CN114717148B - 缓解抑郁情绪的副干酪乳杆菌ccfm1229及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了缓解抑郁情绪的副干酪乳杆菌CCFM1229及其应用，属于微生物技术领域。所述副干酪乳杆菌能够减轻抑郁小鼠的抑郁样行为、提高脑中神经递质5‑羟色胺含量、提高抑郁小鼠海马中BDNF水平，抑制下丘脑Crh mRNA的表达，降低血清中的皮质酮水平；所述副干酪乳杆菌能够降低大脑皮层黄嘌呤氧化酶的活性、提高肝脏腺苷脱氨酶的活性、降低血清尿酸含量；提高前额叶Mbp mRNA水平，维持CNS髓鞘结构和功能的稳定；能够提高前额叶Grin1、Grin2a、Grin2b的mRNA水平，对突触可塑性具有非常重要的意义；所述副干酪乳杆菌能够改善肠道菌群多样性并且能够降解氧化乐果，具有广泛的应用前景。

Description

缓解抑郁情绪的副干酪乳杆菌CCFM1229及其应用
技术领域
本发明涉及缓解抑郁情绪的副干酪乳杆菌CCFM1229及其应用，属于微生物技术领域。
背景技术
抑郁症(Major Depressive Disorder，MDD)是一种常见的心境障碍，目前全球有超过3.5亿人患有抑郁症，且近年来发病率持续上升。抑郁症患者持续心情低落，悲观厌世，认知与健康人有偏差，承受精神痛苦，严重时甚至伴有躯体症状。抑郁症是一个重要的公共卫生问题，也是全球疾病负担的主要原因之一。然而，目前被广泛应用于临床治疗的抗抑郁药物，如选择性五羟色胺重摄取抑制剂(Selective Serotonin Reuptake Inhibitor，SSRI)普遍存在起效缓慢、治疗效果不一致、副作用大等缺点，使得抑郁症的治疗存在严重的局限性。
成人肠道中人体肠道内含有超过1000多种微生物，数量为1013～1014，至少是人体细胞数量的10倍，肠道微生物的基因约为300万个，是人类基因组的150倍，因此肠道微生物又被认为是人体的第二基因组。饮食、感染、疾病状态等因素会影响肠道微生物组成，异常的微生物群可以改变行为、免疫和内分泌。肠道菌群及其代谢产物与宿主之间的正常交流，对于维持宿主健康非常重要。
临床研究表明，抑郁症患者的肠道菌群与健康人相比存在显著差异，包括多样性降低、有益菌类群丰度减少等。多项研究均说明，肠道菌群在抑郁症的发生发展中发挥着至关重要的作用。神经功能异常的动物和健康对照动物的肠道菌群之间也存在显著差异。嗅球切除模型、母婴分离模型、社会应激模型、慢性不可预知性应激模型等多种抑郁模型都证实了这一点。因此，肠道菌群在抑郁症的发生发展中发挥着至关重要的作用。肠道菌群参与了中枢神经系统和周围神经功能的调节。肠道菌群影响神经系统的核心过程，包括神经发生、突触可塑性、神经递质信号、神经发育和神经炎症，微生物异常与自闭症谱系障碍、抑郁症和帕金森病等疾病有关。正常的大脑发育以及成年后维持大脑功能需要细菌。神经发生和小胶质细胞激活已经被证明是受微生物群调控的。肠道细菌的完全缺失(无菌小鼠)可导致血脑屏障通透性的改变，小神经胶质细胞的免疫反应受损，髓鞘增加，下丘脑-垂体-肾上腺轴亢进，脑神经化学改变，焦虑和社交行为减少。
益生菌是一种被消费者广泛接受的膳食补充剂。通过益生菌来调节肠道菌群进而改善神经功能，成为治疗抑郁症的一种新的手段。某些双歧杆菌和乳杆菌能够调节神经功能，例如Lactobacillus helveticus R0052、Bifidobacterium longum R0175等。
副干酪乳杆菌是一类革兰氏阳性、不运动、兼性厌氧的乳酸菌。许多研究表明，副干酪乳杆菌作为益生菌，具有分泌细菌素、抵抗致病菌和病毒感染、调节人体免疫等生理功能。本发明筛选的副干酪乳杆菌CCFM1229，不仅具有调节肠道菌群的功能，而且能有效地缓解抑郁症状，拓展了副干酪乳杆菌作为益生菌的应用范围，对于深入挖掘益生菌的功能，开发具有更高保健价值的益生菌具有十分重要的意义。同时，副干酪乳杆菌的抗抑郁潜力，也为利用膳食策略缓解抑郁症开辟出新的途径和解决方案。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)CCFM1229，已于2022年1月27日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62244。
在本发明的一种实施方式中，所述副干酪乳杆菌来自于重庆泡菜，将提取的全基因组送专业测序公司，利用二代测序仪对菌的全基因组进行测序，将得到的序列结果使用BLAST在GeneBank中进行搜索和相似性比对，测序结果鉴定为副干酪乳杆菌，命名为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)CCFM1229。
在本发明的一种实施方式中，副干酪乳杆菌CCFM1229具有以下生物学特性：
(1)菌体特征：呈革兰氏染色阳性，不形成孢子，非运动性的细菌。
(2)菌落特征：呈圆形凸起、光滑、边缘整齐。
(3)生长特性：在37℃恒温条件下，在MRS培养基培养约12h到达对数末期。
(4)对模拟胃肠液具有较强耐受能力。
本发明的第二个目的是提供所述副干酪乳杆菌CCFM1229在制备抗抑郁、抗炎症或降解有机磷农药的产品中的应用。
在本发明的一种实施方式中，用于制备具有(a)～(h)至少一种功能的产品：
(a)减轻抑郁样行为和焦虑样行为；
(b)提高脑中神经递质5-羟色胺含量和BDNF的水平；
(c)降低血清中皮质酮的水平和下丘脑Crh mRNA的表达，从而缓解“下丘脑-垂体-肾上腺轴”功能亢进；
(d)降低大脑皮层黄嘌呤氧化酶的活性、提高肝脏腺苷脱氨酶的活性、降低血清尿酸含量；
(e)提高前额叶Mbp mRNA水平，维持中枢神经系统(CNS)髓鞘结构和功能的稳定；
(f)提高前额叶Grin1、Grin2a、Grin2b的mRNA水平，对突触可塑性具有非常重要的意义；
(g)改善肠道菌群多样性，恢复应激造成的肠道菌群紊乱；
(h)降解有机磷农药氧化乐果。
在本发明的一种实施方式中，所述抗抑郁、抗炎症的产品为药品或保健品；所述降解有机磷农药的产品为化学品。
在本发明的一种实施方式中，所述药品是缓解哺乳动物抑郁和焦虑的药品。
在本发明的一种实施方式中，所述哺乳动物包括但不限于人类。
本发明的第三个目的是提供含有所述副干酪乳杆菌CCFM1229的组合物。
在本发明的一种实施方式中，所述组合物中，上述副干酪乳杆菌CCFM1229的数量≥1×106CFU/mL或≥1×106CFU/g。
在本发明的一种实施方式中，所述组合物中，上述副干酪乳杆菌CCFM1229的数量≥1×109CFU/mL或≥1×109CFU/g。
在本发明的一种实施方式中，所述组合物包括但不限于微生物制剂、功能性食品、保健品或药品。
在本发明的一种实施方式中，所述组合物中含有所述副干酪乳杆菌CCFM1229活菌株、副干酪乳杆菌CCFM1229干菌株、副干酪乳杆菌CCFM1229代谢物、灭活的副干酪乳杆菌CCFM1229菌株中的一种或多种。
在本发明的一种实施方式中，所述组合物为药品。
在本发明的一种实施方式中，所述药品用于减轻抑郁样行为和焦虑样行为。
在本发明的一种实施方式中，所述药品用于提高脑中神经递质5-羟色胺含量和BDNF的水平。
在本发明的一种实施方式中，所述药品用于降低血清中皮质酮的水平和下丘脑Crh mRNA的表达，从而缓解“下丘脑-垂体-肾上腺轴”功能亢进。
在本发明的一种实施方式中，所述药品用于降低大脑皮层黄嘌呤氧化酶的活性、提高肝脏腺苷脱氨酶的活性、降低血清尿酸含量。
在本发明的一种实施方式中，所述药品用于提高前额叶Mbp mRNA水平，维持中枢神经系统(CNS)髓鞘结构和功能的稳定。
在本发明的一种实施方式中，所述药品用于提高前额叶Grin1、Grin2a、Grin2b的mRNA水平，对突触可塑性具有非常重要的意义。
在本发明的一种实施方式中，所述药品用于改善肠道菌群多样性，恢复应激造成的肠道菌群紊乱。
在本发明的一种实施方式中，所述药品用于降解有机磷农药氧化乐果。
在本发明的一种实施方式中，所述药品还含有药学上可接受的载体。
在本发明的一种实施方式中，所述药学上可接受的载体包括但不限于：填充剂、润湿剂、崩解剂、粘合剂或润滑剂中的一种或多种。
在本发明的一种实施方式中，所述填充剂为微晶纤维素、乳糖、甘露醇、淀粉或糊精中的一种或多种；所述润湿剂为乙醇或甘油中的一种或多种；所述崩解剂为羧甲基淀粉钠、交联羧甲基淀粉钠、交联聚维酮或低取代羟丙基纤维素中的一种或多种；所述粘合剂为淀粉糊、糖浆、饴糖、炼蜜或液状葡萄糖中的一种或多种；所述润滑剂为硬脂酸镁、硬脂酸富马酸钠、滑石粉或二氧化硅中的一种或多种。
本发明还提供了一种产品，所述产品中含有上述副干酪乳杆菌CCFM1229，或上述组合物。
本发明的一种实施方式中，所述产品为食品、药品或保健品。
本发明的一种实施方式中，所述食品为：固态食品、半固态食品或液态食品。
本发明的一种实施方式中，所述药品含有药学上可接受的载体或辅料。
在本发明的一种实施方式中，所述药品还含有药学上可接受的载体。
在本发明的一种实施方式中，所述药学上可接受的载体包括但不限于：填充剂、润湿剂、崩解剂、粘合剂或润滑剂中的一种或多种。
在本发明的一种实施方式中，所述填充剂为微晶纤维素、乳糖、甘露醇、淀粉或糊精中的一种或多种；所述润湿剂为乙醇或甘油中的一种或多种；所述崩解剂为羧甲基淀粉钠、交联羧甲基淀粉钠、交联聚维酮或低取代羟丙基纤维素中的一种或多种；所述粘合剂为淀粉糊、糖浆、饴糖、炼蜜或液状葡萄糖中的一种或多种；所述润滑剂为硬脂酸镁、硬脂酸富马酸钠、滑石粉或二氧化硅中的一种或多种。
本发明还要求保护所述副干酪乳杆菌CCFM1229在制备发酵食品中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述应用包括但不限于将所述副干酪乳杆菌CCFM1229作为发酵微生物，利用食品原料进行发酵。
有益效果
(1)本发明提供的副干酪乳杆菌CCFM1229能够减轻抑郁样行为和焦虑样行为；提高脑中神经递质5-羟色胺含量和BDNF的水平；降低血清中皮质酮的水平和下丘脑Crh mRNA的表达，从而缓解“下丘脑-垂体-肾上腺轴”功能亢进。
(2)本发明提供的副干酪乳杆菌CCFM1229能够降低大脑皮层黄嘌呤氧化酶的活性、提高肝脏腺苷脱氨酶的活性、降低血清尿酸含量。
(3)本发明提供的副干酪乳杆菌CCFM1229能够提高前额叶Mbp mRNA水平，维持中枢神经系统(CNS)髓鞘结构和功能的稳定；提高前额叶Grin1、Grin2a、Grin2b的mRNA水平，对突触可塑性具有非常重要的意义。
(4)本发明提供的副干酪乳杆菌CCFM1229能够改善肠道菌群多样性，恢复应激造成的肠道菌群紊乱。
(5)本发明提供的副干酪乳杆菌CCFM1229可用于制备缓解抑郁和焦虑的功能性菌剂、食品和药物。
(6)本发明提供的副干酪乳杆菌CCFM1229可用于降解有机磷农药氧化乐果，具有广泛的应用前景。
生物材料保藏
副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)CCFM1229，分类命名为Lactobacillusparacasei，已于2022年1月27日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62244，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
附图说明
图1：小鼠在旷场实验、埋珠实验、明暗箱实验中的表现；其中，(A)为小鼠在旷场实验中心区域停留时间(百分比)；(B)为小鼠在埋珠实验中的埋珠个数；(C)为小鼠在明暗箱实验中进入明箱的次数；其中#P<0.05，##P<0.01；*P<0.05，**P<0.01。
图2：小鼠在悬尾实验和强迫游泳实验中的表现；其中，(A)为小鼠在悬尾实验中静止不动的时间；(B)为小鼠在强迫游泳实验中静止不动的时间；其中#P<0.05，##P<0.01；*P<0.05，**P<0.01。
图3：CCFM1229对小鼠脑组织中神经递质5-HT含量和BDNF含量的影响；其中，(A)为前额叶中5-HT的浓度；(B)为海马中BDNF的浓度；其中*P<0.05，**P<0.01。
图4：CCFM1229对抑郁小鼠HPA亢进的缓解作用；其中，(A)为下丘脑中Crh mRNA的表达水平；(B)为血清中皮质酮的水平。其中#P<0.05，##P<0.01；*P<0.05，**P<0.01。
图5：CCFM1229对抑郁小鼠嘌呤代谢的影响；其中，(A)为大脑皮层黄嘌呤氧化酶的活性；(B)为肝脏腺苷脱氨酶活性；(C)为血清中尿酸的含量；其中#P<0.05，##P<0.01；*P<0.05，**P<0.01。
图6：CCFM1229对抑郁小鼠髓鞘生成和突触可塑性的影响；其中，(A)为前额叶MBPmRNA水平；(B)为前额叶Grin1的mRNA水平；(C)为前额叶Grin2a的mRNA水平；(D)为前额叶Grin2b的mRNA水平；其中#P<0.05，##P<0.01；*P<0.05，**P<0.01。
图7：CCFM1229对小鼠肠道菌群的影响；其中，(A)为香浓指数；(B)为辛普森指数；(C)为faith-pd；其中#P<0.05，##P<0.01；*P<0.05，**P<0.01。
图8：CCFM1229对小鼠盲肠内容物丁酸含量的影响；其中*P<0.05，**P<0.01。
图9：CCFM1229对有机磷农药氧化乐果的降解率。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
下述实施例中所涉及的6周龄雄性C57BL/6J小鼠购自维通利华，下述实施例中所记载的副干酪乳杆菌ATCC25302购自美国模式培养物集存库(American Type CultureCollection,ATCC)。
下述实施例中所涉及的副干酪乳杆菌FZJHZD29L1公开于“李晓姝.不同来源的副干酪乳杆菌的基因组及生理特性差异研究[D].江南大学，2019.”论文当中，为了表述方便，将其简写为副干酪乳杆菌29L1。
下述实施例所涉及的培养基如下：
MRS液体培养基：(1L)：蛋白胨10g、牛肉膏10g、葡萄糖20g、乙酸钠5g、酵母提取物5g、柠檬酸氢二胺2g、K2HPO4 2g、MgSO4·7H2O 0.1g、MnSO4·H2O 0.05g、吐温80 1mL。
MRS固体培养基：在MRS液体培养基的基础上添加琼脂15～20g。
下述实施例中所涉及的行为学测试方法如下：
旷场实验
实验在安静的环境下进行。将动物放入旷场中心后，立刻开始计时和录像，观测10min后停止录像。更换动物时，为避免影响下次测试结果，须先清洗旷场内壁及底面，以清除上次动物余留的信息(如大小便、气味等)。使用EthoVision软件对视频进行数字化分析，计算小鼠在旷场中心区域停留的时间百分比：(旷场中心区域停留时间/总监测时间)×100％。
埋珠实验
在鼠笼里铺上5cm厚玉米芯垫料，铺平；玉米芯垫料上放入20颗玻璃珠(直径15mm)，分五排，每排4颗，规律排布。将小鼠放入笼中，摄像30min。将垫料铺平后重复使用。统计所埋玻璃珠的数量(被埋体积大于50％)。
明暗箱实验
将小鼠面向明箱，放入穿梭箱正中格，使用EthoVision实时监控系统记录小鼠5min的活动情况，计算小鼠进入明箱的次数。
悬尾实验
悬尾实验与强迫游泳实验类似，也是一种行为绝望模型。将小鼠尾部后1/3处用胶带固定，悬挂于支架上，头部距离台面30cm，进行摄像，摄像背景与小鼠毛色呈明显反差。计时5min后停止，利用小动物行为学分析软件对小鼠的不动时间进行统计。其中，不动状态是指动物放弃主动挣扎，处于完全不动的状态。
强迫游泳实验
3L实验桶内装有大约2.2L的清水，水温24±1℃，在正式实验前24小时，每只小鼠均进行10分钟的适应性游泳训练。正式实验时，每只小鼠进行6分钟游泳测试。使用EthoVision实时监控系统进行录像和分析，计算小鼠的不动时间(Immobility，判定标准为四肢不动或仅后肢轻微运动)。
5-HT的含量的检测：
采用HPLC检测5-HT的含量。在配备有荧光检测器(Waters 2475)和T3柱(WatersXSelect HSS T3 Column，5μm，4.6mm×250mm，1/pk)的Waters 2695Alliance HPLC装置上进行5-羟色胺(5-HT)的HPLC分析。流动相由乙腈和PBS缓冲液(pH 4.0)组成，初始比例为5:95(v/v)，梯度洗脱。将色谱柱加热至30℃，在320nm的发射波长和280nm的激发波长下通过荧光检测。
促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)的mRNA测定
取小鼠脑组织，并于冰上分离下丘脑，采用Trizol法提取RNA。采用常规方法提取下丘脑总RNA，根据反转录试剂盒的说明进行cDNA的合成(HiScript III RT SuperMix forqPCR(+gDNA wiper)，Vazyme)。合成的cDNA样品经过超微量分光光度计(NanoDrop 2000C)检测其浓度和纯度(A260/A280)，-80℃保存待用。用荧光染料SYBR Green super mix(Qiagen,Germany)混合样本，PCR体系为5μL mix、1μL cDNA、1μL正向和反向引物，用dd水补至总体积为10μL。在实时荧光定量基因扩增仪器CFX384TMReal-Time System(Bio-Rad，USA)上进行检测，每个样本设立3个平行孔，并以管家基因GAPDH为内参，所得结果用2-ΔΔCq的方法进行分析；所用的引物序列见表1。
表1qPCR引物序列
小鼠前额叶中髓鞘碱性蛋白(MBP)的Mbp mRNA表达量、离子型谷氨酸受体基因Grin1、Grin2a、Grin2b mRNA表达量的检测：
取小鼠脑组织，并于冰上分离前额叶，采用Trizol法提取RNA。采用常规方法提取前额叶总RNA，根据反转录试剂盒的说明进行cDNA的合成(HiScript III RT SuperMix forqPCR(+gDNA wiper)，Vazyme)。合成的cDNA样品经过超微量分光光度计(NanoDrop 2000C)检测其浓度和纯度(A260/A280)，-80℃保存待用。用荧光染料SYBR Green super mix(Qiagen,Germany)混合样本，PCR体系为5μL mix、1μL cDNA、1μL正向和反向引物，用dd水补至总体积为10μL。在实时荧光定量基因扩增仪器CFX384TMReal-Time System(Bio-Rad，USA)上进行检测，每个样本设立3个平行孔，并以管家基因GAPDH为内参，所得结果用2-ΔΔCq的方法进行分析；所用的引物序列见表2。
表2qPCR引物序列
小鼠肠道菌群丰度的检测
收集近盲肠端结肠内容物，采用MP的粪便试剂盒提取小鼠结肠内容物样品中总DNA。具体操作步骤如下主要参照试剂盒说明书进行。以小鼠结肠内容物基因组为模板，以上游引物520F(5′-AYTGGGYDTAAAGNG-3′)、下游引物802R(5′-TACNVGGGTATCTAATCC-3′)为引物扩增16S rDNA的V3-V4区片段，目的片段长度为247bp左右。
PCR反应结束，将观察到目的条带的所有PCR样品再次进行电泳，配制2.0％琼脂糖凝胶，于120V条件下电泳40min，跑胶结束后，在紫外灯下快速进行目的条带的切割。按照QIAquick Gel Extraction Kit胶回收试剂盒说明书进行目的条带胶回收。
根据Qubit DNA3.0试剂盒检测样品DNA浓度，随后根据TurSeq DNA LT SamplePreparation Kit及其说明构建文库，最后根据MiSeq Regent Kit及其说明经过IlluminaMiseq测序仪上机测定。
测序完成后，剔除掉序列长度＜200bp、引物序列、不能拼接的单序列，按照重叠碱基>10bp且无错配的标准拼接序列。将相似度大于97％序列定义为一个分类单元(Operational Taxonomic Unit，OTU)，通过Ribosomal Database Project(RDP)Bayesclassifier来确定物种。计算样品的α-多样性，用来评估样品的菌群多样性。
其中α-多样性用香浓指数(shannon index)、辛普森指数(simpson index)和系统发育多样性(Faith’s Phylogenetic Diversity,faith-pd)来表征。
小鼠盲肠内容物丁酸含量的检测：
称取干燥后的适量盲肠内容物，加入500uL饱和NaCl，震荡均匀；加入40uL 10％的硫酸，震荡均匀；加入1mL乙醚，震荡均匀；18000g，4℃离心15min，取上清至2mL EP管，加入0.25g无水硫酸钠。18000g，4℃离心15min。取500uL上清液至气相小瓶，通过GC-MS以选择离子扫描的方式检测丁酸的含量。
小鼠脑内黄嘌呤氧化酶活性、肝脏腺苷脱氨酶活性、血清尿酸含量的检测：
采用化学法试剂盒检测。
小鼠脑内BDNF、皮质酮的检测：
采用ELISA试剂盒检测。
实施例1：副干酪乳杆菌CCFM1229的获得、鉴定
1、副干酪乳杆菌的分离筛选：
(l)取1mL重庆泡菜水，梯度稀释后涂布于MRS固体培养基，置于厌氧环境下37℃培养72小时；观察记录菌落形态，挑取菌落划线纯化；在MRS液体培养基中，37℃培养48小时，所得菌落进行革兰氏染色，记录菌落形态。弃除菌落中的革兰氏阴性菌菌株和革兰氏阳性球菌，挑选得到革兰氏阳性杆菌。
(2)过氧化氢酶分析后，弃除过氧化氢酶阳性菌株，保留过氧化氢酶阴性菌株。
2、副干酪乳杆菌的分子生物学鉴定：
(l)单菌基因组抽提：将步骤1所筛选得到的过氧化氢酶阴性菌株培养过夜，取培养过夜的菌悬液l mL于1.5mL离心管，10000rpm离心2min，弃上清得菌体；用l mL无菌水吹洗菌体后，10000rpm离心2min，弃上清得菌体；加入200μL SDS裂解液，80℃水浴30min；加入酚-氯仿溶液200μL于菌体裂解液中，其中酚-氯仿溶液的组成成分及体积比为Tris饱和酚:氯仿:异戊醇＝25:24:1，颠倒混匀后，12000rpm离心5～10min，取上清200μL；加入400μL冰乙醇或冰异丙醇于200uL上清中，-20℃静置1h，12000rpm离心5～10min，弃上清；加入500μL70％(体积百分数)冰乙醇重悬沉淀，12000rpm离心1～3min，弃上清；60℃烘箱烘干，或者自然晾干；50μL ddH2O重溶沉淀以备PCR；
(2)16S rDNA PCR：
A.细菌16S rDNA50μLPCR反应体系：10×Taq buffer，5μL；dNTP，5μL；27F，0.5μL；1492R，0.5μL；Taq酶，0.5μL；模板，0.5μL；ddH2O，38μL。
B.PCR条件：95℃5min；95℃10s；55℃30s；72℃30s；step2-4 30×；72℃5min；12℃2min；
C.制备1％琼脂糖凝胶，之后将PCR产物与10000×loading buffer混合，上样量2μL，120V跑30min，然后进行凝胶成像；
D.将得到PCR产物送专业测序公司，将得到的测序结果与使用BLAST在GeneBank中进行搜索和相似性比对，鉴定为副干酪乳杆菌。
(3)全基因组测序
将提取的全基因组送专业测序公司，利用二代测序仪对菌的全基因组进行测序，其EFL151582-27F序列如SEQ ID NO.1所示，其EFL151582-1492R序列如SEQ ID NO.2所示，将得到的序列结果使用BLAST在GeneBank中进行搜索和相似性比对，测序结果鉴定为属于乳酸片球菌的一种新发现的菌株。命名为副干酪乳杆菌CCFM1229，将菌株-80℃保藏备用。
3、所述副干酪乳杆菌CCFM1229具有以下生物学特性：
(1)菌体特征：呈革兰氏染色阳性，不形成孢子，不运动的细菌。
(2)菌落特征：菌落呈乳白色，圆形，边缘整齐，微凸起，不透明，表面湿润光滑；
(3)生长特性：该菌株的最低生长温度为15℃，最高生长温度为45℃，在温度35-37℃下生长最佳，最适生长pH为6.5，培养18h后进入稳定期；
(4)在抑郁小鼠模型中能够显著改善小鼠的行为学表现；
(5)在抑郁小鼠模型中能够提高小鼠脑中的5-HT的水平；
(6)在抑郁小鼠模型中能够显著降低下丘脑Crh mRNA的表达，降低血清中皮质酮浓度；
(7)在抑郁小鼠模型中能够显著提高海马脑源性神经营养因子(BDNF)的含量；
(8)在抑郁小鼠模型中能够显著调节宿主的嘌呤代谢，如大脑皮层黄嘌呤氧化酶活性、肝脏腺苷脱氨酶活性和血清尿酸含量；
(9)在抑郁小鼠模型中能够调节前额叶的髓鞘碱性蛋白和N-甲基-D-天冬氨酸受体mRNA的表达；
(10)能够提高肠道菌群α-多样性，改善抑郁小鼠的肠道菌群紊乱；
(11)能够降解有机磷农药氧化乐果。
实施例2：副干酪乳杆菌CCFM1229能够减少小鼠的抑郁样行为
具体步骤如下：
(1)乳酸菌灌胃剂：
菌株的活化：
分别菌库中保藏的副干酪乳杆菌CCFM1229、副干酪乳杆菌29L1、副干酪乳杆菌ATCC25302分别MRS平板划线，在37℃培养48h后，从平板上分别挑取一个单菌落接种至相应的5mL MRS液体培养基中，在37℃培养24h后，按照2％(v/v)的比例接种至相应的新鲜MRS液体培养基中，在37℃下培养24h，分别制备得到副干酪乳杆菌CCFM1229种子液、副干酪乳杆菌29L1种子液、副干酪乳杆菌ATCC25302种子液。
菌悬液的制备：
分别取上述活化2代的副干酪乳杆菌CCFM1229、副干酪乳杆菌29L1，副干酪乳杆菌ATCC25302的种子液，按照2％(v/v)的比例接种至MRS液体培养基中，在37℃下培养24h，分别得到培养液，将得到的培养液于4℃、8000r/min条件下离心3min后收集菌体，弃去上清，并用质量分数为5％的灭菌脱脂乳液重悬菌体，分别制备得到终浓度均为5×109CFU/mL的副干酪乳杆菌CCFM1229菌悬液、副干酪乳杆菌29L1菌悬液、副干酪乳杆菌ATCC25302菌悬液。
上述菌悬液做灌胃使用，其中，灌胃体积为0.2mL/只/天。
(2)取6周龄雄性C57BL/6J小鼠38只，适应环境一周后，随机分为五组：正常对照组、抑郁模型组、副干酪乳杆菌CCFM1229干预组、副干酪乳杆菌29L1干预组、副干酪乳杆菌ATCC25302干预组，每组含7-9只小鼠。动物分组及处理方法见表3，其中对照溶剂为质量分数为10％脱脂乳溶液。
表3动物实验分组及处理方法
表3中的慢性不可预知应激的处理方法为：每天随机采用1-2种刺激，每天刺激的时间随机决定，避免昼夜节律。每种方法不超过三次，为期六周。刺激因素包括：(1)禁食24h；(2)禁水+空瓶刺激24h；(3)夹尾3min，重复三次；(4)潮湿垫料24h；(5)制动6h；(6)45°倾斜笼盒24h；(7)持续光照24h；(8)无垫料24h；(9)强迫游泳15分钟；(10)孤养24h；(11)拥挤刺激24h。
第八周开始，停止每日的慢性不可预知应激以及益生菌的干预，同时对所有小鼠进行行为学测试。包括明暗箱实验、埋珠实验、旷场实验、悬尾实验和强迫游泳实验。
(1)旷场实验
结果如图1A所示，其中，正常对照组、抑郁模型组、CCFM1229干预组、29L1干预组、ATCC25302干预组的中心区域停留时间分别为：16.17±4.40％、9.52±2.19％、15.63±4.31％、10.73±3.07％、11.26±1.96％，可见，抑郁模型组小鼠在旷场中心区域停留的时间百分比显著降低，服用副干酪乳杆菌CCFM1229能够显著改善这一症状。
(2)埋珠实验
结果如图1B所示，其中，正常对照组、抑郁模型组、CCFM1229干预组、29L1干预组、ATCC25302干预组的小鼠埋珠个数分别为：5.88±2.59、11.33±3.08、9.43±3.15、8.50±2.59、10.71±2.29；可见，抑郁模型组小鼠埋珠个数显著增加，服用副干酪乳杆菌CCFM1229能够改善这一症状。
(3)明暗箱实验
结果如图1C所示，其中，正常对照组、抑郁模型组、CCFM1229干预组、29L1干预组、ATCC25302干预组的小鼠进入明箱的次数分别为：11.86±2.67、7.33±2.29、9.00±1.53、6.33±1.97、7.00±1.16；可见，抑郁模型组小鼠进入明箱的次数显著降低，服用副干酪乳杆菌CCFM1229能够显著改善这一症状。
(4)悬尾实验
实验结果如图2A所示，其中，正常对照组、抑郁模型组、CCFM1229干预组、29L1干预组、ATCC25302干预组的小鼠不动时间分别为：51.79±9.87％、67.04±13.91％、48.14±21.08％、50.95±21.42％、57.62±14.85％；可见，抑郁模型组小鼠在悬尾实验中静止不动的时间显著增加，而服用副干酪乳杆菌CCFM1229能够降低其不动时间，缓解其抑郁状态。
(5)强迫游泳实验
实验结果如图2B所示，其中，正常对照组、抑郁模型组、CCFM1229干预组、29L1干预组、ATCC25302干预组的小鼠不动时间分别为：47.24±18.75％、62.93±10.98％、30.68±10.08％、58.92±5.59％、56.53±5.17％；可见，抑郁模型组小鼠在强迫游泳实验中静止不动的时间显著增加，而服用副干酪乳杆菌CCFM1229能够降低其不动时间，缓解其抑郁状态。
实施例3：副干酪乳杆菌CCFM1229能显著提高抑郁小鼠脑中神经递质(5-HT)水平
具体实施方式同实施例2，实施例2中的小鼠于第八周末安乐处死，取小鼠脑组织，并于冰上分离前额叶。
分别取一定质量的新鲜前额叶皮层，加入30倍体积的0.2M的高氯酸溶液(相当于1g组织加30mL的匀浆液高氯酸溶液)，用组织匀浆器进行匀浆，组织液经过12000g、10min离心后，吸取上清液经0.22μm水系滤膜过滤后，采用HPLC检测5-HT的含量。
实验结果如图3A所示，其中，正常对照组、抑郁模型组、CCFM1229干预组、29L1干预组、ATCC25302干预组的小鼠5-HT的含量分别为：136.02±23.82、95.79±6.47、120.17±19.15、98.18±8.91、99.21±13.02ng/mL；结果表明，服用副干酪乳杆菌CCFM1229能够显著逆转慢性应激造成的前额叶皮层中5-HT水平的降低。其中，副干酪乳杆菌CCFM1229对前额叶皮层中5-HT的改善程度优于副干酪乳杆菌29L1和ATCC25302，显示出良好的抗抑郁治疗潜力。
实施例4：副干酪乳杆菌CCFM1229能够提高抑郁小鼠海马BDNF水平
具体实施方式同实施例2，将实施例2中的小鼠于第八周末安乐处死，取小鼠脑组织，并于冰上分离海马组织。
分别取一定质量的新鲜海马组织，加入9倍体积的生理盐水(相当于1g组织加9mL的匀浆液生理盐水)，用组织匀浆器进行匀浆，用ELISA试剂盒检测海马BDNF的含量。
实验结果如图3B所示，其中，正常对照组、抑郁模型组、CCFM1229干预组、29L1干预组、ATCC25302干预组的小鼠海马BDNF的含量分别为：58.95±14.45、41.42±4.23、49.90±8.58、40.26±2.56、41.31±3.51ng/L；结果表明，服用副干酪乳杆菌CCFM1229能够显著逆转慢性应激造成的海马组织中BDNF水平的降低。其中，副干酪乳杆菌CCFM1229对海马中BDNF的改善程度优于副干酪乳杆菌29L1和ATCC25302，显示出良好的抗抑郁治疗潜力。
实施例5：副干酪乳杆菌CCFM1229能够缓解抑郁小鼠HPA功能亢进
具体实施方式同实施例2，将实施例2中的小鼠于第八周末安乐处死，收集小鼠血液，在1500g条件下离心15min获得血清。取小鼠脑组织，并于冰上分离下丘脑。
用ELISA试剂盒检测血清中皮质酮的含量，并检测下丘脑中促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)的Crh mRNA的表达量，实验结果如图4所示。
如图4A所示，正常对照组、抑郁模型组、CCFM1229干预组、29L1干预组、ATCC25302干预组的下丘脑的Crh mRNA的表达量分别为：1.22±0.74、1.98±1.07、1.41±0.63、2.10±0.32、1.92±0.29；
如图4B所示，正常对照组、抑郁模型组、CCFM1229干预组、29L1干预组、ATCC25302干预组的小鼠皮质酮的含量分别为：52.26±7.31、66.16±14.15、50.00±6.06、67.58±12.50、63.37±10.60；
结果显示，抑郁模型小鼠由于持续的慢性应激，出现下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA)功能亢进，下丘脑的Crh mRNA表达显著增多，并导致血清中皮质酮浓度显著上升，服用副干酪乳杆菌CCFM1229能显著降低Crh mRNA的表达，降低血清皮质酮水平，从而缓解HPA亢进，显示出良好的抗抑郁功效。
实施例6：副干酪乳杆菌CCFM1229对抑郁小鼠的嘌呤代谢调节作用
具体实施方式同实施例2，将实施例2中的小鼠于第八周末安乐处死，收集小鼠血液，1500g离心15min获得血清。用试剂盒检测血清中尿酸的含量。
并取小鼠脑组织和肝脏，于冰上分离大脑皮层。分别取一定质量的新鲜大脑皮层和肝脏组织，加入9倍体积的生理盐水(相当于1g组织加9mL的匀浆液生理盐水)，用组织匀浆器进行匀浆，用试剂盒检测大脑皮层黄嘌呤氧化酶的活性和肝脏腺苷脱氨酶的活性，实验结果如图5所示。
如图5A所示，正常对照组、抑郁模型组、CCFM1229干预组、29L1干预组、ATCC25302干预组的小鼠大脑皮层黄嘌呤氧化酶的活性分别为：0.58±0.11、0.72±0.10、0.59±0.13、0.76±0.15、0.73±0.12U/gprot；
如图5B所示，正常对照组、抑郁模型组、CCFM1229干预组、29L1干预组、ATCC25302干预组的小鼠大脑皮层肝脏腺苷脱氨酶的活性分别为：28.51±4.76、18.42±2.87、25.89±8.67、24.27±5.16、21.67±4.27U/gprot；
如图5C所示，正常对照组、抑郁模型组、CCFM1229干预组、29L1干预组、ATCC25302干预组的小鼠血清尿酸的含量分别为：90.77±39.16μmol/L、164.10±31.38μmol/L、102.56±37.87μmol/L、119.41±35.37μmol/L、139.81±22.73μmol/L；
结果显示，副干酪乳杆菌CCFM1229均能显著改善抑郁小鼠的嘌呤代谢紊乱，通过降低大脑皮层的黄嘌呤氧化酶活性改善焦虑状态。此外，副干酪乳杆菌CCFM1229调节了抑郁模型小鼠的腺苷脱氨酶活性和血清尿酸含量。
实施例7：副干酪乳杆菌CCFM1229对抑郁小鼠髓鞘生成和突触可塑性的影响
具体实施方式同实施例2，将实施例2中的小鼠于第八周末安乐处死，取小鼠脑组织，并于冰上分离前额叶，检测小鼠前额叶中髓鞘碱性蛋白(MBP)的Mbp mRNA表达量、离子型谷氨酸受体基因Grin1、Grin2a、Grin2b mRNA表达量，实验结果如图6A～D及表4所示。
表4：不同组别小鼠前额叶中髓鞘碱性蛋白(MBP)的Mbp mRNA表达量、离子型谷氨酸受体基因Grin1、Grin2a、Grin2b mRNA表达量
结果显示，抑郁模型小鼠由于持续的慢性应激，前额叶出现髓鞘碱性蛋白(MBP)mRNA表达减少，离子型谷氨酸受体基因Grin1、Grin2a、Grin2b mRNA表达显著减少，服用副干酪乳杆菌CCFM1229能显著升高Mbp mRNA的表达，从而维持CNS髓鞘结构和功能的稳定；服用副干酪乳杆菌CCFM1229能显著升高Grin1、Grin2a、Grin2b mRNA的表达，显示出良好的抗抑郁功效。
实施例8：副干酪乳杆菌CCFM1229对抑郁小鼠肠道菌群及代谢物的调节作用
具体实施方式同实施例2，将实施例2中的小鼠于第八周末安乐处死，收集近盲肠端结肠内容物，采用MP的粪便试剂盒提取小鼠结肠内容物样品中总DNA，检测小鼠肠道菌群的丰度；结果如图7A～图7C所示。
正常对照组、抑郁模型组、CCFM1229干预组、29L1干预组、ATCC25302干预组的小鼠肠道菌群香浓指数分别为：6.24±0.25、5.42±0.39、5.90±0.40、5.75±0.26、5.45±0.43；
正常对照组、抑郁模型组、CCFM1229干预组、29L1干预组、ATCC25302干预组的小鼠肠道菌群辛普森指数分别为：0.97±0.0049、0.94±0.0202、0.95±0.0298、0.95±0.0111、0.93±0.0130；
正常对照组、抑郁模型组、CCFM1229干预组、29L1干预组、ATCC25302干预组的小鼠肠道菌群系统发育多样性指数分别为：13.40±2.47、9.88±1.12、12.51±3.02、10.76±2.06、10.33±1.08；
结果显示，抑郁模型小鼠的肠道菌群，α-多样性降低，表明抑郁伴随着一定程度的肠道菌群紊乱。服用副干酪乳杆菌CCFM1229能显著上调肠道菌群的α-多样性，改善肠道菌群的物种丰度。
实施例9：本发明副干酪乳杆菌CCFM1229对丁酸的影响
具体实施方式同实施例2，将实施例2中的小鼠于第八周末安乐处死，收集小鼠盲肠内容物。称取干燥后的适量盲肠内容物，加入500μL饱和NaCl，震荡均匀；加入40μL 10％的硫酸，震荡均匀；加入1mL乙醚，震荡均匀；18000g，4℃离心15min，取上清至2mL EP管，加入0.25g无水硫酸钠。18000g，4℃离心15min。取500μL上清液至气相小瓶，通过GC-MS以选择离子扫描的方式检测丁酸的含量。
实验结果如图8所示，其中，正常对照组、抑郁模型组、CCFM1229干预组、29L1干预组、ATCC25302干预组的小鼠盲肠内容物的丁酸含量分别为：22.52±5.88μmol/g、20.06±6.40μmol/g、30.21±16.39μmol/g、23.18±8.74μmol/g、22.84±5.55μmol/g。
结果显示，副干酪乳杆菌CCFM1229能显著提高抑郁小鼠盲肠内容物的丁酸水平，且效果优于现有菌株。
实施例10：副干酪乳杆菌CCFM1229能够降解有机磷农药氧化乐果
(1)菌株的活化：
分别菌库中保藏的副干酪乳杆菌CCFM1229、副干酪乳杆菌29L1、副干酪乳杆菌ATCC25302分别MRS平板划线，在37℃培养48h后，从平板上分别挑取一个单菌落接种至相应的5mL MRS液体培养基中，在37℃培养24h后，按照2％(v/v)的比例接种至相应的新鲜MRS液体培养基中，在37℃下培养24h后，按照2％(v/v)的比例接种至相应的新鲜MRS液体培养基中，在37℃下培养24h分别制备得到副干酪乳杆菌CCFM1229种子液、副干酪乳杆菌29L1种子液、副干酪乳杆菌ATCC25302种子液。
(2)分别将上述活化三代的待试菌株的种子液以接种量1×107cfu/mL接种到含终浓度为0.5mg/kg氧化乐果的MRS液体培养基中，37℃培养24h，得到发酵液；
(3)取8mL发酵液，加入2mL甲醇，离心去除菌体，过0.22μm滤膜。HPLC检测：C18柱，粒径5μm，检测波长220nm，流动相水：甲醇＝4：1，流速1.0mL/min，柱温40℃，进样量10μL。
实验结果如图9所示，其中，副干酪乳杆菌CCFM1229、副干酪乳杆菌29L1、副干酪乳杆菌ATCC25302的氧化乐果降解率分别为：29.39±3.48％、4.56±1.05％、9.23±1.77％。
结果显示，副干酪乳杆菌CCFM1229能够降解氧化乐果，且效果优于现有菌株。
实施例11：利用本发明副干酪乳杆菌CCFM1229制造含该菌的发酵食品
选用新鲜蔬菜洗净后榨汁，接着进行高温瞬间灭菌，在温度140℃下高温热杀菌2秒后，立即降温至37℃，再接入本发明制备的副干酪乳杆菌CCFM1229菌剂发酵剂，使其浓度达到108CFU/mL以上，在温度4℃下冷藏保存，于是得到含有本发明副干酪乳杆菌CCFM1229活菌的果蔬饮料。
利用本发明能够使用副干酪乳杆菌CCFM1229发酵生产制备其他发酵食品，所述发酵食品包括固态食品、液态食品、半固态食品。所述发酵食品包括乳制品、豆制品、果蔬制品，所述乳制品包括牛奶、酸奶油、干酪；所述果蔬制品包括黄瓜、胡萝卜、甜菜、芹菜、圆白菜制品。
所述发酵食品能够减轻应激造成的小鼠的抑郁样行为、提高抑郁小鼠脑组织神经递质(5-HT)含量，提高抑郁小鼠海马中BDNF水平，抑制下丘脑Crh mRNA的表达，降低血清中的皮质酮水平；所述发酵食品能够降低大脑皮层黄嘌呤氧化酶的活性、提高肝脏腺苷脱氨酶的活性、降低血清尿酸含量；提高前额叶Mbp mRNA水平，维持CNS髓鞘结构和功能的稳定；能够提高前额叶Grin1、Grin2a、Grin2b的mRNA水平，对突触可塑性具有非常重要的意义；所述发酵食品能够改善肠道菌群多样性，恢复应激造成的肠道菌群紊乱。
实施例12：副干酪乳杆菌CCFM1229的应用
具体步骤如下：
副干酪乳杆菌CCFM1229可用于制备片剂，片剂的具体制备过程如下：
挑取实施例1获得的副干酪乳杆菌CCFM1229的单菌落接入MRS液体培养基中，于37℃培养24h，得到活化液；将活化液按照1％(v/v)的接种量接入MRS液体培养基中，于37℃培养24h，得到一级种子液；将一级种子液按照1％(v/v)的接种量接入MRS液体培养基中，于37℃培养24h，得到二级种子液；将二级种子液按照1％(v/v)的接种量接入MRS液体培养基中，于37℃培养24h，得到菌液；将菌液6000g离心15min，收集沉淀；将沉淀用pH为7.4的PBS缓冲液洗涤两次后，6000g再次离心10min，得到菌体；用含有130g/L脱脂乳、20g/L海藻糖和20g/L蔗糖的保护剂溶液将副干酪乳杆菌CCFM1229菌体重悬至细胞浓度为1×1010CFU/mL，得到副干酪乳杆菌CCFM1229菌液；将副干酪乳杆菌CCFM1229菌液冷冻干燥，得到副干酪乳杆菌CCFM1229菌粉；冻干菌粉占总份额的10％，其次依次加入总重计2％硬脂酸作润滑剂，3％CMC-Na，15.5％低聚半乳糖，7.8％低聚木糖，7.8％菊粉、乳糖醇、赤藓糖醇、木糖醇，并加入淀粉等其它辅料进行压片，得到片剂。
取1g上述片剂每天灌胃抑郁模型小鼠，连续七周，可有效缓解小鼠抑郁和焦虑症状，提高抑郁小鼠脑组织神经递质(5-HT)含量，提高抑郁小鼠海马中BDNF水平，抑制下丘脑Crh mRNA的表达，降低血清中的皮质酮水平；所述发酵食品能够降低大脑皮层黄嘌呤氧化酶的活性、提高肝脏腺苷脱氨酶的活性、降低血清尿酸含量；提高前额叶Mbp mRNA水平，维持CNS髓鞘结构和功能的稳定；能够提高前额叶Grin1、Grin2a、Grin2b的mRNA水平，对突触可塑性具有非常重要的意义；所述发酵食品能够改善肠道菌群多样性，恢复应激造成的肠道菌群紊乱。
实施例13：副干酪乳杆菌CCFM1229的应用
具体步骤如下：
副干酪乳杆菌CCFM1229可用于制备菌粉，菌粉的具体制备过程如下：
挑取实施例1获得的副干酪乳杆菌CCFM1229的单菌落接入MRS液体培养基中，于37℃培养24h，得到活化液；将活化液按照1％(v/v)的接种量接入MRS液体培养基中，于37℃培养24h，得到一级种子液；将一级种子液按照1％(v/v)的接种量接入MRS液体培养基中，于37℃培养24h，得到二级种子液；将二级种子液按照1％(v/v)的接种量接入MRS液体培养基中，于37℃培养24h，得到菌液；将菌液6000g离心15min，收集沉淀；将沉淀用pH为7.4的PBS缓冲液洗涤两次后，6000g再次离心10min，得到菌体；用含有130g/L脱脂乳、20g/L海藻糖和20g/L蔗糖的保护剂溶液将副干酪乳杆菌CCFM1229菌体重悬至细胞浓度为1×1010CFU/mL，得到副干酪乳杆菌CCFM1229菌液；将副干酪乳杆菌CCFM1229菌液冷冻干燥，得到菌粉。
取含活菌总数1×109CFU的上述菌粉每天灌胃抑郁模型小鼠，连续七周，可有效缓解小鼠抑郁和焦虑症状，提高抑郁小鼠脑组织神经递质(5-HT)含量，提高抑郁小鼠海马中BDNF水平，抑制下丘脑Crh mRNA的表达，降低血清中的皮质酮水平；所述发酵食品能够降低大脑皮层黄嘌呤氧化酶的活性、提高肝脏腺苷脱氨酶的活性、降低血清尿酸含量；提高前额叶Mbp mRNA水平，维持CNS髓鞘结构和功能的稳定；能够提高前额叶Grin1、Grin2a、Grin2b的mRNA水平，对突触可塑性具有非常重要的意义；所述发酵食品能够改善肠道菌群多样性，恢复应激造成的肠道菌群紊乱。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 缓解抑郁情绪的副干酪乳杆菌CCFM1229及其应用
<130> BAA220003A
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 887
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gccttcgggc ggcgtgctat aatgcaagtc gaacgagttc tcgttgatga tcggtgcttg 60
caccgagatt caacatggaa cgagtggcgg acgggtgagt aacacgtggg taacctgccc 120
ttaagtgggg gataacattt ggaaacagat gctaataccg catagatcca agaaccgcat 180
ggttcttggc tgaaagatgg cgtaagctat cgcttttgga tggacccgcg gcgtattagc 240
tagttggtga ggtaacggct caccaaggcg atgatacgta gccgaactga gaggttgatc 300
ggccacattg ggactgagac acggcccaaa ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt 360
ccacaatgga cgcaagtctg atggagcaac gccgcgtgag tgaagaaggc tttcgggtcg 420
taaaactctg ttgttggaga agaatggtcg gcagagtaac tgttgtcggc gtgacggtat 480
ccaaccagaa agccacggct aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag 540
cgttatccgg atttattggg cgtaaagcga gcgcaggcgg ttttttaagt ctgatgtgaa 600
agccctcggc ttaaccgagg aagcgcatcg gaaactggga aacttgagtg cagaagagga 660
cagtggaact ccatgtgtag cggtgaaatg cgtagatata tggaagaaca ccagtggcga 720
aggcggctgt ctggtctgta actgacgctg aggctcgaaa gcatgggtag cgaacaggat 780
tagataccct ggtagtccat gcccgtaaac gatgaatgct aggtgttgga gggcttccgc 840
ccctttcagt gccgcagcta acgcattaag cattcccgcc ctgaagg 887
<210> 2
<211> 889
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cacccttttg tcaccttaga cggctcgctc cctaaaaggg ttacgccacc ggcttcgggt 60
gttacaaact ctcatggtgt gacgggcggt gtgtacaagg cccgggaacg tattcaccgc 120
ggcgtgctga tccgcgatta ctagcgattc cgacttcgtg taggcgagtt gcagcctaca 180
gtccgaactg agaatggctt taagagatta gcttgacctc gcggtctcgc aactcgttgt 240
accatccatt gtagcacgtg tgtagcccag gtcataaggg gcatgatgat ttgacgtcat 300
ccccaccttc ctccggtttg tcaccggcag tcttactaga gtgcccaact aaatgctggc 360
aactagtcat aagggttgcg ctcgttgcgg gacttaaccc aacatctcac gacacgagct 420
gacgacaacc atgcaccacc tgtcattttg cccccgaagg ggaaacctga tctctcaggt 480
gatcaaaaga tgtcaagacc tggtaaggtt cttcgcgttg cttcgaatta aaccacatgc 540
tccaccgctt gtgcgggccc ccgtcaattc ctttgagttt caaccttgcg gtcgtactcc 600
ccaggcggaa tgcttaatgc gttagctgcg gcactgaagg gcggaaaccc tccaacacct 660
agcattcatc gtttacggca tggactacca gggtatctaa tcctgttcgc tacccatgct 720
ttcgagcctc agcgtcagtt acagaccaga cagccgcctt cgccactggt gttcttccat 780
atatctacgc atttcaccgc tacacatgag ttccactgtc ctcttctgca ctcaagtttc 840
ccagttcccg atgcgcttcc ctcggattaa gccgaggggc ttttccaca 889

Claims (10)

1.一种副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）CCFM1229，已于2022年1月27日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62244。
2.权利要求1所述的副干酪乳杆菌CCFM1229在制备抗抑郁或降解有机磷农药的产品中的应用，其特征在于，所述有机磷农药为氧化乐果。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，用于制备具有（a）~（h）至少一种功能的产品：
（a）减轻抑郁样行为和焦虑样行为；
（b）提高脑中神经递质5-羟色胺含量和BDNF的水平；
（c）降低血清中皮质酮的水平和下丘脑Crh mRNA的表达，从而缓解“下丘脑-垂体-肾上腺轴”功能亢进；
（d）降低大脑皮层黄嘌呤氧化酶的活性、提高肝脏腺苷脱氨酶的活性、降低血清尿酸含量；
（e）提高大脑前额叶Mbp mRNA水平，维持中枢神经系统髓鞘结构和功能的稳定；
（f）提高大脑前额叶Grin1、Grin2a、Grin2b的 mRNA水平，对突触可塑性具有非常重要的意义；
（g）改善肠道菌群多样性，恢复应激造成的肠道菌群紊乱；
（h）降解有机磷农药氧化乐果。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抗抑郁的产品为药品或保健品；所述降解有机磷农药的产品为化学品。
5.含有权利要求1所述的副干酪乳杆菌CCFM1229的组合物。
6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述组合物中含有所述副干酪乳杆菌CCFM1229活菌株、副干酪乳杆菌CCFM1229干菌株中的一种或多种。
7.一种产品，其特征在于，所述产品中含有权利要求1所述的副干酪乳杆菌CCFM1229，或权利要求5或6所述的组合物。
8.根据权利要求7所述的产品，其特征在于，所述产品为食品、药品或保健品。
9.根据权利要求7或8所述的产品，其特征在于，所述食品为：固态食品、液态食品或半固态食品；所述药品含有药学上可接受的载体或辅料。
10.权利要求1所述的副干酪乳杆菌CCFM1229在制备发酵食品中的应用。
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