ－メチルベンジルアルコールを添加してもよい。バイオマス資源からのｐ－メチルアセトフェノン製造方法としては、バイオマス資源由来の糖類を本発明による微生物の発酵により生産することもできるが、バイオマス資源であるレモン等の柑橘類に含まれるシトラールを酸化することにより調製することができる。
　ステップ１０２では、培養装置内の微生物が、可食性バイオマスに含まれる糖類からｐ－トルアルデヒドを生成する。微生物が糖類から糖類とは異なる、図１（ｂ）に示すｐ－トルアルデヒドのような中間生成物を生成することは、発酵と呼ばれる。
　培養する微生物は、糖類からｐ－トルアルデヒドを生成できる微生物であればいかなる微生物であってもよい。また、シキミ酸、１－ｐ－トリルエタノール、ｐ－メチルアセトフェノン、ｐ－メチルベンジルアルコールを培養装置に添加してもよい。
　本発明に用いることができる微生物としては、バイオマス資源又はバイオマス資源由来の化合物を原料とし、ｐ－トルアルデヒド生成能を有する微生物であれば特に制限されず、具体的には、例えば、Meruliaceae科に属する微生物を挙げることができ、Meruliaceae科に属する微生物としては、例えば、Abortiporus属、Amaurohydnum属、Amauromyces属、Aquascypha属、Aurantiopileus属、Aurantiporus属、Bjerkandera属、Bulbillomyces属、Ceriporiopsis属、Cerocorticium属、Chrysoderma属、Climacodon属、Columnodontia属、Conohypha属、Coralloderma属、Crustoderma属、Crustodontia属、Cyanodontia属、Cymatoderma属、Diacanthodes属、Elaphroporia属、Gyrophanopsis属、Hydnophlebia属、Hyphoderma属、Hyphodontiastra属、Hypochnicium属、Irpex属、Lilaceophlebia属、Luteoporia属、Merulius属、Mycoacia属、Mycoaciella属、Mycoleptodonoides属、Niemelaea属、Odoria属、Phlebia属、Phlebiporia属、Pirex属、Podoscypha属、Radulodon属、Sarcodontia属、Scopuloides属、Stegiacantha属、Uncobasidium属に属する微生物を挙げることができ、Phlebia属に属する微生物（例えば、Phlebia albida、Phlebia aurea、Phlebia brevispora、Phlebia centrifuga、Phlebia chrysocreas、Phlebia coccineofulva、Phlebia floridensis、Phlebia hydnoidea、Phlebia lindtneri、Phlebia lividina、Phlebia ludoviciana、Phlebia nantahaliensis、Phlebia nitidula、Phlebia setulosa、Phlebia subochracea、Phlebia uda）や、Hydnophlebia属に属する微生物（例えば、Hydnophlebia alachuana、Hydnophlebia canariensis、Hydnophlebia gorgonea、Hydnophlebia meloi、Hydnophlebia ominivora、Hydnophlebia sinensis、Hydnophlebia subchrysorhiza、Hydnophlebia chrysorhiza）が好ましく、Phlebia uda（本実施例で使用した「Mycoacia uda」に相当）やHydnophlebia chrysorhizaを好適に例示することができる。これらの微生物は自然界から単離することで取得することができる。また、ＡＴＣＣ（American Type Culture Collection）等で入手することもできる。また、これらの微生物の物理的あるいは化学的な変異処理を行い、ｐ－トルアルデヒド高生産株を作製し、作製した高生産株を用いることもできる。
　微生物の培養方法としては、バッチ培養法、流加培養法、連続培養法等の公知の発酵方法を用いて培養することができる。微生物の培養によって得られたｐ－トルアルデヒドはテレフタル酸に変換する前に精製して純度を高めることができる。ｐ－トルアルデヒドの精製方法はｐ－トルアルデヒドの純度を高める方法であれば、どのような方法も用いることができる。例えばｐ－トルアルデヒドの精製方法としては、固液分離、蒸留、晶析、脱色、脱塩等の化学製品を精製する方法のいずれか１つ若しくは複数の組み合わせにより実施することができる。また、精製方法は、膜分離、クロマトグラフィー等の分離技術を使用して実施することも可能である。
　バッチ培養法は、図３（ａ）に示すように、発酵を開始する時に反応槽１０内に培地組成物を仕込み、培地成分の滅菌をオートクレーブや蒸気等により行った後、微生物を培地１１に植菌し、ｐＨ、酸素濃度、温度等を調整しながら微生物の培養を行う方法である。反応槽１０は、培地１１の濃度や溶存酸素濃度を均一に保ち、培地中に酸素を供給するための撹拌機１２を備えている。また、反応槽１０の下部から滅菌された空気を供給することが望ましい。バッチ培養法は、微生物の栄養分となる炭素源等を追加しないため、栄養分の枯渇により増殖、成長が停止する。このため、バッチ培養法では、微生物が誘導期から対数増殖期を経て最終的に成長速度が減少又は停止する定常期に入る。
　誘導期は、微生物が環境に順応していない段階で、増殖がほとんど行われていない期間である。誘導期の時間を短くするために、前培養として微生物を予め適切な条件において増殖させることで微生物の量を増加させた後、微生物を含む培地を数％程度添加することが望ましい。対数増殖期は、微生物の増殖が指数関数的あるいは対数的に起こる時期である。炭素源は、可食性バイオマスに含まれる糖類や、反応槽内に添加されるシキミ酸等である。培養後の菌体は無菌的に回収を行うことで、次のバッチ培養に使用することができる。
　流加培養法は、発酵プロセスが進行するに従い、徐々に炭素源を添加する方法である。このため、流加培養法では、図３（ｂ）に示すように、炭素源を貯留するための貯留槽１３と、貯留槽１３から炭素源を反応槽１０へ供給するポンプ１４とを備える。流加培養法は、カタボライト抑制により微生物の代謝が抑制される傾向にあり、培地中の炭素源の量を制限することが好ましい場合に有用な方法である。ここで、カタボライト抑制とは、培地に加えた炭素源により、特定の酵素合成率が低下する現象である。
　連続培養法は、一定の速度で反応槽に所定量の培地を連続的に供給しながら、同時に同量の培養液を抜き取る方法である。このため、連続培養法では、図３（ｃ）に示すように、培地１１を供給するポンプ１５と、反応槽１０から培養液を抜き取るポンプ１６とを備える。また、連続培養法では、連続的に培地の一部又は全部を入れ換えて、栄養分を補給することができ、微生物の生育に悪影響を及ぼす可能性のある代謝副産物や死細胞の蓄積を防ぐことができる。
　本発明に用いる微生物は、担体結合法、架橋法、包括法等の公知の方法を用いて固定化を行い、利用することができる。また、本発明に用いる培養装置としては、通気撹拌型培養槽、エアリフト型培養槽、充填槽型培養槽、流動層型培養槽等を用いることができる。
　微生物の培養に用いる栄養分は、炭素源に限らず、窒素源、各種塩類、ビタミン、ミネラル等を含んでいてもよい。窒素源としては、例えば、酵母エキス、ペプトン、各種アミノ酸、大豆粕、コーンスティープリカ―、尿素、各種無機窒素等の窒素化合物を挙げることができる。
　ステップ１０３では、ｐ－トルアルデヒドからテレフタル酸を製造する。ｐ－トルアルデヒドからは、化学的酸化法や生物学的に酸化する方法によりテレフタル酸を製造する。化学的酸化法としては、例えば、重金属塩や臭素化合物を触媒として酸素含有ガスで酸化する方法（例えば、特開昭５１－８６４３７号公報を参照されたい。）を挙げることができる。生物学的に酸化する方法としては、例えば、遺伝子操作による大腸菌を使用した方法（例えば、Luo, Z., Lee, S. Biotransformation of p-xylene into terephthalic acid by engineered Escherichia coli. Nat Common 8, 15689(2017)(http://doi.org/10.1038/ncomms15689)を参照されたい。）を挙げることができる。
　ステップ１０４では、テレフタル酸の純度を向上させるため、テレフタル酸を精製する。精製方法は、固液分離、蒸留、晶析、脱色、脱塩等の化学製品を精製する方法のいずれか１つ若しくは複数の組み合わせにより実施することができる。また、精製方法は、膜分離、クロマトグラフィー等の分離技術を使用して実施することも可能である。
　ステップ１０５では、精製したテレフタル酸とジオール化合物との重合によりポリエステルを製造し、ステップ１０６で作業を終了する。製造されるポリエステルは、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリトリメチレンテレフタレート（ＰＴＴ）、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）、ポリブチレンアジペートテレフタレート（ＰＢＡＴ）、ポリブチレンテレフタレートサクシネート（ＰＥＴＳ）等である。これらのポリエステルのテレフタル酸とジオール化合物の重合による製造方法は、公知の方法を採用することができる。
　図４は、テレフタル酸及びポリエステルの製造フローの第２の例を示した図である。図４に示す例では、バイオマス資源として、多糖類を含む可食性バイオマスを使用し、バイオマス資源由来の化合物として、多糖類を使用する。多糖類としては、例えば、セルロース、デンプン、ヘミセルロース、ペクチン等を挙げることができる。多糖類を含む可食性バイオマスは、例えば、多糖類の１つであるデンプンを含む可食性バイオマス（デンプン系の可食性バイオマス）である。
　デンプン系の可食性バイオマスとしては、特に制限されず、例えば、トウモロコシ、サツマイモ、米、ジャガイモ、コムギ、オオムギ、タピオカ等を挙げることができる。デンプン系の可食性バイオマスは、上記のいずれか１種類のみを使用してもよいし、２種類以上を使用してもよい。なお、デンプン系の可食性バイオマスは加水分解反応速度を高めるために、水を加えて加熱を行うことにより糊化することが好ましい。
　図４に示す例では、ステップ２００から開始すると、ステップ２０１で、可食性バイオマスに含まれる多糖類を単糖類へ加水分解する。多糖類のままでも微生物を原料として利用することができるが、多糖類から単糖類への加水分解を行った上で培地に添加した方が本発明における微生物が生産するｐ－トルアルデヒドの生産速度が速くなるため好ましい。また、デンプン系可食性バイオマスの加水分解後には、オリゴ糖が含まれていてもよい。
　なお、多糖類から単糖類への加水分解は、塩酸、硫酸、リン酸等の酸による加水分解であってもよいし、微生物が生産する酵素による加水分解であってもよい。微生物が生産する酵素はアミラーゼ等である。デンプン系の可食性バイオマスから本発明に用いるグルコースを調製する際に使用するアミラーゼとしては、液化型アミラーゼ（α－アミラーゼ）、糖化型アミラーゼ（β－アミラーゼ）、プルラナーゼ、グルコアミラーゼ等が少なくとも１種類含まれていることが望ましく、酵素の種類に応じて、酵素反応に適したｐＨや温度を選択することができる。アミラーゼを生産する微生物としての制限はないが、例えば、Aspergills属、Bacillus属、Pseudomonas属の微生物を使用することができる。加水分解は、反応槽とは別の槽において実施してもよいし、反応槽において実施してもよい。反応槽において実施する場合、微生物を培養する培地に対し、アミラーゼ等の酵素を添加することができる。
　ステップ２０２以降は、図２に示したステップ１０１以降の処理と同様であるため、ここでは説明を省略する。なお、ステップ２０２で、可食性バイオマスを培養装置に添加する際、アミラーゼ等の酵素を生産する微生物を添加してもよい。また、アミラーゼ等の酵素を生産する微生物を、糖類からｐ－トルアルデヒドを生成する微生物とともに培養してもよい。
　図５は、テレフタル酸及びポリエステルの製造フローの第３の例を示した図である。図５に示す例では、バイオマス資源として、非可食性バイオマスを使用する。非可食性バイオマスは、可食性バイオマスとは異なり、食べることができないバイオマスである。非可食性バイオマスとしては、特に制限されず、例えば、木質系バイオマスや草本系バイオマス等を挙げることができる。木質系バイオマスとしては、例えば、マツ、スギ、モミ、トウヒ、ダグラスファー、ラジアータパイン等の針葉樹や、ブナ、カバ、ハンノキ、カエデ、ユーカリ、ポプラ、アカシア、ラワン、アスペン、ゴム等の広葉樹の木材を挙げることができる。草本系バイオマスとしては、例えば、ケナフ、マニラ麻、コーンストーバー、コーンコブ、タケ、バガス、稲わら、もみ殻、麦わら、コットンリンター、アシ、亜麻、エリアンサス、楮、三椏、ダイズ残さ、サツマイモの茎葉等を挙げることができる。非可食性バイオマスも、可食性バイオマスと同様、１種類のみを使用することに制限されるものではなく、複数種類を使用してもよい。
　非可食性バイオマスを原料として使用する場合、木材等をそのまま使用するのではなく、物理的に破砕した状態で使用することが望ましい。これは、木材等を構成する多糖類の１つであるセルロース等と結合しているリグニンの含有量を、薬品を使用して減少させる際、その薬品を浸透しやすくするためである。
　図５に示す例では、ステップ３００から開始すると、ステップ３０１で、非可食性バイオマスに対して前処理を施す。
　前処理では、木質系バイオマスの場合、機械的に２～３ｃｍ、厚さ約５ｍｍの大きさに破砕し、木材チップに小片化する。また、紙、古紙、パルプ等も原料として用いることができる。紙、古紙、パルプは、化学パルプ化法、機械パルプ化法、セミケミカルパルプ化法等の公知の方法により製造されたものを用いることができる（例えば、Sambrook, J et al., Molecular Cloning 2nd ed., 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. Press(1989)を参照されたい）。パルプ中には、セルロース、ヘミセルロースが多く含まれていることが望ましく、リグニンが含まれていてもよい。
　前処理では、上記のように小片化し、比表面積を増加させ、薬品が浸透しやすくすることができるが、リグニン含有量を低下させることができれば、他のいかなる方法でも採用することができる。例えば、公知の化学パルプの製造法を用いることができる（例えば、紙パルプ製造技術シリーズ、第１巻クラフトパルプ、第２巻メカニカルパルプ、紙パルプ技術協会編を参照されたい）。
　また、前処理の際に使用する薬品は、リグニン含有量を減少させることができればいかなる薬品であってもよく、例えば、水酸化ナトリウム、硫化ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カルシウム、オゾン、酸素、塩素、次亜塩素酸、過酸化水素、二酸化塩素、又はこれらの少なくとも２つを組み合わせたものを使用することができる。
　前処理では、薬品の存在下あるいは非存在下で、非可食性バイオマスを高温高圧下で処理する方法を採用してもよい。リグニンの分離回収を良くするためである。また、前処理時に、アントラキノン等のキノン構造を有する薬品や界面活性剤を同時に添加し、リグニンの分離回収率を高めてもよい。
　次に、ステップ３０２において、図４に示した多糖類を含む可食性バイオマスと同様、非可食性バイオマスに含まれる多糖類を単糖類へ加水分解する。非可食性バイオマスも、塩酸、硫酸、リン酸等の酸を使用して加水分解することができる。また、微生物が生産する酵素により加水分解することもできる。非可食性バイオマスの場合、酵素としてセルラーゼ、ヘミセルラーゼ、リグニン分解酵素等の酵素を生産する微生物を用いることができる。
　加水分解は、反応槽とは別の槽において実施してもよいし、反応槽において実施してもよい。反応槽において実施する場合、微生物を培養する培地に対し、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、リグニン分解酵素等の酵素を添加することができる。これらの酵素は、１種類のみ添加してもよいし、２種類以上を添加してもよい。
　ステップ３０３以降は、図２に示したステップ１０１、図４に示した２０２以降の処理と同様であるため、ここでは説明を省略する。なお、ステップ３０３で、非可食性バイオマスを添加する際、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、リグニン分解酵素等の酵素を生産する微生物を添加してもよい。また、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、リグニン分解酵素等の酵素を生産する微生物を、糖類からｐ－トルアルデヒドを生成する微生物とともに培養してもよい。
　セルラーゼを生産する微生物としては、細菌であれば、例えば、アセトバクタ―・キシリナム(Acetobacter xylinum)、セルロモナス・フィミ(Cellulomonas fimi)、クロストリジウム・サーモセラム(Clostridium thermocellum)等を挙げることができる。糸状菌であれば、例えば、アルペルギルス・アクレータス(Aspergillus aculeatus)、アスペルギルス・ナイジャー(Aspergilus niger)、ヒューミコラ・グリセア(Humicola grisea)、ヒューミコラ・インソレンス(Humicola insolens)、トリコデルマ・リーセイ(Trichodermareesei)、トリコデルマ・ビリデイ(Trichoderma viridie)等を挙げることができる。また、これらの微生物が生産したセルラーゼを酵素として用いることもできる。
　セルラーゼを構成する酵素としては、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セロビオースデヒドロゲナーゼ、β－グルコシダーゼ等を挙げることができる。酵素は、これらの１種類のみから構成されていてもよいし、２種類以上から構成されていてもよい。
　セルラーゼとしては、市販のセルラーゼである、Cellic Ctec3(Novozemes社製)やAccellerase(DuPont Industrial Biosciences)等を用いることができる。
　ヘミセルラーゼとしては、非可食性バイオマスが広葉樹である場合や、草本系非可食性バイオマスの場合、主にキシラナーゼを含むことが望ましい。非可食性バイオマスが針葉樹である場合は、主にマンナナーゼを含むことが望ましい。
　リグニン分解酵素としては、担子菌由来のマンガンペルオキシダーゼ、リグニンペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、バーサタイルペルオキシダーゼ等を用いることができる。マンガンペルオキシダーゼ、リグニンペルオキシダーゼ、バーサタイルペルオキシダーゼを用いる場合、酵素反応を効率的に行うために、過酸化水素を添加することが望ましい。
　本明細書において、「少なくとも９０％の配列同一性」とは、対象の配列全体に対する配列同一性が９０％以上であることを意味し、好ましくは９１％以上、より好ましくは９２％以上、さらに好ましくは９３％以上、さらにより好ましくは９４％以上、特に好ましくは９５％以上、特により好ましくは９８％以上、最も好ましくは１００％の同一性を意味する。
　本明細書において、「配列同一性」との用語は、アミノ酸配列の近似性の程度（これは、クエリー配列と他の好ましくは同一の型の配列（タンパク質配列）とのマッチングにより決定される）を意味する。「配列同一性」を計算及び決定する好ましいコンピュータープログラム法としては、ＧＣＧ　ＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Search Tool）（Altschul et al.,J.Mol.Biol.1990,215:403-410;Altschul et al.,Nucleic Acids Res.1997,25:3389-3402;Devereux et al.,Nucleic Acid Res.1984,12:387）、並びにＢＬＡＳＴＮ　２．０（Gish W.,http://blast.wustl.edu,1996-2002）、並びにＦＡＳＴＡ（Pearson及びLipman,Proc. Natl.Acad.Sci.USA 1988,85:2444-2448）を挙げることができるが、これらに限定されない。
（実施例１）
　Mycoacia uda（ATCC76971）を、糖類を多く含む可食性バイオマスの存在下で培養し、ｐ－トルアルデヒドを生成後、化学合成により、テレフタル酸及びポリエステルを製造した。
（前培養）
　単離した微生物を最初から大容量の培地へ植菌すると、誘導期が長くなり微生物の増殖に時間がかかるため、最初は少量の培地へ植菌し、微生物を増殖させた後、段階的に培地容量を増やしていく。大容量の培地への植菌前に少量の培地へ植菌し、微生物を増殖させる作業が前培養である。
　微生物としてMycoacia uda（ATCC76971）を用い、前培養としてポテトデキストロース寒天（ＰＤＡ）培地で、２６℃の温度で１週間（７日間）培養した。その後、直径７ｍｍのコルクポーラーで菌体を１０箇所打ち抜き、オートクレーブで滅菌（１２１℃、２０分間）を行ったＹＭ液体培地（イーストエキストラクト０．３％、モルトエキストラクト０．３％、グルコース１％、ペプトン０．５％、ｐＨ６．２）１００ｍＬを含む３００ｍＬ容三角フラスコ３本分に植菌した。その後、振とう培養機（２６℃、１００ｒｐｍ）により７日間、培地を撹拌し、前培養を行った。
（本培養）
　前培養後の培養液をミラクロス（メルク社製）でろ過を行い、得られた菌体を１００ｍＬの滅菌水とともにワ―リングブレンダーで破砕を行った。菌体の破砕液は、廃糖蜜５％と窒素源としてイーストニトロゲンベース（アミノ酸不含）を含む培地を用いて、３Ｌ容ジャーファメンター（エイブル社製）により２６℃の温度で２週間培養を行った。
（ｐ－トルアルデヒドの抽出・精製）
　本培養後の培養液は、精油定量装置（第十六改正日本薬局方に準拠、柴田化学社製）によりｐ－トルアルデヒドの抽出を行った。ｐ－トルアルデヒドの抽出方法は、定量器の目盛り管にキシレンに代えてトルエン２ｍＬを使用した以外、第十六改正日本薬局方に準拠した。抽出したｐ－トルアルデヒドにはトルエンが含まれている。このため、トルエンを分離するべく、ロータリーエバポレーター（Buchi社製）を用いてトルエンの減圧留去（減圧蒸留）を行った。さらに、展開溶媒としてヘキサンと酢酸エチルを９：１で混合した混合液を用い、シリカゲルクロマトグラフィーによりｐ－トルアルデヒドの精製を行った。
（ｐ－トルアルデヒドのテレフタル酸への酸化）
　テレフタル酸は、ｐ－トルアルデヒドを酸化することにより製造される。このため、精製されたｐ－トルアルデヒドを酸化するが、その酸化方法として、特開昭５１－８６４３７号公報に記載の方法を採用した。具体的には、還流冷却器、撹拌装置、加熱装置を付属し、原料送入口、原料ガス導入口、ガス排出口、反応物排出口を有するチタン製耐圧反応器（容量２．５Ｌ）及び反応物排出口に直列に連結した２個の反応物受器を有する連続酸化反応装置でｐ－トルアルデヒドの連続酸化を行った。
　反応器に予め所定量の触媒金属及び臭素化合物を含む酢酸（水分５ｗｔ％含有）を張り込み、窒素で約１ＭＰａに加圧したのち、２１０℃まで昇温した。２１０℃に昇温後、約１．８ＭＰａの条件で、ｐ－トルアルデヒドと、触媒としてコバルトを０．０２８３ｗｔ％、マンガンを０．０５６７ｗｔ％、臭素を０．１２１ｗｔ％で含有する酢酸（水分含有量０．０３ｗｔ％）からなる反応液を、ｐ－トルアルデヒド２２５ｇ／ｈｒ及び酢酸１１２０ｇ／ｈｒの割合となる供給速度で連続的に供給した。なお、コバルト、マンガン、臭素を含有する酢酸は、酢酸コバルト４水和物、酢酸マンガン、テトラブロムエタンを使用して作製した。
　反応生成物をスラリー状態で反応器から連続的に抜き出し、ろ過後、ケーキを酢酸及び水でそれぞれ２回ずつ洗浄し、乾燥してテレフタル酸を得た。このようにして得られたテレフタル酸の収率を計算すると、廃糖蜜に含まれる糖類の５．２％であった。収率は、理論上得ることが可能なテレフタル酸の最大量（理論収量）に対する実際に得られたテレフタル酸の量（収量）の比に１００を乗じ、１００分率で表した値である。
（テレフタル酸ジメチルの作製）
　ポリエステルの１つであるポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）は、テレフタル酸からテレフタル酸ジメチルを経由して製造される。
　上記により得られたバイオマス資源由来のテレフタル酸１０５ｇと、メタノール２００ｇと、９８ｗｔ％硫酸１５ｍＬと、硫酸銅（II）５水和物２．２５ｇを、５００ｍＬ容オートクレーブに仕込み、１１０℃、１．５ＭＰａで、１時間エステル化反応を行った。反応生成物をろ別し、再度同様の条件によりエステル化反応を行った。その後、反応生成物をろ別し、メタノールで繰り返し洗浄を行った。これにより、８７ｍｏｌ％の収率でテレフタル酸ジメチルを得た。このテレフタル酸ジメチルに対して０．０１８ｗｔ％の炭酸ナトリウムを添加し、１８５℃、５６ｈＰａで単蒸留を行い、バイオマス資源由来テレフタル酸ジメチルを得た。
（ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）の作製）
　バイオマス資源由来エチレングリコール（インディアグリコール社製）に１ｗｔ％の金属ナトリウムを加えて１時間還流し、蒸留して精製を行った。１００ｍＬの丸底フラスコに、上記で得られたバイオマス資源由来テレフタル酸ジメチル１５．５ｇ、精製後のエチレングリコール１１．８ｇ、酢酸カルシウム０．０２５ｇ、三酸化アンチモン０．０１ｇを量り取り、この丸底フラスコにクライゼン管と空気冷却器を取り付けた。反応系内に窒素ガスを導入し、空気を除去した後、１８０℃に加熱し、内容物を融解させ、毛細管を差し込み、窒素ガスを反応系内に導入した。その後１時間、メタノールを留出させた。
　２００℃で２時間加熱を続け、メタノールを脱離した後、２２０℃に昇温し、過剰のエチレングリコールを留出させた。２２０℃に昇温して２０分経過した後、２８０℃に昇温し、１５分間その温度を維持した。その後、真空アダプタを取り付け、０．４ｈＰａまで徐々に減圧した。３時間後、窒素ガスを導入しながら反応器の冷却を行った。冷却後、１５０℃で１２時間真空乾燥を行った。
　乾燥後、紡糸温度２８５℃で溶融し、孔径０．１８ｍｍφの紡糸口金から吐出させ、引き取りローラで引き取って、未延伸糸を得た。得られた未延伸糸をホットロール延伸機により延伸し、熱処理を行って、ＰＥＴ繊維を得た。得られたバイオマス資源由来ＰＥＴは良好なポリマー特性、紡糸安定性、染料吸尽率を有していた。
（実施例２）
　デンプン系の可食性バイオマスを用いてテレフタル酸及びポリエステルを製造した。デンプン系の可食性バイオマスを用いる場合、糖化処理により多糖類を単糖類に加水分解することが望ましいことから、糖化処理を行った。
（デンプンの酵素糖化）
　デンプン系の可食性バイオマスとしてコンスターチ（王子コンスターチ社製）を用いた。コンスターチを３０ｗｔ％の濃度でイオン交換水に添加し、オートクレーブ（１２１℃、２０分間）により滅菌を行った。その後、９０℃まで冷却し、０．２ｗｔ％の耐熱性α－アミラーゼ（Termamyl 120、Novozymes社製）を添加し、３時間撹拌しながら反応させた。その後、６０℃まで冷却し、冷却後、撹拌しながら０．３５ｗｔ％のグルコアミラーゼ（Allcoholase II L400、Alltech社製）を添加し、２時間反応させることによりデンプンの糖化を行った。
　糖化後、実施例１における本培養で、廃糖蜜に代えて酵素糖化後のデンプンを、グルコース濃度として１０ｗｔ％になるように添加した。それ以外については、実施例１と同様の方法により、テレフタル酸とポリエステルの製造を行った。このようにして得られたテレフタル酸の収率は、添加したデンプンの５．１％であった。また、得られたバイオマス資源由来ＰＥＴは良好なポリマー特性、紡糸安定性、染料吸尽率を有していた。
（実施例３）
　非可食性バイオマスを用いてテレフタル酸及びポリエステルを製造した。非可食性バイオマスを用いる場合、前処理及び糖化処理により、リグニン含有量を低下させ、多糖類を単糖類に加水分解した。
　実施例１における本培養で、廃糖蜜に代えて、上述した化学・物理的処理やリグニン分解酵素を用いてリグニン含有量を低下させた酸素脱リグニン後の広葉樹パルプ（１０ｗｔ％）を添加した。また、培地中の酵素活性が１０Ｕ／ｍＬになるように市販のセルラーゼ（Cellic CTec3、Novozymes社製）を添加した。ちなみに、１Ｕ（酵素単位）は、定められた条件で毎分基質１μｍｏｌの変化を触媒する酵素量である。それ以外については、実施例１と同様の方法で、テレフタル酸とポリエステルの製造を行った。このようにして得られたテレフタル酸の収率は、酸素脱リグニン後広葉樹パルプの３．８％であった。また、得られたバイオマス資源由来ＰＥＴは良好なポリマー特性、紡糸安定性、染料吸尽率を有していた。
（実施例４）
　バイオマス資源由来原料であるｐ－メチルアセトフェノンからテレフタル酸及びポリエステルを製造した。
　前培養は、実施例１と同様に行い、本培養において、バイオマス資源由来のｐ－メチルアセトフェノンを培地中の濃度として１ｗｔ％となるように添加した。バイオマス資源由来のｐ－メチルアセトフェノンは、バイオマス資源であるレモンから得られたシトラールを酸化することにより得た。シトラールの酸化は、文献（Ueno et al., Formation Mechanism of p-Methylacetophenone from Citral via a tert-Alkoxy Radical Intermediate. J.Agric. Food Chem., 52, 5677-5684(2004)）に記載の方法により行った。この結果、テレフタル酸の収率は、添加したシトラールの１．５％であった。また、得られたバイオマス資源由来ＰＥＴは良好なポリマー特性、紡糸安定性、染料吸尽率を有していた。
　ここで、バイオマス資源からテレフタル酸を製造し、その収率を計算した文献は見当たらないが、バイオマス資源由来物質からｐ－トルアルデヒドを製造する方法における収率を開示する文献（上記特許文献３）と、ｐ－トルアルデヒドからテレフタル酸を製造する方法における収率を開示する文献（特開昭５１－８６４３７号公報）は見られる。これらの文献から、バイオマス資源からテレフタル酸を得るための全体の収率を計算すると、約３．８～４．９％となる。
　本発明の方法では、実施例１～４に示すように、収率は、１．５～５．２％となり、微生物を使用するものではないが、バイオマス資源由来物質からｐ－トルアルデヒドを介してテレフタル酸を製造する場合とほぼ同等の収率でテレフタル酸を製造できることを見いだした。
（実施例５）
　担子菌［マイコアシア・ウダ（Mycoacia uda）］用ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ（Benzaldehyde dehydrogenase）遺伝子、トルエートメチルモノオキシゲナーゼ（Toluate methylmonooxygenase）遺伝子、４－カルボキシベンジルアルコールデヒドロゲナーゼ（4-carboxybenzyl alcohol dehydrogenase）遺伝子、及び４－カルボキシベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ（4-carboxybenzaldehyde dehydrogenase）遺伝子を調製した。
（５－１）担子菌［マイコアシア・ウダ（Mycoacia uda）］用ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子の調製
　シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）由来のベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子の塩基配列、及びアミノ酸配列は公知である(アクセッション番号：AAN67564)。担子菌に効率的にベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ（配列番号１９に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド）を発現させるために、担子菌におけるコドン使用頻度を基に、Pseudomonas putida由来のベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子の塩基配列をgeneious prime（Biomatters社製）を用いて最適化後、ＤＮＡの化学合成を行い、これをＭｕＢＺＤＨと名付けた。ＭｕＢＺＤＨを、ｐＵＣ１８（タカラバイオ社製）にクローニングし、ｐＭｕＢＺＤＨと名付けた。
（５－２）担子菌［マイコアシア・ウダ（Mycoacia uda）］用トルエートメチルモノオキシゲナーゼ遺伝子、４－カルボキシベンジルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子、及び４－カルボキシベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子の調製
　担子菌［マイコアシア・ウダ（Mycoacia uda）］用トルエートメチルモノオキシゲナーゼ遺伝子、担子菌［マイコアシア・ウダ（Mycoacia uda）］用４－カルボキシベンジルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子、及び担子菌［マイコアシア・ウダ（Mycoacia uda）］用４－カルボキシベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子の調製を、上記（５－１）の項目に記載の調製法と同様の方法を用いて行った。コマモナス・テストステロニ（Comamonas testosteroni）由来のトルエートメチルモノオキシゲナーゼ遺伝子（ｔｓａＭＢ）、４－カルボキシベンジルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｔｓａＣ）、並びに４－カルボキシベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｔｓａＤ）のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は公知である［文献（Junker F, Kiewitz R, Cook AM. Characterization of the p-toluenesulfonate operon tsaMBCD and tsaR in Comamonas testosteroni T-2. J Bacteriol. 179(3). 919-927.1997）］。担子菌に効率的にトルエートメチルモノオキシゲナーゼ（配列番号２０に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド）、４－カルボキシベンジルアルコールデヒドロゲナーゼ（配列番号２１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド）、及び４－カルボキシベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ（配列番号２２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド）を発現させるために、担子菌におけるコドン使用頻度を基に、コマモナス・テストステロニ（Comamonas testosteroni）由来のトルエートメチルモノオキシゲナーゼ遺伝子（ｔｓａＭＢ）、４－カルボキシベンジルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｔｓａＣ）、及び４－カルボキシベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｔｓａＤ）のヌクレオチド配列をgeneious prime（Biomatters社製）を用いて最適化後、ＤＮＡの化学合成を行った。担子菌用に最適化したトルエートメチルモノオキシゲナーゼをコードするＤＮＡはＭｕｔｓａＭＢ、担子菌用に最適化した４－カルボキシベンジルアルコールデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡはＭｕｔｓａＣ、担子菌用に最適化した４－カルボキシベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡはＭｕｔｓａＤとそれぞれ名付けた。ＭｕｔｓａＭＢ、ＭｕｔｓａＣ、及びＭｕｔｓａＤを、それぞれｐＵＣ１８（タカラバイオ社製）にクローニングし、それぞれｐＭｕｔｓａＭＢ、ｐＭｕｔｓａＣ、及びｐＭｕｔｓａＤと名付けた。
（実施例６）
　担子菌［マイコアシア・ウダ（Mycoacia uda）］由来グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｇｐｄ）のプロモーター及び３’末端領域を用いて、ＭｕＢＺＤＨ、ＭｕｔｓａＭＢ、ＭｕｔｓａＣ、及びＭｕｔｓａＤ発現ベクターを構築した。
（６－１）担子菌［マイコアシア・ウダ（Mycoacia uda）］由来のグリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）遺伝子のプロモーター及び３’末端領域を用いた、ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＭｕＢＺＤＨ）発現ベクターの構築
　マイコアシア・ウダ（Mycoacia uda）におけるＭｕＢＺＤＨ発現ベクターの構築は、公知の方法であるダブルジョイントＰＣＲ法を用いて行った。具体的には、文献（Yu, J. H., Hamari, Z., Han, K. H., Seo, J. A., Reyes-Dominguez,Y., Scazzocchio, “C.Double-joint PCR: a PCR-based molecular tool for gene manipulations in filamentous fungi.” Fungal Genetics and Biology. 41(11). 973-981. (2004).）に記載された方法に則って構築した。
　上記（５－１）で調製したベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＭｕＢＺＤＨ）を担子菌［マイコアシア・ウダ（Mycoacia uda）］で発現させるために、プロモーターとして恒常的な発現が知られているマイコアシア・ウダ（M. uda）のグリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）遺伝子のプロモーター領域を用いた。マイコアシア・ウダ（M. uda）のＧＰＤ遺伝子のプロモーター領域を得るために、マイコアシア・ウダ（M. uda）のゲノムＤＮＡをテンプレートにして、配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるプライマーと、配列番号２に示すヌクレオチド配列からなるプライマーとを用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲに使用する酵素には、東洋紡より販売されているKOD plusを利用し、ＰＣＲ反応は、９４℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で２分間を３０サイクルの条件で行った。ＰＣＲ反応により増幅した１ｋｂｐのＤＮＡ断片は、QIAquick PCR Purification Kit（QIAGEN社製）を用いて精製した。
　次に、上記（５－１）で調製したｐＭｕＢＺＤＨ（すなわち、担子菌用に最適化したベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子のヌクレオチド配列（ＭｕＢＺＤＨ）を含むプラスミド）をテンプレートとして、配列番号３に示すヌクレオチド配列からなるプライマーと、配列番号４に示すヌクレオチド配列からなるプライマーとを用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲに使用する酵素には、東洋紡より販売されているKOD plusを利用し、ＰＣＲ反応は、９４℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で２分間を３０サイクルの条件で行った。ＰＣＲ反応により増幅したＤＮＡ断片は、QIAquick PCR Purification Kit（QIAGEN社製）を用いて精製した。
　また、ＭｕＢＺＤＨの発現の安定化のために、マイコアシア・ウダ（M. uda）のＧＰＤ遺伝子の３’末端領域（０．８ｋｂｐ）を使用した。この領域を増幅するために、マイコアシア・ウダ（M. uda）のゲノムＤＮＡをテンプレートにして、配列番号５に示すヌクレオチド配列からなるプライマーと、配列番号６に示すヌクレオチド配列からなるプライマーとを用いて、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲに使用する酵素には、東洋紡より販売されているKOD plusを利用し、ＰＣＲ反応は、９４℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で１分間ＰＣＲ反応を３０サイクルの条件で行った。得られた０．８ｋｂｐのＤＮＡ断片は、QIAquick PCR Purification Kit（QIAGEN社製）を用いて精製した。
　続いて、上記ＰＣＲで増幅した（１）マイコアシア・ウダ（Mycoacia uda）のグリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｇｐｄ）のプロモーター領域、（２）担子菌用に最適化したベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子、及び（３）マイコアシア・ウダ（Mycoacia uda）のＧＰＤ遺伝子の３’末端領域を用いて、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲに使用する酵素には東洋紡より販売されているＫＯＤ ｐｌｕｓを利用し、ＰＣＲ反応は、９４℃で１分間、６０℃で１０分間、７２℃で５分間を３０サイクルの条件で行った。ＰＣＲ後のＤＮＡ断片は、QIAquick PCR Purification Kit（QIAGEN社製）を用いて精製した。
　続いて、精製したＰＣＲ後のＤＮＡ断片をテンプレートにして、配列番号１からなるプライマーと、配列番号６に示すヌクレオチド配列からなるプライマーとを用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ酵素には東洋紡より販売されているＫＯＤ ｐｌｕｓを利用し、ＰＣＲ反応は、９４℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で５分間を３０サイクルの条件で行った。ＰＣＲ後のＤＮＡ断片は、QIAquick PCR Purification Kit（QIAGEN社製）を用いて精製した。また、TOPO TA Cloning Kit（Invitrogen社製）を用いて、クローニングを行った。この結果得られたベクターを、ｐＧＰＤＭｕＢＺＤＨと名付けた。なお、ヌクレオチド配列を決定するために、得られたＤＮＡ断片をApplied Biosystems社製ヌクレオチド配列解析試薬を用いてPＣＲ反応を行い、反応産物をApplied Biosystems社製ＤＮＡシーケンサABI PRISM 310自動ヌクレオチド配列決定装置を用いて解析した。
　（６－２）担子菌［マイコアシア・ウダ（Mycoacia uda）］由来グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｇｐｄ）のプロモーター及び３’末端領域を用いた、トルエートメチルモノオキシゲナーゼ遺伝子発現ベクター、４－カルボキシベンジルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子発現ベクター、及び４－カルボキシベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子発現ベクターの構築
　担子菌［マイコアシア・ウダ（Mycoacia uda）］用トルエートメチルモノオキシゲナーゼ遺伝子（ＭｕｔｓａＭＢ）、担子菌［マイコアシア・ウダ（Mycoacia uda）］用４－カルボキシベンジルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＭｕｔｓａＣ）、及び担子菌［マイコアシア・ウダ（Mycoacia uda）］用４－カルボキシベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＭｕｔｓａＤ）のそれぞれの５’末端に担子菌［マイコアシア・ウダ（Mycoacia uda）］由来ＧＰＤ遺伝子のプロモーターを連結するとともに、これら遺伝子のそれぞれの３’末端に担子菌［マイコアシア・ウダ（Mycoacia uda）］由来ＧＰＤ遺伝子の３’末端領域を連結し、トルエートメチルモノオキシゲナーゼ遺伝子発現ベクター（ｐＧＰＤＭｕｔｓａＭＢ）、４－カルボキシベンジルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子発現ベクター（ｐＧＰＤＭｕｔｓａＣ）、及び４－カルボキシベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子発現ベクター（ｐＧＰＤＭｕｔｓａＤ）をそれぞれ構築した。これらの遺伝子発現ベクターを構築するにあたっては、上記（６－１）のｐＧＰＤＭｕＢＺＤＨの作製方法において、ｐＭｕＢＺＤＨの代わりに、トルエートメチルモノオキシゲナーゼ遺伝子を含むベクター（ｐＭｕｔｓａＭＢ）、４－カルボキシベンジルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を含むベクター（ｐＭｕｔｓａＣ）、４－カルボキシベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子を含むベクター（ｐＭｕｔｓａＤ）をそれぞれテンプレートに用いてＰＣＲ反応を行った。
　トルエートメチルモノオキシゲナーゼ遺伝子発現ベクター（ｐＧＰＤＭｕｔｓａＭＢ）を構築する過程において、マイコアシア・ウダ（Mycoacia uda）のｇｐｄプロモーターの増幅には、配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるプライマーと、配列番号７に示すヌクレオチド配列からなるプライマーとを用い、トルエートメチルモノオキシゲナーゼ遺伝子の増幅には、配列番号８に示すヌクレオチド配列からなるプライマーと、配列番号９に示すヌクレオチド配列からなるプライマーとを用い、マイコアシア・ウダ（M. uda）のｇｐｄ遺伝子の３’末端領域（０．８ｋｂｐ）の増幅には、配列番号６に示すヌクレオチド配列からなるプライマーと、配列番号１０に示すヌクレオチド配列からなるプライマーとを用い、ＧＰＤＭｕｔｓａＭＢの増幅には、配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるプライマーと、配列番号６に示すヌクレオチド配列からなるプライマーとを用いた。プライマー以外のＰＣＲ反応条件は上記（６－１）と同じである。ＰＣＲ反応後のＤＮＡ断片は、QIAquick PCR Purification Kit（QIAGEN社製）を用いて精製した後、TOPO TA Cloning Kit（Invitrogen社製）を用いて、クローニングを行った。この結果得られたベクターを、ｐＧＰＤＭｕｔｓａＭＢと名付けた。
　４－カルボキシベンジルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子発現ベクター（ｐＧＰＤＭｕｔｓａＣ）を構築する過程において、マイコアシア・ウダ（Mycoacia uda）のｇｐｄプロモーターの増幅には、配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるプライマーと、配列番号１１に示すヌクレオチド配列からなるプライマーとを用い、４－カルボキシベンジルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の増幅には、配列番号１２に示すヌクレオチド配列からなるプライマーと、配列番号１３に示すヌクレオチド配列からなるプライマーとを用い、マイコアシア・ウダ（M. uda）のｇｐｄ遺伝子の３’末端領域（０．８ｋｂｐ）の増幅には、配列番号６に示すヌクレオチド配列からなるプライマーと、配列番号１４に示すヌクレオチド配列からなるプライマーとを用い、ＧＰＤＭｕｔｓａＣの増幅には、配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるプライマーと、配列番号６に示すヌクレオチド配列からなるプライマーとを用いた。プライマー以外のPCR反応条件は上記（６－１）と同じである。ＰＣＲ反応後のＤＮＡ断片は、QIAquick PCR Purification Kit（QIAGEN社製）を用いて精製した後、TOPO TA Cloning Kit（Invitrogen社製）を用いて、クローニングを行った。この結果得られたベクターをｐＧＰＤＭｕｔｓａＣと名付けた。
　４－カルボキシベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子発現ベクター（ｐＧＰＤＭｕｔｓａＤ）を構築する過程において、マイコアシア・ウダ（Mycoacia uda）のｇｐｄプロモーターの増幅には、配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるプライマーと、配列番号１５に示すヌクレオチド配列からなるプライマーとを用い、４－カルボキシベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子の増幅には、配列番号１６に示すヌクレオチド配列からなるプライマーと、配列番号１７に示すヌクレオチド配列からなるプライマーとを用い、マイコアシア・ウダ（M. uda）のＧＰＤ遺伝子の３’末端領域（０．８ｋｂｐ）の増幅には、配列番号６に示すヌクレオチド配列からなるプライマーと、配列番号１８に示すヌクレオチド配列からなるプライマーとを用い、ＧＰＤＭｕｔｓａＤの増幅には、配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるプライマーと、配列番号６に示すヌクレオチド配列からなるプライマーとを用いた。プライマー以外のＰＣＲ反応条件は上記（６－１）と同じである。ＰＣＲ反応後のＤＮＡ断片は、QIAquick PCR Purification Kit（QIAGEN社製）を用いて精製した。また、TOPO TA Cloning Kit（Invitrogen社製）を用いて、クローニングを行った。この結果得られたベクターを、ｐＧＰＤＭｕｔｓａＤと名付けた。
（実施例７）
　バイオマス資源からテレフタル酸を生合成するためのマイコアシア・ウダ（Mycoacia uda）の形質転換株を作製した。
（７－１）菌糸体の培養
　直径６ｍｍ前後のガラスビーズを約３０個入れた５００ｍＬ容三角フラスコに、ＳＭＹ培地（シュークロース１％、麦芽エキス１％、酵母エキス０．４％）１００ｍＬを分注して滅菌後、マイコアシア・ウダ（M. uda ATCC76971）の平板寒天培地から直径５ｍｍの寒天片をコルクボーラーで打ち抜き、ＳＭＹ培地に植菌し、２６℃で７日間静置培養した（前培養）。ただし、菌糸を細分化するために、１日に１～２回振り混ぜた。次に、１Ｌ容の三角フラスコにＳＭＹ培地２００ｍＬを分注し、さらに回転子を入れ、滅菌後、前培養菌糸をナイロンメッシュ（孔径３０μｍ）で濾集後、全量を植菌し２６℃で培養した。なお、スターラーで１日２時間程度撹拌することにより菌糸を細分化した。この培養を７日間行った。
（７－２）プロトプラストの調製
　上記液体培養菌糸をナイロンメッシュ（孔径３０μｍ）で濾集し、浸透圧調節溶液（０．５Ｍ ＭｇＳＯ４、５０ｍＬマレイン酸バッファー（ｐＨ５．６））で洗浄した。次に、湿菌体１００ｍｇあたり１ｍＬの細胞壁分解酵素液［セルラーゼ・オノズカ（cellulase ONOZUKA RS；ヤクルト社製）５ｍｇ、及びヤタラーゼ（Yatalase；宝酒造社製）１０ｍｇを上記浸透圧調節溶液１ｍｇに溶解したもの］に懸濁し、緩やかに振盪しながら２６℃で３時間インキュベートしてプロトプラストを遊離させた。
（７－３）プロトプラストの精製
　上記プロトプラストを含む酵素反応液からナイロンメッシュ（孔径３０μｍ）で菌糸断片を除いた後、プロトプラストの回収率を高めるため、ナイロンメッシュ上に残存する菌糸断片とプロトプラストを上記浸透圧調節溶液で１回洗浄した。得られたプロトプラスト懸濁液を遠心分離（１，０００ｇ、５分間）し、上静を除去し、４ｍＬの１Ｍシュークロースを含む２０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．３）で再懸濁後、遠心操作を繰り返し、上記１Ｍシュークロース溶液で２回洗浄した。沈殿物に１Ｍソルビトールを含む２０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．４）に４０ｍＭ塩化カルシウムを加えた溶液５００μＬに懸濁し、プロトプラスト懸濁液とした。この懸濁液を４℃で保存した。プロトプラスト濃度は血球計算盤を用いて、直接検鏡により求めた。すべての遠心操作はスウィングローターで１，０００ｇ、５分間、室温で行った。
（７－４）ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子発現ベクター（ｐＧＰＤＭｕＢＺＤＨ）、トルエートメチルモノオキシゲナーゼ遺伝子発現ベクター（ｐＧＰＤＭｕｔｓａＭＢ）、４－カルボキシベンジルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子発現ベクター（ｐＧＰＤＭｕｔｓａＣ）、及び４－カルボキシベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子発現ベクター（ｐＧＰＤＭｕｔｓａＤ）を用いたマイコアシア・ウダ（Mycoacia uda）の形質転換
　上記（７－３）で精製した約１００個／１００μＬのプロトプラスト懸濁液１００μＬに対して、上記（６－１）及び（６－２）で構築したベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子発現ベクター（ｐＭｕＢＺＤＨ）、トルエートメチルモノオキシゲナーゼ遺伝子発現ベクター（ｐＧＰＤＭｕｔｓａＭＢ）、４－カルボキシベンジルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子発現ベクター（ｐＧＰＤＭｕｔｓａＣ）、及び４－カルボキシベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子発現ベクター（ｐＧＰＤＭｕｔｓａＤ）と、公知の方法で調製したマイコアシア・ウダ由来のカルボキシン耐性遺伝子とを、それぞれ２μｇ添加し、３０分間氷冷した。次に、プロトプラストＤＮＡ混合液に対して等量のＰＥＧ溶液（５０％ＰＥＧ３４００を含む２０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．４））を加え、さらに３０分間氷冷した。次に、０．５Ｍシュークロースを含む最小寒天培地（寒天１％）１０ｍＬに緩やかに混和して固化し、２６℃で数日間培養を行った。培養３日後、カルボキシン２μｇ／ｍＬを含む最小寒天培地１０ｍＬを重層し、さらに培養を継続した。重層後、生育した形質転換体を選抜した。
　（実施例８）
　担子菌［マイコアシア・ウダ（Mycoacia uda）］由来ＧＰＤプロモーターを用いたベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子発現ベクター（ｐＧＰＤＭｕＢＺＤＨ）、トルエートメチルモノオキシゲナーゼ遺伝子発現ベクター（ｐＧＰＤＭｕｔｓａＭＢ）、４－カルボキシベンジルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子発現ベクター（ｐＧＰＤＭｕｔｓａＣ）、及び４－カルボキシベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子発現ベクター（ｐＧＰＤＭｕｔｓａＤ）を遺伝子導入した形質転換体を、糖類を多く含む可食性バイオマスの存在下で培養し、テレフタル酸を生成した。
　上記（７－４）で作製した形質転換体は、ポテトデキストロース寒天培地上で２６℃にて培養した後、４℃で保存した。前培養と本培養は実施例１と同じ方法で行った。本培養における培養液中に含まれるテレフタル酸の定量は公知の方法に従ってＨＰＬＣ分析を行った［文献（Luo, Z., Lee, S. Biotransformation of p-xylene into terephthalic acid by engineered Escherichia coli. Nat Commun 8, 15689 (2017).）］。
　その結果、テレフタル酸の収率は、廃糖蜜に含まれる糖類の５．０％であった。また、得られたバイオマス資源由来ＰＥＴは良好なポリマー特性、紡糸安定性、染色性を有していた。一方、比較例として作製したマイコアシア・ウダ由来のカルボキシン耐性遺伝子のみを導入した形質転換体では、テレフタル酸は生産されなかった。
　この結果は、４種類の酵素（ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ［ＢＺＤＨ］、トルエートメチルモノオキシゲナーゼ［ＴｓａＭＢ］、４－カルボキシベンジルアルコールデヒドロゲナーゼ［ＴｓａＣ］、及び４－カルボキシベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ［ＴｓａＤ］）が発現する微生物を、バイオマス資源の存在下で培養すると、バイオマス資源由来物質からｐ－トルアルデヒドを介してテレフタル酸を製造できることを示している。
　（実施例９）
　ヒイロハリタケ（Hydnophlebia chrysorhiza）を、用いた糖類を多く含む可食性バイオマスの存在下で培養し、ｐ－トルアルデヒドを生成後、化学合成により、テレフタル酸及びポリエステルを製造した。
　実施例１で使用した微生物（Mycoacia uda ATCC76971）の代わりに、Hydnophlebia chrysorhiza FD-282を用いて、実施例１と同じ方法で、廃糖蜜を原料としてテレフタル酸及びポリエステルの製造を行った。
　その結果、テレフタル酸の収率は廃糖蜜に含まれる糖類の４．８％であった。また、得られたバイオマス資源由来ＰＥＴは良好なポリマー特性、紡糸安定性、染色性を有していた。
　以上のことから、本発明の方法は、比較的高い収率でテレフタル酸を製造することができ、従来の方法に比較して、温和な温度で製造することができ、エネルギー消費量を低減させることができる。また、本発明の方法は、従来の方法に比較して、バイオマス資源、あるいはバイオマス資源由来の化合物を、微生物によりｐ－トルアルデヒドに変換する工程という少ない工程数でテレフタル酸を製造したり、微生物中で生成されたｐ－トルアルデヒドから、テレフタル酸をバイオトランスフォーメーションすることにより、１工程でテレフタル酸を製造することができる。熱分解に必要とされる高価な炉や分留装置等を使用しないため、安価で製造することが可能となる。微生物の培養によりｐ－トルアルデヒドやテレフタル酸を生成するため、培養し、増殖した微生物を提供することも可能となる。
　また、本発明では、テレフタル酸の製造方法、ポリエステルの製造方法のほか、これらの製造方法により製造されたテレフタル酸及びポリエステルの提供も可能である。
　これまで本発明のテレフタル酸の製造方法、ポリエステルの製造方法、これらの製造方法により製造されたテレフタル酸及びポリエステルについて、上述した実施形態をもって詳細に説明してきたが、本発明は、上述した実施形態に限定されるものではなく、他の実施形態や、追加、変更、削除など、当業者が想到することができる範囲内で変更することができ、いずれの態様においても本発明の作用・効果を奏する限り、本発明の範囲に含まれるものである。
１０…反応槽
１１…培地
１２…撹拌機
１３…貯留槽
１４～１６…ポンプ

Claims (17)

  1. 　バイオマス資源、あるいはバイオマス資源由来の化合物を、微生物によりｐ－トルアルデヒドに変換する工程を含む、テレフタル酸の製造方法。
  2. 　前記バイオマス資源由来の化合物が、シキミ酸、１－ｐ－トリルエタノール、ｐ－メチルアセトフェノン、ｐ－メチルベンジルアルコールの少なくとも１つである、請求項１に記載のテレフタル酸の製造方法。
  3. 　前記バイオマス資源が前処理工程若しくは糖化工程又はその両方の工程により処理されたバイオマス資源である、請求項１又は２に記載のテレフタル酸の製造方法。
  4. 　前記バイオマス資源が、可食性バイオマス、可食性バイオマス由来の単糖類若しくは多糖類、非可食性バイオマス、非可食性バイオマス由来の単糖類若しくは多糖類のいずれか１つ以上である、請求項１～３のいずれか１項に記載のテレフタル酸の製造方法。
  5. 　前記可食性バイオマスが、トウモロコシ、サツマイモ、米、ジャガイモ、コムギ、オオムギ、タピオカ、サトウキビ、ビート、糖蜜、ハイテスト・モラセスから選択される少なくとも１種類のバイオマスを含む、請求項４に記載のテレフタル酸の製造方法。
  6. 　前記非可食性バイオマスが、草本系バイオマス、木質系バイオマス、紙、パルプ、古紙、バガス、コーンストーバーから選択される少なくとも１種類のバイオマスを含む、請求項４に記載のテレフタル酸の製造方法。
  7. 　アミラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、リグニン分解酵素から選択される少なくとも１種類の酵素を培地に添加する工程を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載のテレフタル酸の製造方法。
  8. 　前記ｐ－トルアルデヒドを、微生物を利用して生物学的に酸化し、テレフタル酸を製造する、請求項１～７のいずれか１項に記載のテレフタル酸の製造方法。
  9. 　前記微生物が、ｐ－トルアルデヒドの生成に使用した微生物と同じであり、かつ、ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ、トルエートメチルモノオキシゲナーゼ、４－カルボキシベンジルアルコールデヒドロゲナーゼ、及び４－カルボキシベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼの４種類の酵素をコードする遺伝子群が遺伝子導入された微生物である、請求項８に記載のテレフタル酸の製造方法。
  10. 　前記微生物が、フレビア　ウダ（Phlebia uda）又はヒイロハリタケ（Hydnophlebia chrysorhiza）である、請求項１～９のいずれか１項に記載のテレフタル酸の製造方法。
  11. 　請求項１～１０のいずれか１項に記載のテレフタル酸の製造方法により製造されたテレフタル酸とジオール化合物を反応させてポリエステルを製造する工程を含む、ポリエステルの製造方法。
  12. 　ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ、トルエートメチルモノオキシゲナーゼ、４－カルボキシベンジルアルコールデヒドロゲナーゼ、及び４－カルボキシベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼの４種類の酵素をコードする遺伝子群が遺伝子導入された微生物であって、バイオマス資源又はバイオマス資源由来の化合物からｐ－トルアルデヒドを生産できる、前記微生物。
  13. 　前記ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼが、配列番号１９に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつ、ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を保持し、
    前記トルエートメチルモノオキシゲナーゼが、配列番号２０に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつ、トルエートメチルモノオキシゲナーゼ活性を保持し、
    前記４－カルボキシベンジルアルコールデヒドロゲナーゼが、配列番号２１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつ、４－カルボキシベンジルアルコールデヒドロゲナーゼ活性を保持し、
    前記４－カルボキシベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼが、配列番号２２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつ、４－カルボキシベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を保持する、
    請求項１２に記載の微生物。
  14. 　前記微生物が、フレビア　ウダ（Phlebia uda）又はヒイロハリタケ（Hydnophlebia chrysorhiza）である、請求項１２又は１３に記載の微生物。
  15. 　ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ、トルエートメチルモノオキシゲナーゼ、４－カルボキシベンジルアルコールデヒドロゲナーゼ、及び４－カルボキシベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼの４種類の酵素をコードする遺伝子群を、微生物に遺伝子導入する工程を含む、前記遺伝子群が遺伝子導入された微生物を作製する方法であって、前記微生物が、バイオマス資源又はバイオマス資源由来の化合物からｐ－トルアルデヒドを生産できる微生物である、前記方法。
  16. 　前記ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼが、配列番号１９に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつ、ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を保持し、
    前記トルエートメチルモノオキシゲナーゼが、配列番号２０に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつ、トルエートメチルモノオキシゲナーゼ活性を保持し、
    前記４－カルボキシベンジルアルコールデヒドロゲナーゼが、配列番号２１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつ、４－カルボキシベンジルアルコールデヒドロゲナーゼ活性を保持し、
    前記４－カルボキシベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼが、配列番号２２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつ、４－カルボキシベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を保持する、
    請求項１５に記載の方法。
  17. 　前記微生物が、フレビア　ウダ（Phlebia uda）又はヒイロハリタケ（Hydnophlebia chrysorhiza）である、請求項１５又は１６に記載の方法。
     
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