CN107354102A - 一种耐高糖季也蒙毕赤酵母菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种耐高糖季也蒙毕赤酵母菌株，命名为季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)ZJUQH，保藏号为CCTCC NO：M 2016755。本发明提供的季也蒙毕赤酵母菌株是从野生猕猴桃果皮内部分离筛选得到的，能够耐受高糖和一定浓度的酒精，能够在高糖环境下发酵水果生产水果饮料，可减少生产过程中的高温灭菌处理工艺，对多种热敏感活性物质损伤小，可极大提高水果饮料的营养保健功效，对产品口感也有很大提升，还能降低生产能耗成本。

Description

一种耐高糖季也蒙毕赤酵母菌株及其应用
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其涉及一种耐高糖季也蒙毕赤酵 母菌株及其应用。
背景技术
耐高渗酵母是一类能在高渗透压(高糖或高盐)环境下生长、繁殖发酵 的真核微生物，当环境渗透压高时，耐高糖酵母的细胞内会积累特定溶质， 这种溶质对细胞酶系不出现抑制或灭活的作用，它与水分子结合，来抵御 其胞内水分子外流，保持细胞内外的渗透压。
耐高渗(高糖、高盐)酵母吸引了越来越多的人的关注，它可广泛应用 于化工、食品、医药、发酵领域，目前已有一些耐高渗酵母菌种选育，耐 高渗机理及耐高渗特性以及相关应用的研究，如用耐高渗酵母生产赤藓糖 醇的能力、利用耐高渗酵母菌生产多轻基化合物、耐高渗透压酵母菌应用 于废水处理等，在发酵饮料方面的应用近年来逐渐增加。
季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)在果蔬采后生物防治方面 有较多的研究，比如作为拮抗菌处理采后草莓，抑制真菌侵染引起的樱桃 番茄腐烂，抑制芒果采后炭疽病效果等等。而季也蒙毕赤酵母作为耐高糖 发酵菌用于水果发酵饮料的制备的研究还存在一定空白。
水果发酵饮料不但保有水果天然的营养物质，而且在发酵菌株的作用 下还产生了特别的风味物质。在发酵口味特殊的基础上还运用了水果的药 理价值和营养价值，将其作为日常的饮品对我们的身体大有裨益。国内外 科研工作者对水果发酵饮料保健功能的研究表明其不仅有果蔬的天然香 味，而且富含多种氨基酸和维生素，具有很强的保健功能，适量的饮用对 于某些疾病，如心脑血管病、脑机能的退化以及某些癌症非常有益。
高糖发酵，即培养基中含糖量大于等于25％的发酵，与传统的低糖发 酵相比，它具有减少发酵批次、缩短发酵时间、提高设备利用率、节约能 耗、降低成本等优势。
目前文献中关于猕猴桃等水果发酵饮料工艺方面的研究较多，但大部 分是传统的低糖发酵，加入SO2等物质进行灭菌，会对水果的风味和活性 物质等产生破坏，而高糖条件能在一定程度上抑制杂菌生长，但高糖条件 下水果饮料发酵的相关研究还很少见。
发明内容
本发明提供了一种耐高糖季也蒙毕赤酵母菌株，是能用于水果酵素饮 料高糖发酵工业化生产的菌株。
一种耐高糖季也蒙毕赤酵母菌株，命名为季也蒙毕赤酵母 (Meyerozymaguilliermondii)ZJUQH，该菌株已于2016年12月15日保 藏在位于武汉大学的中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏号为 CCTCC NO：M 2016755。
季也蒙毕赤酵母ZJUQH是从金华地区的野生猕猴桃果皮内部分离筛 选得到的一种特殊酵母菌株。该菌株的主要形态及生物学特征如下：白色、 圆形菌落，表面光滑，酵母菌。通过对该菌株进行生理生化特性测定和16S rRNA测定及系统发育分析，最终鉴定其为季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)的一个菌株。
本发明提供了上述耐高糖季也蒙毕赤酵母菌株在发酵高糖水果生产 水果饮料中的应用。该菌株通过合适的培养方法和培养条件进行发酵，能 够进行高糖水果发酵饮料生产。
本发明还提供了一种发酵高糖水果生产水果饮料的方法，包括：
(1)将季也蒙毕赤酵母ZJUQH分别经固体培养基、液体培养基活化 培养后，得到活化液；
(2)将活化液接入种子培养基进行种子培养，得到的种子液经分离 得到菌体；
(3)将菌体接种到高糖环境的水果浆液中，发酵，得到水果饮料。
步骤(1)中，以重量百分比计，所述液体培养基包括以下原料：酵 母浸粉0.5-1.5％，蛋白胨1.5-2.5％，葡萄糖1.5-2.5％。
所述液体培养基可以为PDB培养基或YPD培养基；优选为YPD培 养基。以重量百分比计，所述的YPD培养基包括以下原料：酵母浸粉1％， 蛋白胨2％，葡萄糖2％，琼脂粉2％；YPD培养基的pH为7.2。
在所述液体培养基中的活化培养温度为26-30℃，培养时间为24-48h。
在所述液体培养基中的活化培养采用摇床振荡培养，摇床转速为 160-220r/min。
步骤(2)中，以重量百分比计，所述种子培养基包括以下原料：酵 母浸粉0.5-1.5％，蛋白胨1.5-2.5％，葡萄糖1.5-2.5％。优选地，所述种子 培养基包括以下原料：酵母浸粉1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％。
所述活化液在种子培养基中的接种量以体积百分比计为5-10％。
所述种子培养的培养温度为26-30℃，培养时间为16-28h。根据季也 蒙毕赤酵母ZJUQH在YPD养基中的生长曲线，可以知道该菌在18h以后 达到生长稳定期，为此，种子液选择在16-28小时接种比较适合。优选地， 培养温度28℃，培养时间20-24h。
所述种子培养采用摇床震荡培养，摇床转速为160-250r/min。
所述分离包括：将种子液进行离心，并用无菌生理盐水洗涤后离心， 重复三次，得到菌体。
优选地，可以采用如下步骤：将种子液装入离心管中，3500-4000r/min 下离心10-15min，除去培养液，加入加无菌生理盐水，混匀后再离心， 除去上清液，重复洗涤3次，得到菌体。
步骤(3)中，所述菌体在水果浆液中的接种量以质量体积百分比计 为0.2-3.0％；优选为0.4-2.0％；更优选为1.2％。优选接种量条件下，水果 发酵饮料的总酸含量和固形物含量适宜，风味最为浓郁，且没有酒味以及 其他不良气味，且对DPPH清除率较高、鳌合铁离子能力较强，有较好的 抗氧化活性，能够起到较好的健康作用。
所述高糖环境的水果浆液为含糖量25-40％。所述水果浆液制作方法 包括：将水果洗净、去皮、切块、打浆后，加入25％-40％的糖。
所述发酵为在25-30℃下发酵10-15天，然后在15-18℃下发酵5-20 天。优选地，可以继续进行后酵1-3年，以使发酵饮料获得醇厚的口感。
所述发酵采用静置培养方式。
本发明提供的季也蒙毕赤酵母菌株ZJUQH是从野生猕猴桃果皮内部 分离得到的内源酵母，能够耐受高糖和一定浓度的酒精，能够在高糖环境 下发酵水果生产酵素饮料，由于高糖环境抑制了其他微生物的生长和繁 殖，所以使用该菌种发酵生产酵素饮料无需将原料水果以及成品饮料进行 灭菌处理，减少高温处理工艺，对维生素C等多种热敏感活性物质没有损 伤，极大地提高了酵素饮料的营养保健功效，对酵素饮料的口感也有很大提升，同时极大地降低了生产的能耗成本，为生产高品质水果饮料提供了 新的途径。
附图说明
图1为季也蒙毕赤酵母ZJUQH在YPD培养基上培养48h的菌落形态；
图2为季也蒙毕赤酵母ZJUQH的分子鉴定比对结果；
图3为季也蒙毕赤酵母ZJUQH在YPD培养基中的生长曲线；
图4为季也蒙毕赤酵母ZJUQH对糖度的耐受性曲线；
图5为季也蒙毕赤酵母ZJUQH对酒精的耐受性曲线。
具体实施方式
实施例1菌株的分离、纯化、鉴定和保藏
1、菌株的分离、纯化
分别取经果皮(金华地区的野生猕猴桃果皮)分离取样并于28℃自发 酵的发酵原菌液5mL加入装有20mL酵母增殖培养液、MRS液体培养基、 醋酸液体培养基的100mL三角瓶中。酵母增殖培养基置于28℃培养箱中 培养2天，MRS液体培养基与醋酸液体培养基置于37℃培养箱中培养3 天。
用无菌生理盐水对增殖培养后的3瓶液体进行稀释，分别取稀释度为 10-4、10-5、10-6稀释液各0.1mL分别接种于事先倒好的YPD固体培养基、 MRS固体培养基、醋酸培养基平板上，用无菌涂布棒涂布均匀，YPD固 体培养基置于28℃培养箱中培养2天，MRS固体培养基与醋酸固体培养 基置于37℃培养箱中培养3天，观察菌落形态，选择具有典型菌落特征的单菌落进一步通过多次平板划线分离纯化，得到纯菌落后根据菌落的颜 色、直径和表面特征等挑取长势良好的单菌落分别接种于YPD固体培养 基试管斜面、MRS液体培养基试管以及醋酸培养基试管斜面，得到两株 典型菌株，进行生理生化和分子鉴定。
2、菌株的鉴定
(1)无菌挑取少量菌落，插入YST卡片，经VITEK2 CPMPACT梅 里埃全自动菌种鉴定仪运行得到结果。其具体生理生化鉴定见表1。该菌 株在YPD培养基上培养48h的菌落形态如图1所示。
表1菌株生化试验结果
注：+表明发酵利用，一表示发酵不利用
(2)菌株的序列测定：将菌株分别进行基因组DNA提取，经1％琼 脂糖凝胶中电泳检测并确认提取成功后，进行ITS rDNA基因片段的PCR 扩增。PCR反应体系(50μL)如下：样本XμL、2×GC buffer 25.0μL、dNTPs(10mM)5.0μL、F(10μM)1.0μL、R(10μM)1.0μL、 rTaq酶0.5μL、ddH2Oto 50.0μL、Total 50.0μL。PCR反应条件是：95℃ 预变性2min，95℃变性30s，55℃退火30s X cycles，72℃延伸40s，72℃ 保温延伸10min，8℃保存。16s和ITS引物的退火温度为55℃，V4区退 火温度为51℃。细菌菌种鉴定为25个循环，真菌菌种鉴定为30个循环。 PCR产物用1％琼脂糖凝胶中电泳检测。产物经切胶纯化后用全自动测序 仪测序。将PCR产物ITS测序结果输入美国国立生物信息中心(NCBI) 网站的核酸数据库比对系统，利用Blast程序进行核酸序列比对分析。用 MEGA 5.0软件构建系统发育树，进行亲缘关系和系统发育分析。
分子鉴定结果显示其为季也蒙毕赤酵母。
(3)根据季也蒙毕赤酵母ZJUQH在营养肉汤培养基中的生长曲线 (见图3)，可以知道该菌在18小时以后达到生长稳定期，为此，种子培 养基选择在16-28小时接种比较适合。
3、菌株的保藏
将季也蒙毕赤酵母ZJUQH保藏在位于湖北省武汉市武昌区八一路珞 珈山武汉大学的中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏日期为 2016年12月15日，保藏号为CCTCCNO：M 2016755。
实施例2季也蒙毕赤酵母ZJUQH糖耐受性测定
(1)菌株的活化：用接种环将季也蒙毕赤酵母ZJUQH划线接种于活 化培养基上，并于恒温培养箱中培养24-72h，培养温度设定为28±2℃； 其中，活化培养基为YPD培养基，YPD包括以下原料(以重量百分比计)： Yeast Extract(酵母浸粉)1％，Peptone(蛋白胨)2％，Dextrose(glucose) (葡萄糖)2％，琼脂粉2％，蒸馏水配制，pH7.2。
(2)活化液的制备：将步骤(1)培养获得的季也蒙毕赤酵母ZJUQH 的单菌落接种于100ml的活化培养液中，并将其置于恒温摇床中振荡培养 36h，温度28±1℃，转速180r/min；其中，活化培养液为YPD液体培养基， 包括：Yeast Extract(酵母浸粉)1％，Peptone(蛋白胨)2％，Dextrose(glucose) (葡萄糖)2％，蒸馏水配制，pH 7.2。
(3)种子液的制备：以体积百分比10％的接种量将步骤(2)获得的 活化液接种于50ml的种子培养液中，并将其置于恒温摇床中振荡培养 20h，温度28±1℃，转速180r/min；其中，种子培养液为YPD液体培养基， 包括：Yeast Extract(酵母浸粉)1％，Peptone(蛋白胨)2％，Dextrose(glucose) (葡萄糖)2％，蒸馏水配制，pH 7.2。
(4)发酵液的制备：以体积百分比为1％的接种量将步骤(3)所获 得的种子液转入已消毒灭菌的发酵培养基中，发酵培养34h，温度28±1℃， 转速180r/min，获得所需的发酵液，收集备用；其中，发酵培养基为葡萄 糖质量浓度分别为10％、20％、30％、40％的YPD培养基，包括以下原料 (以重量百分比计)：Yeast Extract(酵母浸粉)1％，Peptone(蛋白胨)2％，Dextrose(glucose)(葡萄糖)10，20，30，40％，蒸馏水配制，pH 7.2，121℃ 湿热灭菌20min。
(5)OD值测量：将步骤(4)中收集到的发酵液每个样品取1.2mL 加入离心管中，用移液枪取400μl加入装有800μl蒸馏水的小离心管中， 用斡旋仪斡旋混匀后，再取出400μL加入第二根装有800μl蒸馏水的小离 心管，用斡旋仪斡旋混匀后，再取出400μL加入第二根装有800μl蒸馏水 的小离心管中，用斡旋仪斡旋混匀。最后分别取200μL原菌液，稀释3 倍，9倍，27倍的菌液，于96孔板中使用酶标仪测定不同糖质量浓度下 的两种酵母的OD600nm值。每个样品重复测定3次取平均。糖耐受性曲线 见图3所示，图中OD值为稀释9倍后的值，“季”为季也蒙毕赤酵母 ZJUQH，“鲁”为与之比较的鲁氏酵母。
实施例3季也蒙毕赤酵母ZJUQH酒精耐受性测定
(1)菌株的活化：用接种环将季也蒙毕赤酵母ZJUQH划线接种于活 化培养基上，并于恒温培养箱中培养24-72h，培养温度设定为28±2℃； 其中，活化培养基为YPD培养基，YPD包括以下原料(以重量百分比计)： Yeast Extract(酵母浸粉)1％，Peptone(蛋白胨)2％，Dextrose(glucose) (葡萄糖)2％，琼脂粉2％，蒸馏水配制，pH 7.2。
(2)活化液的制备：将步骤(1)培养获得的季也蒙毕赤酵母ZJUQH 的单菌落接种于100ml的活化培养液中，并将其置于恒温摇床中振荡培养 36h，温度28±1℃，转速180r/min；其中，活化培养液为YPD液体培养基， 包括：Yeast Extract(酵母浸粉)1％，Peptone(蛋白胨)2％，Dextrose(glucose) (葡萄糖)2％，蒸馏水配制，pH 7.2。
(3)种子液的制备：以体积百分比10％的接种量将步骤(2)获得的 活化液接种于50ml的种子培养液中，并将其置于恒温摇床中振荡培养 20h，温度28±1℃，转速180r/min；其中，种子培养液为YPD液体培养基， 包括：Yeast Extract(酵母浸粉)1％，Peptone(蛋白胨)2％，Dextrose(glucose) (葡萄糖)2％，蒸馏水配制，pH7.2。
(4)发酵液的制备：以体积百分比为1％的接种量将步骤(3)所获 得的种子液转入已消毒灭菌的发酵培养基中，发酵培养34h，温度28±1℃， 转速180r/min，获得所需的发酵液，收集备用；其中，发酵培养基为酒精 体积分数分别为3％、6％、9％、12％的YPD培养基，包括以下原料(以 重量百分比计)：Yeast Extract(酵母浸粉)1％，Peptone(蛋白胨)2％，Dextrose(glucose)(葡萄糖)2％，乙醇3％、6％、9％、12％(体积分数)， 蒸馏水配制，pH7.2，121℃湿热灭菌20min。
(5)OD值测量：将步骤(4)中收集到的发酵液每个样品取1.2mL 加入离心管中，用移液枪取400μl加入装有800μl蒸馏水的小离心管中， 用斡旋仪斡旋混匀后，再取出400μL加入第二根装有800μl蒸馏水的小离 心管，用斡旋仪斡旋混匀后，再取出400μL加入第二根装有800μl蒸馏水 的小离心管中，用斡旋仪斡旋混匀。最后分别取200μL原菌液，稀释3 倍，9倍，27倍的菌液，于96孔板中使用酶标仪测定不同酒精浓度下的 两种酵母的OD600nm值。每个样品重复测定3次取平均。酒精耐受性曲线 见图4所示，图中OD值为稀释3倍后的值，“季”为季也蒙毕赤酵母 ZJUQH，“鲁”为与之比较的鲁氏酵母。
实施例4季也蒙毕赤酵母ZJUQH发酵生产水果酵素饮料
(1)菌株的活化：用接种环将季也蒙毕赤酵母ZJUQH划线接种于活 化培养基上，并于恒温培养箱中培养24-72h，培养温度设定为28±2℃； 其中，活化培养基为YPD培养基，YPD包括以下原料(以重量百分比计)： Yeast Extract(酵母浸粉)1％，Peptone(蛋白胨)2％，Dextrose(glucose) (葡萄糖)2％，琼脂粉2％，蒸馏水配制，pH 7.2。
(2)活化液的制备：将步骤(1)培养获得的季也蒙毕赤酵母ZJUQH 的单菌落接种于100ml的活化培养液中，并将其置于恒温摇床中振荡培养 36h，温度28±1℃，转速180r/min；其中，活化培养液为YPD液体培养基， 包括：Yeast Extract(酵母浸粉)1％，Peptone(蛋白胨)2％，Dextrose(glucose) (葡萄糖)2％，蒸馏水配制，pH 7.2。
(3)种子液的制备：以体积百分比10％的接种量将步骤(2)获得的 活化液接种于50ml的种子培养液中，并将其置于恒温摇床中振荡培养 20h，温度28±1℃，转速180r/min；其中，种子培养液为YPD液体培养基， 包括：Yeast Extract(酵母浸粉)1％，Peptone(蛋白胨)2％，Dextrose(glucose) (葡萄糖)2％，蒸馏水配制，pH 7.2。
(4)发酵水果浆液制备：发酵用容器用高压蒸汽锅灭菌后备用。将 猕猴桃清洗干净后去皮，再清洗，然后用榨汁机打成果浆，均质，称量后 在每个发酵容器中装500g匀浆，200g白糖。每罐按需称量后加入步骤(3) 获得的酵母菌体，玻璃棒搅拌后，盖上密封盖子，放入25℃的恒温培养箱 中进行发酵。季也蒙毕赤酵母接种量分别为0.4％，1.2％，2％(2g，6g，10g)。 发酵培养的培养温度为25℃发酵10天，18℃发酵5天。用纱布过滤后得 到猕猴桃发酵饮料。
(5)总酸与可溶性固形物的测定：吸取步骤(4)发酵液5mL于150mL 烧杯中，加无二氧化碳的水45mL，烧杯中放入磁力搅拌棒，置于电子搅 拌器上，开启搅拌，用氢氧化钠标准滴定液(0.1mol/L)滴定，开始时可快 速滴加NaOH标准滴定液，当滴定至pH＝7.0时，放慢滴定速度，每次加 半滴氢氧化钠标准滴定液，直至pH＝8.2为滴定终点。记录消耗0.1mol/LNaOH标准滴定液的体积V1。
计算：
样品含酸量(g/L)＝(V1*N/b)*M
V1＝NaOH溶液液用量(毫升)
N＝NaOH液浓度(N＝0.1mol/L)
b＝滴定时用的样品液毫升数
M＝以猕猴桃饮料主要含酸种类的相对分子质量计算，此处用柠檬 酸192。
将步骤(4)得到的酵素饮料稀释5倍后进行测定。
打开手持式折光仪盖板，用干净的纱布或卷纸小心擦干棱镜玻璃面。 在棱镜玻璃面上滴2滴蒸馏水，盖上盖板。
于水平状态，从接眼部处观察，检查视野中明暗交界线是否处在刻度 的零线上。若与零线不重合，则旋动刻度调节螺旋，使分界线面刚好落在 零线上。
打开盖板，用纱布或卷纸将水擦干，然后如上法在棱镜玻璃面上滴2 滴待测液，进行观测，读取视野中明暗交界线上的刻度，即为样品中可溶 性固形物含量(％)(糖的大致含量)。
表2猕猴桃酵素饮料总酸测定结果
表3猕猴桃酵素饮料固形物含量测定结果
(6)感官评定：将步骤(4)得到的饮料稀释2倍后进行感官评定。 设计感官评分标准与评分表如下：
表4感官评定标准
表5感官评定结果
(7)抗氧化性-DPPH自由基清除能力测定：将(4)得到的饮料稀 释5倍后进行测定。分别移取各稀释后样品溶液4mL加入1mL 0.2mM DPPH乙醇溶液中，再取各稀释后各样品溶液4mL加入1mL无水乙醇溶 液中，混匀，以上样品均置于黑暗下静置30min后于517nm波长下测定 其OD值。每个样品平行测定3次，取其平均值。以BHA作为阳性对照。
根据下面公式计算稀释5倍后各个样品对DPPH自由基的清除率：
自由基清除率＝[A0-(A1-A2)]/A0
注：A0为DPPH溶液本身的OD值(空白对照)，A1为加有稀释5 倍后样品或者阳性对照的DPPH，A2为加有稀释5倍后样品或者阳性对照 的乙醇溶液。
表6DPPH自由基清除率结果
DPPH自由基清除能力当中接种1.2％季也蒙毕赤酵母的2号样品清除 率最高，且比空白组更大，说明在发酵过程当中可能产生了增加DPPH自 由基清除能力的抗氧化物质。
(8)抗氧化性-铁离子螯合能力测定：将步骤(4)得到的饮料稀释5 倍后进行测定。在各个样品溶液中均加入3.7mL超纯水、0.1mL 2mmol/L 氯化亚铁和0.2mL 5mmol/Lferrozine，混匀，室温下静置20min，于 562nm处测定其OD值。每个样品平行测定3次，取其平均值。以超纯水 作为空白对照，EDTA二钠盐作为阳性对照。
将10个样品稀释25倍后于562nm处测定其OD值。
根据下面公式计算各样品的铁离子鳌合能力：
铁离子螯合能力＝[A0-(A1-A2)]/A0
注：A0为空白对照的OD值，A1为加有稀释5倍后样品或者阳性对 照的OD值，A2为稀释25倍后的样品。
表7铁离子螯合能力测定结果
铁离子螯合能力当中接种1.2％季也蒙毕赤酵母的2号样品螯合率最 高，且比空白组更大，说明在发酵过程当中可能产生了增加铁离子螯合能 力的物质。
综上，本实施例利用获得的耐高糖季也蒙毕赤酵母ZJUQH生产水果 酵素饮料，对酵素饮料提高营养与保健功能，降低成本，提高品质有极大 的意义。在该接种量下，水果发酵饮料的总酸含量和固形物含量适宜，风 味最为浓郁，且没有酒味以及其他不良气味，且对DPPH清除率较高、鳌 合铁离子能力较强，有较好的抗氧化活性，能够起到较好的健康作用。

Claims (10)

1.一种耐高糖季也蒙毕赤酵母菌株，其特征在于，命名为季也蒙毕赤酵母(Meyerozymaguilliermondii)ZJUQH，保藏号为CCTCC NO：M 2016755。
2.如权利要求1中所述的耐高糖季也蒙毕赤酵母菌株在发酵高糖水果生产水果饮料中的应用。
3.一种发酵高糖水果生产水果饮料的方法，包括：
(1)将季也蒙毕赤酵母ZJUQH分别经固体培养基、液体培养基活化培养后，得到活化液；
(2)将活化液接入种子培养基进行种子培养，得到的种子液经分离得到菌体；
(3)将菌体接种到高糖环境的水果浆液中，发酵，得到水果饮料。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，以重量百分比计，所述液体培养基包括以下原料：酵母粉0.5-1.5％，蛋白胨1.5-2.5％，葡萄糖1.5-2.5％。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，在所述液体培养基中的活化培养温度为26-30℃，培养时间为24-48h。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，以重量百分比计，所述种子培养基包括以下原料：酵母浸粉0.5-1.5％，蛋白胨1.5-2.5％，葡萄糖1.5-2.5％。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述种子培养的培养温度为26-30℃，培养时间为16-28h。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述菌体在水果浆液中的接种量以质量体积百分比计为0.2-3.0％。
9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述高糖环境的水果浆液为含糖量25-40％。
10.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述发酵为在25-30℃下发酵10-15天，然后在15-18℃下发酵5-20天。
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