KR20130002545A - 신규한 유산균 및 이를 포함하는 당뇨병 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 스트렙토코쿠스 서모필루스 ST3(Streptococcus thermophilus ST3)(KCTC 11870BP), 락토바실루스 람노수스 LR3 (Lactobacillus rhamnosus LR3)(KCTC 11868BP) 및 락토바실루스 파라카제이 LPC4(Lactobacillus paracasei LPC4) (KCTC 11866BP) 유산균 균주들 및 이들을 포함하는 당뇨병 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 신규한 유산균 균주들 및 조성물은 뛰어난 혈당강하 효과 뿐만 아니라 랑게스한스섬의 크기 및 신장의 조직병리학적 치료 효과를 제공하므로 당뇨병을 예방하거나 치료하기 위한 용도로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

신규한 유산균 및 이를 포함하는 당뇨병 예방 및 치료용 조성물{NEW LACTOBACILLUS STRAINS AND COMPOSITIONS FOR PREVENTING OR TREATING DIABETES COMPRISING THE SAME}

본 발명은 신규한 유산균 균주들 및 이들을 포함하는 당뇨병 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 특유의 유산균 균주들 및 이를 포함하여 당뇨병의 예방 및 치료에 유용한 혼합 유산균 함유 조성물에 관한 것이다.

당뇨병은 높은 혈당농도 및 대사성 장애(metabolic dysfunction)를 수반하는 특징이 있는 다양한 인자를 포함하는 질병으로, 보건 의료 체계뿐만 아니라 환자의 삶의 질 및 건강에 있어서 중대한 영향을 미치는 심각한 만성 대사장애이다. 당뇨병은 절대적 또는 상대적인 인슐린의 결핍 또는 인슐린 내성(insulin tolerance)의 증가로 인하여 표적세포에 대한 인슐린의 효과 저하에 의하여 발병한다. 당뇨병은 제 1형 및 제 2형으로 분류되는데, 전체적인 당뇨병의 유병률은 대략 인구의 6%이며, 그 중의 90%는 제2형 당뇨병이다.

만성적이고 중증의 당뇨병은 환자의 삶의 질에 중대한 영향을 미치는 심각한 부작용들을 수반한다. 심각한 합병증으로는 대사이상과 감염이 포함되고, 장기적인 합병증으로는 대혈관 합병증(macrovascular complication)(예, 고혈압, 이상지혈증, 심근경색증, 뇌졸증), 미소혈관 합병증(microvascular complication)(예, 망막병증, 신장병증, 당뇨병 신경병증, 설사, 신경원성 방광), 심혈관계 반사 부전(impaired cardiovascular reflexes), 성기능장애 및 발 장애(foot disorder)가 포함된다.

당뇨병의 통상적인 치료법은 생활양식의 관리에 집중된다. 통상의 치료법으로는 운동, 체중조절 및 의약적 영양요법 이외에, 경구용 혈당강하제(oral glucose lowering drugs) 및 인슐린 주사가 있다. 현재 사용되고 있는 경구용 혈당강하제들에 의한 치료법은 통상 체중증가, 저혈당증, 위장장애, 간장 독성 및 고 LDL 콜레스테롤과 같은 부작용을 수반한다. 한편, 인슐린 요법은 체중증가와 저혈당증과 같은 부작용을 초래한다.

일례로 당뇨병 치료에 사용되고 있는 많은 약물 가운데 하나인 아카보스는 탄수화물 소화효소를 억제하는데, 유해한 장내세균이 소화되지 않은 탄수화물을 이산화탄소와 수소로 분해하여, 위장에 가스가 차는 고창(flatulence)을 유발할 수 있다.

종래의 치료법이 수반하는 중대한 부작용을 고려하여, 환자 및 의료 전문가들에 의해 항고혈당 활성을 가진 당뇨병을 치료하기 위한 다른 접근법이 연구되고 있으나, 아직까지 유산균 또는 혼합 유산균 투여에 의한 당뇨병의 치료방법을 찾기 위한 과학적 및 의학적 연구가 이루어지지 않았다.

본 발명은 상술한 본 발명이 속하는 기술 분야의 기술적 요구에 부응하기 위한 것으로, 본 발명의 하나의 목적은 경구용 혈당강하제의 부작용을 최소화하고 혈당 강하 효과를 강화시킬 수 있어 당뇨병의 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있는 신규한 유산균 균주들 및 이들을 포함하는 당뇨병 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양상은 한국생명공학연구원 미생물자원센터(Korean Collection for Type Culture; KCTC)에 수탁 번호 KCTC 11870BP로서 국제기탁된 스트렙토코쿠스 서모필루스 ST3(Streptococcus thermophilus ST3) 유산균에 관한 것이다.

본 발명의 다른 양상은 한국생명공학연구원 미생물자원센터에 수탁 번호 KCTC 11868BP로서 국제기탁된 락토바실루스 람노수스 LR3 (Lactobacillus rhamnosus LR3) 유산균에 관한 것이다.

상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 양상은 한국생명공학연구원 미생물자원센터에 수탁 번호 KCTC 11866BP로서 국제기탁된 락토바실루스 파라카제이 LPC4(Lactobacillus paracasei LPC4) 유산균에 관계한다.

상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 양상은

스트렙토코쿠스 서모필루스 ST3(Streptococcus thermophilus ST3)(KCTC 11870BP);

락토바실루스 람노수스 LR3 (Lactobacillus rhamnosus LR3)(KCTC 11868BP); 및

락토바실루스 파라카제이 LPC4(Lactobacillus paracasei LPC4) (KCTC 11866BP)를 포함하는 당뇨병 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 혼합 유산균을 포함하는 당뇨병 예방 및 치료용 조성물은 기타 유산균 및/또는 제약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형체를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 신규한 유산균 균주들 및 이들을 포함하는 당뇨병 예방 및 치료용 조성물은 뛰어난 혈당강하 효과 뿐만 아니라 혈액내 지질 수치와 혈압의 정상화, 적절한 체중유지, 합병증의 지연 및 예방을 도모할 수 있는 탁월한 효과를 제공하므로, 당뇨병을 예방하거나 치료하기 위한 용도로 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물은 혈당조절을 통한 비만의 개선 및 치료용 조성물로도 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 스트렙토코쿠스 서모필루스 ST3 균주(KCTC 11870BP)와 스트렙토코쿠스 서모필루스^T(ATCC19258) 균주의 16S rRNA 서열을 비교한 것이다.
도 2는 스트렙토코쿠스 서모필루스 ST3 균주의 지놈 DNA의 RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA) 분석 결과이다.
도 3은 스트렙토코쿠스 서모필루스 ST3 균주의 내산성 평가 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 락토바실루스 람노수스 LR3 균주(KCTC 11868BP)와 락토바실루스 람노수스^T(ATCC7469) 균주의 16S rRNA 서열을 비교한 것이다.
도 5는 락토바실루스 람노수스 LR3 균주의 지놈 DNA의 RAPD 분석 결과이다.
도 6은 락토바실루스 람노수스 LR3 균주의 내산성 및 내담즙성 평가 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 락토바실루스 람노수스 LR3 균주의 장 정착성 평가 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 락토바실루스 파라카제이 LPC4 균주(KCTC 11866BP)와 락토바실루스 파라카제이 분리주 아키랄의 16S rRNA 서열을 비교한 것이다.
도 9는 락토바실루스 파라카제이 LPC4 균주의 지놈 DNA의 RAPD 분석 결과이다.
도 10은 락토바실루스 파라카제이 LPC4 균주의 내담즙성 평가 결과를 나타낸 그래프이다.
도 11은 실시예 및 비교예의 시료 투여 후의 공복시 혈당 변화를 나타낸 그래프이다.
도 12는 실시예 및 비교예의 시료 투여 후 식후의 혈당 변화를 나타낸 그래프이다.
도 13은 실시예 및 비교예의 시료 투여 후의 췌장의 랑게르한스 섬의 조직 분석 결과이다.
도 14는 실시예 및 비교예의 시료 투여 후의 신장의 조직 분석 결과이다.
도 15는 실시예 및 비교예의 시료 투여 후의 혈중 콜레스테롤 농도의 변화를 나타낸 막대그래프이다.

본 발명의 하나의 양상은 혈당 조절 및/또는 당뇨병 예방 및 치료에 유용한 신규한 유산균 균주들에 관계하는데, 이러한 유산균 균주들은 한국생명공학연구원 미생물자원센터(Korean Collection for Type Culture; KCTC)에 아래와 같이 기탁되었다.

스트렙토코쿠스 서모필루스 ST3(Streptococcus thermophilus ST3)(KCTC 11870BP);

락토바실루스 람노수스 LR3 (Lactobacillus rhamnosus LR3)(KCTC 11868BP); 및

락토바실루스 파라카제이 LPC4(Lactobacillus paracasei LPC4) (KCTC 11866BP).

본 발명의 다른 양상은 상술한 신규한 유산균 균주들을 포함하는 조성물에 관한 것으로, 상기 조성물은 스트렙토코쿠스 서모필루스 ST3(Streptococcus thermophilus ST3)(KCTC 11870BP); 락토바실루스 람노수스 LR3 (Lactobacillus rhamnosus LR3)(KCTC 11868BP); 및 락토바실루스 파라카제이 LPC4(Lactobacillus paracasei LPC4) (KCTC 11866BP)를 포함한다.

본 발명의 신규한 유산균 균주들은 단독으로 투여되거나 시판되는 당뇨병 치료제와 함께 투여되는 경우에 혈당 농도를 빠르게 감소시키고, 또한 혈청 콜레스트롤 농도를 크게 감소시킨다. 또한 조직학적 분석 결과에 의하면, 본 발명의 신규한 유산균 균주들은 단독으로 투여되거나 당뇨병 치료제와 함께 투여되는 경우에 랑게르한스섬의 크기를 감소시키고, 당뇨병성 신장증(diabetic nephropathy)의 증상을 완화시키는 신장의 조직병리학적 치료효과를 제공한다. 더욱이, 본 발명에서 사용되는 상기 세 종류의 유산균 균주들은 장내 유해 미생물의 증식을 억제하여 고창과 같은 경구용 혈당강하제(예컨대, 아카보스)로 인한 위장장애 등의 부작용을 감소시킬 수 있다.

본 발명의 스트렙토코쿠스 서모필루스 ST3((KCTC 11870BP), 락토바실루스 람노수스 LR3(KCTC 11868BP), 및 락토바실루스 파라카제이 LPC4(KCTC 11866BP) 균주는 내산성, 내담즙성 및 장 정착성이 우수하므로 장내 병원성 세균을 억제하고, 정장 및 지사 작용 등의 유리한 효능을 제공할 수 있다.

본 발명의 조성물은 조성물 총 중량에 대해, 유효성분으로서 상기 세 종류의 유산균 균주들의 혼합물을 10⁸ 내지 10¹² cfu/g의 함량으로 포함하거나, 동등한 수의 생균을 가진 배양물을 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 상술한 유산균 이외에 락토바실루스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실루스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 비피도박테리움 브레브(Bifidobacterium breve), 비피토박테리움 락티스 (Bifidobacterium lactis), 비피도박테리움 롱굼(Bifidobacterium longum),

락토바실루스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 락토바실루스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실루스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실루스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum), 락토바실루스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실루스 델브루에키(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실루스 레우테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실루스 부츠네리(Lactobacillus buchneri), 락토바실루스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실루스 존스니(Lactobacillus johonsonii), 락토바실루스 케피르(Lactobacillus kefir), 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis), 비피도박테리움 비피듐(Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis), 비피도박테리움 수도롱굼(Bifidobacterium pseudolongum), 비피도박테리움 서모필룸 (Bifidobacterium themophilum), 비피도박테리움 아돌센티스 (Bifidobacterium adolescentis)로 구성되는 군에서 선택되는 1종 이상의 프로바이오틱 유산균을 추가로 포함할 수 있다.

상기 유산균 균주들은 유산균을 위한 일반적인 배양 방법으로 성장되고, 원심분리와 같은 분리 과정으로 회수되며, 건조, 예컨대, 동결건조에 의해 생균제 형태로 제조하여 이용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 상술한 필수 유효 성분 뿐만 아니라 본 명세서에 기술되거나 기재되지 않은 영양 또는 약제학적 용도에 유용한 임의의 추가 또는 선택 성분을 포함할 수 있다. 이러한 다수의 선택 성분은 경구 투여에 안전하고 효과적이며 본 발명의 조성물의 필수 및 다른 선택 성분과 상용성이 있다면, 본 발명의 조성물에도 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 상기 유효 성분 이외에 통상적인 제약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제를 추가로 포함할 수 있으며, 이 외에도 바인더, 분해제, 코팅제, 윤활제, 방부제, 산화방지제, 완충제, 다른 약제학적 활성제, 감미료, 착색제, 향미료, 향미료 증강제, 증점제 및 안정화제, 유화제 등과 같은 제약학적으로 통상적으로 사용되는 다양한 선택 성분들과 함께 제형화되어 조제될 수 있다.

본 발명의 조성물은 상기 세 종류의 유산균 균주들과 적절한 담체, 부형제, 보조 유효 성분, 다른 선택 성분 등과의 혼합에 의하여 당업계에 공지된 방법을 이용하여 분말제, 과립제, 정제, 테블릿, 캡슐, 환약 또는 액상의 형태로 제형화될 수 있다.

본 발명에서 사용가능한 부형제는 수크로오스, 락토오스, 만니톨, 글루코오스 등과 같은 설탕 및 옥수수 전분, 감자 전분, 쌀 전분, 부분적으로 전젤란틴화된 전분 등의 전분을 포함한다. 바인더는 덱스트린, 소듐알지네이트, 카라지난, 구아검, 아카시아, 아가 등의 폴라사카라이드, 트라가칸트, 젤라틴, 글루텐 등의 천연-발생 거대분자 물질, 히드록시프로필셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 히드록시프로필에틸셀룰로오스, 카복시메틸셀룰로오스소듐 등의 셀룰로오스 유도체 및 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐알코올, 폴리비닐아세테이트, 폴리에틸렌글리콜, 폴리아크릴산, 폴리메타크릴산 및 비닐아세테이트 수지 등의 고분자를 포함한다.

분해제로는 카복시메틸셀룰로오스, 카복시메틸셀룰로오스칼슘, 저치환 히드록시프로필셀룰로오스 등의 셀룰로오스 유도체 및 소듐카복시메틸 전분, 히드록시프로필 전분, 옥수수 전분, 감자 전분, 쌀 전분 및 부분적으로 전젤라틴화된 전분 등의 전분을 사용할 수 있다.

본 발명에서 사용가능한 윤활제의 예들은 활석, 스테아르산, 칼슘스테아레이트, 마그네슘스테아레이트, 콜로이드성 실리카, 히드로스실리콘다이옥사이드, 다양한 종류의 왁스 및 히드로게네이티드 오일 등을 포함한다.

코팅제로는 디메틸아미노에틸메타크릴레이트-메타크릴산 공중합체, 폴리비닐아세탈디에틸아미노아세테이트, 에틸아크릴레이트-메타크릴산 공중합체, 에틸아크릴레이트-메틸메타크릴레이트-클로로트리메틸암모늄에틸메타크릴레이트 공중합체, 에틸셀룰로오스 등의 수불용성 중합체, 메타크릴산-에틸아크릴레이트 공중합체, 히드록시프로필메틸셀룰로오스프탈레이트, 히드록시프로필메틸셀룰로오스아세테이트석시네이트 등의 장성 중합체 및 메틸셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌글리콜 등의 수용성 중합체를 포함하나, 반드시 이들로 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 경구용으로 제형화되는 경우에 유산균들이 위산 또는 담즙 산에 의해 사멸되어 본래의 생리활성 기능을 소실하지 않고, 소장에서 충분히 분해되어 활성성분이 소장 내에 방출될 수 있도록 장용 코팅될 수 있다. 일례로 본 발명의 조성물에는 단백질 및 다당류로 2중 코팅된 유산균이 이용될 수 있고, 필요에 따라서 2중 코팅된 유산균 위에 나노입자 코팅층이 형성된 3중 코팅된 유산균이 이용될 수 있다. 2중 코팅된 유산균은 단백질 수용액에 단백질 분해효소제를 가하여 효소 처리한 후, 효소 처리된 단백질 수용액에 포도당, 효모추출물, 육엑기스, 이온성분 및 유산균을 첨가한 후 발효시켜 단일 코팅된 유산균을 제조하고나서, 단일 코팅된 유산균에 다당류 수용액을 코팅하여 제조할 수 있다. 3중 코팅된 유산균은 2중 코팅된 유산균에 나노입자를 코팅하여 제조할 수 있다.

본 발명의 당뇨병 예방 및 치료용 조성물에서 유효성분인 상기 유산균 균주들의 투여량은 치료나 예방의 목적, 치료 또는 예방하려는 환자의 종류, 환자의 증상, 체중, 연령이나 성별 등을 고려하여 적절하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 성인 환자의 경우, 1× 10⁶ 살아있는 세포 이상, 바람직하게는 1× 10⁸ 내지 1 × 10¹² 살아있는 세포가 필요에 따라 한번 또는 나눠서 투여될 수 있다.

각각의 환자의 특정한 복용량은 다양한 요인, 예를 들면, 나이, 체중, 일반적인 건강 상태, 성, 식이, 투여시간 및 경로, 배설율, 의약 물질의 조합 및 치료되는 특정 질환의 심각성에 의존한다.

본 발명의 유산균 함유 당뇨병 예방 및 치료용 조성물은 사람 또는 동물에 약품 또는 식품으로 투여 또는 섭취될 수 있다. 본 발명의 유산균 함유 당뇨병 예방 및 치료용 조성물을 함유하는 약품은 본 발명의 하나의 실시형태이고, 본 발명의 유산균 함유 당뇨병 예방 및 치료용 조성물을 함유하는 식품 또한 본 발명의 다른 실시형태이다. 이러한 식품의 예로는 요구르트 및 유제품을 들 수 있지만, 반드시 이들로 제한되는 것은 아니다.

이하에서 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해서 한정되는 것은 아니다.

실시예

1. 스트렙토코쿠스 서모필루스 ST3 ( Streptococcus thermophilus ST3 ) ( KCTC 11870 BP )의 동정 및 특성화

1-1. 신규 미생물 분리

목장에서 채취한 산양유를 멸균 혐기수에 연속 희석법으로 희석한 후 각 희석액 1㎖을 ManRogosaSharpe(MRS. BD. USA) 고체 배지에 부어 혐기 조건에서 37℃에서 3일간 배양하였다. 생성된 콜로니를 다시 MRS에 BCP (Bromocresol purple, 0.17g/L)를 첨가한 락토바실루스 선택배지에 골라낸 후 같은 조건에서 다시 3일간 배양하였다. 상기 배지에서 유산균을 선별하여 생화학적, 분자생물학적 동정을 진행하였고, 이후 균주의 물리적 특성이 가장 우수한 균주 1종을 최종 선발하였다.

1-2. 미생물의 동정

1) 당 이용성 분석

분리한 균주에 대해 API CHL50 키트를 이용하여 당 이용성을 확인하였다. 분리된 균주의 당 이용성은 하기 표 1에 나타내었다. 당 이용도를 바탕으로 한 생화학적 특성은 락토바실루스 델브루에키 락티스(Lactobacillus delburueckii spp lactis) 및 스트렙토코쿠스 서모필루스(Streptococcus thermophilus)와 유사한 것으로 나타났으나, 분리된 균주가 형태상으로 구균 형태이기 때문에 스트렙토코쿠스 서모필루스(S. thermophilus)로 동정하였다.

기질	반응	기질	반응
		에스쿨린	-
글리세롤	-	살리신	-
에리트리톨	-	셀로비오스	-
D-아라비노오스	-	말토오스	-
L-아라비노오스	-	락토오스	+
리보오스	-	멜리비오스	-
D-자일로스	-	사카로오스	+
L-자일로스	-	트레할로오스	-
안도니톨	-	이눌린	-
β-메틸-자일로사이드	-	멜레지토오스	-
갈락토오스	+	D-라피노오스	-
D-글루코오스	+	아미돈	-
D-프럭토오스	+	글리코겐	-
D-만노오스	+	자일리톨	-
L-소르보오스	-	β-겐티오비오스	-
람노오스	-	D-투라노오스	-
덜시톨	-	D-릭소오스	-
이노시톨	-	D-타가토오스	-
만니톨	-	D-푸코오스	-
소르비톨	-	L-푸코오스	-
α-메틸-D-만노사이드	-	D-아라비톨	-
α-메틸-D-글루코사이드	-	L-아라비톨	-
N-아세틸 글루코사민	-	글루코네이트	-
아미그달린	-	2-케토-글루코네이트	-
알부틴	-	5-케토-글루코네이트	-

2) 16s rRNA 동정

분리된 균주로부터 지놈 DNA를 추출하여 16s rRNA 염기서열을 분석하였다. 분리한 DNA를 주형으로 16s rRNA 영역을 프라이머 F (5‘-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’)와 프라이머 R (5‘-AAGGAGGTGATCCAGCC 3’)을 이용하여 PCR (MyCycler, BIO-RAD, USA)을 수행하였다. PCR 산물은 pGEM-Teasy 벡터(Promega, USA)에 연결하여, 이. 콜라이(E. coli) 균주 DH5α에 형질전환시킨 후 LB/x-gal/amp 플레이트에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 스크리닝을 통하여 형질전환체로부터 삽입체(insert)를 포함하는 재조합 플라스미드를 분리한 후, DNA 시퀀싱을 진행하였다. DNA 염기서열 분석은 DNA star program의 Cluster V 방법을 이용하여 스트렙토코쿠스 서모필루스^T(S. thermophilus ^T)(ATCC19258) 균주와의 상동성를 확인하였다. 도 1에 본 발명의 스트렙토코쿠스 서모필루스 ST3 균주(KTCC )와 스트렙토코쿠스 서모필루스^T(ATCC19258) 유산균의 16s rRNA 서열을 비교하여 나타내었다. 분리 균주의 16s rRNA 염기서열은 스트렙토코쿠스 서모필루스^T(ATCC19258)와 99.5%의 상동성을 보여, 본 발명의 신규 미생물이 스트렙토코쿠스 서모필루스 종에 속하는 균주임을 확인하였다.

3) RAPD ( Random Amplified Polymorphic DNA ) 분석

분리된 균주로부터 지놈 DNA를 추출하여, 분리한 DNA를 주형으로 (GTG)₅ (5’- GTGGTGGTGGTGGTG 3’) 프라이머를 이용하여 PCR-RAPD (MyCycler, BIO-RAD, USA)를 수행하였으며, PCR 산물은 Et-Br(Ethidium bromide)로 염색 후 G:BOX (SYNGENE, UK)로 관찰하여 도 2에 나타내었다. 본 발명의 분리된 균주의 밴드 패턴은 스트렙토코쿠스 서모필루스^T(ATCC 19258)와 유사하지만, 동일한 균주가 아님을 확인하였다.

위 결과를 토대로 상기 균주를 “락토바실루스 서모필루스 ST3(Streptococcus thermophilus ST3)로 명명하고, 2011년 3월 2일자로 대한민국 특허균주 기탁기관인 미생물자원센터(KCTC)에 기탁하여 수탁번호 KCTC11870BP를 부여받았다.

1-3. 내산성 평가

내산성 평가는 MRS 액체 배지에서 사전 배양된 스트렙토코쿠스 서모필루스 ST3을 인공 위액 (NaCl 2g, 펩신 3.2g, 진한 염산 5.8㎖/1L, pH=2.1) 10㎖에 1% 접종 후 30분 단위로 2시간 동안 MRS 고체배지에서 생균수를 측정하였다. 내산성 평가 결과 본 발명의 분리 균주인 스트렙토코쿠스 서모필루스 ST3은 산성 조건에서도 안정하게 생균수가 유지되고 있어, 균주의 내산성을 확인할 수 있었다.

1-4. 항생제 내성

항생제 내성 평가는 European Food Safety Authority (EFSA) 에서 추천하는 micro-dilution 방법을 이용하여 수행하였으며, 각 항생제는 Sigma 및 Fluka사로부터 구입하여 사용하였다.

항생제의 농축액은 MRS 배지를 이용하여 256, 128, 64, 32, 16, 8, 4, 2, 1, 0.5 μg/㎖의 농도로 희석하였으며, 항생제가 포함된 희석액을 96 웰 플레이트에 100 ㎕씩 분주하고 MRS 액체 배지에서 사전 배양된 스트렙토코쿠스 서모필루스 ST3을 1% 접종 후 37℃ 에서 16시간 배양 후 성장도를 측정함으로써 각 항생제 별 최소성장저해농도 (Minimal Inhibition Concentration, MIC)를 측정하였다. 실험의 오차를 줄이기 위하여 모든 실험은 3 세트로 구성하였고, 이들의 평균값을 취한 후 최소성장저해농도(MIC)값을 최종 측정하였다. 각 균주에 대한 MIC는 다음의 방법으로 결정하였다. 실험군과 동일한 실험시간에 항생제가 포함되지 않은 MRS 배양액 100㎕에 균주를 1% 접종한 후 곧바로 -4℃에 보관하였다. 16시간 후 -4℃에서 균주의 성장을 억제시킨 군의 OD값을 기준으로 하여 실험군에서 그 이하의 OD값을 보이는 항생제의 농도를 MIC로 정의하였다. 본 발명의 스트렙토코쿠스 서모필루스 ST3 균주의 각 항생제에 대한 MIC 값을 하기 표 2에 나타내었다. 스트렙토코쿠스 서모필루스 ST3는 세포벽 합성 및 단백질 합성을 저해하는 항생제에 대해서 대분분 낮은 농도에서 생육이 억제되었다.

항생제	최소 성장 저해 농도(MIC)
암피실린(AMP)	<0.5
카나마이신(KAN)	<32
클로람페니콜(CP)	<0.5
반코마이신(VAN)	<0.5
젠타마이신(GEN)	<8
테트라사이클린(TET)	<0.5
네오마이신(NM)	<64
스트렙토마이신(ST)	<16

2. 락토바실루스 람노수스 LR3 ( Lactobacillus rhamnosus LR3 ( KCTC 11868 BP ))의 동정 및 특성화

2-1.미생물의 분리

목장에서 채취한 산양유를 멸균 혐기수에 연속 희석법으로 희석한 후 각 희석액 1㎖을 ManRogosaSharpe(MRS. BD. USA) 고체 배지에 부어 혐기 조건에서 37℃에서 3일간 배양하였다. 생성된 콜로니는 다시 유산균 선택 배지인 MRS에 BCP (bromocresol purple, 0.17g/L)를 첨가한 고체배지에 집어낸 후 같은 조건에서 다시 3일간 배양하였다. 상기 배지에서 유산균을 선별하여 생화학적, 분자생물학적 동정을 진행하였고, 이후 균주의 물리적 특성이 가장 우수한 균주 1종을 최종 선발하였다.

2-2. 미생물의 동정

1) 당 이용성 분석

상기와 같이 선별 분리된 유산균 균주는 API CHL50 키트로 분석한 결과, 하기 표 3에서와 같이, 락토바실루스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus)와 99.6% 유사한 생화학적 특성을 가지는 것으로 동정되었다.

기질	반응	기질	반응
		에스쿨린	+
글리세롤	-	살리신	+
에리트리톨	-	셀로비오스	+
D-아라비노오스	-	말토오스	+
L-아라비노오스	-	락토오스	+
리보오스	+	멜리비오스	-
D-자일로스	-	사카로오스	-
L-자일로스	-	트레할로오스	+
안도니톨	-	이눌린	-
β-메틸-자일로사이드	-	멜레지토오스	+
갈락토오스	+	D-라피노오스	-
D-글루코오스	+	아미돈	-
D-프럭토오스	+	글리코겐	-
D-만노오스	+	자일리톨	-
L-소르보오스	-	β-겐티오비오스	+
람노오스	+	D-투라노오스	-
덜시톨	-	D-릭소오스	-
이노시톨	+	D-타가토오스	+
만니톨	+	D-푸코오스	-
소르비톨	+	L-푸코오스	-
α-메틸-D-만노사이드	-	D-아라비톨	-
α-메틸-D-글루코사이드	+	L-아라비톨	-
N-아세틸 글루코사민	+	글루코네이트	+
아미그달린	+	2-케토-글루코네이트	-
알부틴	+	5-케토-글루코네이트	-

2) 16s rRNA 동정

분리된 균주의 순수 배양액 1㎖에서 Accuprep 지놈 추출 키트 (Bioneer, Korea)를 이용하여 지놈 DNA를 추출하였다. 추출한 DNA를 주형으로 16s rRNA 영역을 프라이머 F (5‘-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’)와 프라이머 R (5‘-AAGGAGGTGATCCAGCC 3’)을 이용하여 PCR (MyCycler, BIO-RAD, USA)을 수행하였다.

PCR 산물은 pGEM-Teasy 벡터 (Promega, USA)에 연결한 후 E. coli DH5α에 형질전환시킨 후 X-gal 및 암피실린을 포함하는 LB 평판에 도말하여 37℃에서 약 16시간 배양하였다. LB 평판 상에 자라난 콜로니로부터 PCR 산물을 포함하는 재조합 플라스미드를 분리한 후, DNA 시퀀싱을 진행하였다. DNA 염기서열 분석은 DNA star program의 Cluster V 프로그램을 이용하여 엘. 람노수스^T(L. rhamnosus ^T )(ATCC 7469)와 상동성을 확인하였다. 도 4는 락토바실루스 람노수스 LR3 (Lactobacillus rhamnosus LR3)(KCTC 11868BP)와 락토바실루스 람노수스^T (ATCC7469) 균주의 16S rRNA 서열을 비교한 것이다. 분리 균주의 16s rRNA 염기서열은 엘. 람노수스^T(L. rhamnosus ^T ) (ATCC 7469)와 99.2%의 상동성을 보여, 본 발명의 신규 미생물이 락토바실루스 람노수스 종에 속하는 균주임을 확인하였다.

3) RAPD ( Random Amplified Polymorphic DNA ) 분석

락토바실루스 람노수스 LR3 균주로부터 지놈 DNA를 추출한 후 이를 주형으로 하고 (GTG)₅ (5’- GTGGTGGTGGTGGTG 3’)를 프라이머로 이용하여 PCR-RAPD (MyCycler, BIO-RAD, USA)를 수행하였다. PCR 산물은 0.8% 아가로스 겔 상에서 전기영동한 후 EtBr로 염색하여 G:BOX (SYNGENE, UK)로 관찰하였다. 도 5에 의하면, 본 발명의 락토바실루스 람노수스 LR3의 RAPD 밴드 패턴은 엘. 람노수스^T(L. rhamnosus ^T)(ATCC 7469)와 상이하게 나타났으며, 이러한 결과로부터 두 균주가 동일 균주가 아닌 것을 확인할 수 있었다.

위 결과를 토대로 상기 분리된 균주는 락토바실루스 람노수스 LR3(Lactobacillus rhamnosus LR3)로 명명하였으며, 2011년 3월 2일자에 대한민국 특허균주 기탁기관인 미생물자원센터(KCTC)에 기탁하여 수탁번호 KCTC11868BP를 부여받았다.

2-3. 내산성 및 내담즙성 평가

내산성 평가는 MRS 액체 배지에서 사전 배양된 락토바실루스 람노수스 LR3를 인공위액 (NaCl 2g, 펩신 3.2g, 진한 염산 5.8㎖/1L, pH=2.1) 10㎖에 1% 첨가한 후 2시간 동안 방치하였다. 이 기간 중 30분 단위로 일정량을 취하여 MRS 고체배지에서 도말하여 생균수를 측정함으로써 내산성을 측정하였다.

내담즙성 평가는 MRS 액체 배지에서 사전 배양된 락토바실루스 람노수스 LR3를 oxgall (0%, 0.25%, 0.5%, 0.75%, 1%)이 포함된 MRS에 1% (v/v) 되도록 접종한 후 2시간 방치하였다. 이 후 20분 간격으로 일정량을 취하여 MRS 평판에 도말하여 생균수를 측정하였다. 도 6을 참조하면, 내산성 및 내담즙성 평가에서 락토바실루스 람노수스 LR3는 두 조건에서 안정하게 생균수가 유지되고 있어, 상기 분리된 균주의 내산성 및 내답즙성이 우수함을 확인할 수 있었다.

2-4. 장 정착성 평가

락토바실루스 람노수스 LR3의 장 정착성에 대한 평가는 사람의 장상피 세포인 Caco2를 이용하였고, 락토바실루스 람노수스 GG를 대조군으로 사용하였다. Caco2 세포주에 락토바실루스 람노수스 LR3를 1시간 처리 후 생균수를 측정함으로써 두 균주의 장 정착능력을 비교하여 도 7에 나타내었다. 도 7을 참조하면,장 정착성이 좋은 균주로 알려진 락토바실루스 람노수스 GG는 75.2%의 정착성을 보인 반면, 본 발명의 락토바실루스 람노수스 LR3는 86.4% 보여 약 10% 정도 더 우수한 장 정착성을 나타내었다.

이상에서 확인한 바와 같이, 본 발명의 락토바실루스 람노수스 LR3 (Lactobacillus rhamnosus LR3 (KCTC 11868BP)) 균주는 엘. 람노수스^T(L. rhamnosus ^T)(ATCC 7469)와 분자생물학적으로 차이를 보이는 신규 균주이다. 본 발명의 락토바실루스 람노수스 LR3 균주는 내산성과 내담즙성이 우수하여 섭취 후 위장을 거쳐 소장 및 대장까지 도달할 가능성이 높을 것으로 판단된다. 특히 장 정착성이 좋은 균주로 알려진 락토바실루스 람노수스 GG (Lactobacillus rhamnosus GG) 보다 우수한 정착성을 나타내기 때문에 프로바이오틱스 (probiotics)로서 더 우수한 효과를 나타낼 수 있다.

3. 락토바실루스 파라카제이 LPC4 ( Lactobacillus paracasei LPC4 ) KCTC 11866 BP 의 동정 및 특성화

3-1. 신규 미생물 분리

목장에서 채취한 산양유를 멸균 혐기수에 연속 희석법으로 희석한 후 각 희석액 1㎖을 ManRogosaSharpe(MRS. BD. USA) 고체 배지에 부은 후 혐기 조건에서 3일간 배양하였다. 생성된 콜로니는 다시 유산균 선택배지인 MRS에 BCP(Bromocresol purple, 0.17g/L)를 첨가한 고체배지에 집어낸 후 같은 조건에서 다시 3일간 배양하였다. 상기 배지에서 유산균을 선별하여 생화학적, 분자생물학적 동정을 진행하였고, 이후 균주의 물리적 특성이 가장 우수한 균주 1종을 최종 선발하였다.

3-2. 신규 미생물의 동정

1) 당 이용성 분석

상기와 같이 선별 분리된 유산균 균주는 API CHL50 키트로 분석한 결과, 하기 표 4에서와 같이, 락토바실루스 파라카제이(L. paracasei spp paracasei (API50CHL)와 95.2% 유사한 생화학적 특성을 가지는 것으로 동정되었다.

기질	반응	기질	반응
	-	에스쿨린	+
글리세롤	-	살리신	+
에리트리톨	-	셀로비오스	+
D-아라비노오스	-	말토오스	+
L-아라비노오스	-	락토오스	+
리보오스	+	멜리비오스	-
D-자일로스	-	사카로오스	+
L-자일로스	-	트레할로오스	+
안도니톨	-	이눌린	+
β-메틸-자일로사이드		멜레지토오스	+
갈락토오스	+	D-라피노오스	-
D-글루코오스	+	아미돈	-
D-프럭토오스	+	글리코겐	-
D-만노오스	+	자일리톨	-
L-소르보오스	+	β-겐티오비오스	+
람노오스	-	D-투라노오스	+
덜시톨	+	D-릭소오스	+
이노시톨	+	D-타가토오스	+
만니톨	+	D-푸코오스	-
소르비톨	+	L-푸코오스	-
α-메틸-D-만노사이드	-	D-아라비톨	-
α-메틸-D-글루코사이드	+	L-아라비톨	-
N-아세틸 글루코사민	+	글루코네이트	+
아미그달린	+	2-케토-글루코네이트	-
알부틴	+	5-케토-글루코네이트	-

2) 16s rRNA 동정

분리된 균주의 순수 배양액 1㎖에서 Accuprep 지놈 추출 키트(Bioneer, Korea)를 이용하여 지놈 DNA를 추출하였다. 추출한 DNA를 주형으로 16s rRNA 영역을 프라이머 F (5‘-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’)와 프라이머 R (5‘-AAGGAGGTGATCCAGCC 3’)를 이용하여 PCR (MyCycler, BIO-RAD, USA)을 수행하였다.

PCR 산물은 pGEM-Teasy vector(Promega, USA)에 연결한 후 이. 콜라이 균주 DH5α에 형질전환시킨 후 LB/x-gal/amp 플레이트에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 스크리닝을 통하여 형질전환체로부터 삽입체를 포함하는 재조합 플라스미드를 분리한 후, DNA 시퀀싱을 진행하였다. DNA 염기서열 분석은 DNA star program의 Cluster V 방법을 이용하여 락토바실루스 파라카제이 분리주 아키랄(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei isolate Akira1)과 본 발명의 균주의 16S rRNA 서열을 비교하여 그 결과를 도 8에 나타내었다. 본 발명에서 분리된 신규한 균주의 16s rRNA 염기서열은 락토바실루스 파라카제이 분리주 아키랄(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei isolate Akira1)과 99.7%의 상동성을 보여, 본 발명의 신규 미생물이 락토바실루스 파라카제이 종에 속하는 균주임을 확인하였다.

3) RAPD ( Random Amplified Polymorphic DNA ) 분석

순수 배양된 락토바실루스 파라카제이 LPC4에서 지놈 DNA를 추출하여, 분리한 DNA를 주형으로 (GTG)₅ (5’- GTGGTGGTGGTGGTG 3’) 프라이머를 이용하여 PCR-RAPD (MyCycler, BIO-RAD, USA)를 수행하였으며, PCR 산물은 Et-Br로 염색 후 G:BOX (SYNGENE, UK)로 관찰하였다. 도 9를 참조하면, 본 발명에서 분리된 락토바실루스 파라카제이 LPC4 균주의 DNA 밴드 패턴은 락토바실루스 파라카제이^T(L. paracasei ^T (ATCC 25302)와 다르게 나타았으며, 이 결과로 두 균주가 동일 균주가 아닌 것을 확인할 수 있었다.

위 결과를 토대로 본 발명에서 분리된 균주는 락토바실루스 파라카제이 LPC4(Lactobacillus paracasei LPC4)로 명명하였으며, 2011년 3월 2일자에 대한민국 특허균주 기탁기관인 미생물자원센터(KCTC)에 기탁하여 수탁번호 KCTC11866BP를 부여받았다.

3-3. 내담즙성 평가

상기 락토바실루스 파라카제이 LPC4 균주에 대한 내담즙성 평가는 MRS 액체 배지에서 사전 배양된 락토바실루스 파라카제이 LPC4를 Oxgall 농도가 다르게 첨가된 MRS 액체 배지에 1% 접종하였고, 접종 2시간 경과 후 MRS 고체 배지를 이용하여 생균수를 측정하여, 측정 결과를 도 10에 그래프로 나타내었다. 이때 사용한 Oxgall 농도는 0%, 0.25%, 0.5%, 0.75%, 1%이다. 도 10에 도시된 바와 같이, 내담즙성 평가 결과 분리 균주인 락토바실루스 파라카제이 LPC4는 다양한 Oxgall 농도에서 안정하게 생균수가 유지되고 있음을 확인할 수 있다.

4. 제1형 당뇨 모델을 이용한 동물실험

1. 유산균 분말의 제조

본 발명의 조성물에 포함되는 유산균 균주의 배양을 위한 발효 배지는 탈지분유와 대두 분리 단백질을 각각 단독 혹은 혼합하여 1%-10% (w/v) 수용액으로 만든 후 스트렙토코쿠스 서모필루스 ST3(Streptococcus thermophilus ST3)(KCTC 11870BP) 및 락토바실루스 람노수스 LR3 (Lactobacillus rhamnosus LR3)(KCTC 11868BP)에 대해서 단백질 대비 0.01%-1% (w/w) 범위의 단백분해 효소 (Delvolase; DSM, 네덜란드) 용액을 가하여 효소처리하였다. 락토바실루스 파라카제이 LPC4(Lactobacillus paracasei LPC4) (KCTC 11866BP)의 유산균종에 대해서는 효소처리 단계를 생략하였다.

효소처리 후 상기 효소처리 반응액에 0.1%-5% (w/v) 범위의 포도당, 유당, 과당, 혹은 자당 등의 당류, 0.1%-5% (w/v) 범위의 효모추출물, 0.1%-5% (w/v) 범위의 소이펩톤, 0.01%-0.1% (w/v) 범위의 암모니움 시트레이트, 소디움 아세테이트, 디포타시움 포스테이트, 마그네슘 설페이트, 망간 설페이트, 소디움 클로라이드의 이온성분을 첨가하고 용해시켜 유산균 배양배지를 준비하였다. 준비된 유산균 배양배지는 열교환기 (Heat exchanger)를 이용하여 살균하였다.

상기 배양 배지 성분에서 전배양한 유산균 종균을 0.1%-1% (v/v) 농도로 배양 배지에 접종하고 37℃, pH 5.0-6.0 범위에서 유지되도록 하여 유산균종에 따라 8시간-18시간 동안 발효배양하였다. 유산균 배양이 종료된 후 유산균체를 연속식 원심분리기(Separator)를 이용하여 분리 및 농축하였다. 분리된 유산균체는 동결보호제 등을 첨가하여 동결건조시킨 후 분쇄기를 이용하여 유산균체를 분쇄하여 일정한 입도를 가지게 한 후 유산균 원말로 제조하였다.

전단계에서 수득된 유산균 원말은 다음과 같은 생균수를 가지는 것으로 측정되었다:

스트렙토코쿠스 서모필루스 ST3 유산균 (1X10¹¹ CFU/g 이상)

락토바실루스 람노수스 LR3 유산균 (1X10¹¹ CFU/g 이상)

락토바실루스 파라카제이 LPC4 유산균 (1X10¹¹ CFU/g 이상).

2. 동물 및 실험 디자인

본 실험예에서는 스트렙토조토신에 의해 유도된 제1형 당뇨병 생체내 실험(in vivo) 모델에 대하여 당뇨병 치료제와 본 발명의 3 종류의 유산균(락토바실루스 파라카제이 LPC4, 락토바실루스 람노누스 LR3, 스트렙토코쿠스 서모필루스 ST3)의 병용 투여 효능을 여러 가지 대조군과 비교 평가하였다.

수컷 스프래그-다우리 종(SD) 쥐(생후 6주, 개체당 200~230g)는 1주일 동안 실험환경에 적응시킨 후, 하기 표 5와 같이 무작위로 각 그룹당 8 마리씩 6개의 그룹으로 분류하였다: 실시예 1은 스트렙토조토신을 투여하여 당뇨병이 유발된 후, 본 발명의 유산균 균주들의 생세포(live cell)가 투여된 그룹이고, 실시예 2는 스트렙토조토신을 투여하여 당뇨병이 유발된 후, 본 발명의 유산균 균주들의 사멸한 세포들이 투여된 그룹이다. 실시예 1 및 실시예 2에서는 본 발명의 세 종류의 유산균 균주들이 모두 함유된 생균 혼합물 또는 사균체 혼합물을 투여하였다. 실시예 3의 그룹에는 상기에서 수득된 세 종류의 유산균을 포함하는 혼합물과 아카보스를 모두 투여하였다. 생존 또는 사멸한 락토바실루스 파라카제이 LPC4, 락토바실루스 람노수스 LR3 및 스트렙토코쿠스 서모필루스 ST3를 혼합한 후, 쥐에게 1X10⁸ cfu/head의 생균을 1일 1회 경구투여하였고, 아카보스는 50mg/kg의 복용량으로 투여하였다.

대조군인 비교예 1은 거짓 대조군(sham group)에 해당되는 정상군으로, 실험기간 동안 동일한 양과 루트의 생리식염수만이 투여되었다. 비교예 2는 스트렙토조토신을 투여하여 실험적 당뇨병이 유발된 당뇨 대조군이고, 비교예 3은 스트렙토조토신을 투여하여 당뇨병이 유발된 후, 경구용 당뇨병 치료제인 아카보스만을 각각 투여한 대조군이다.

실험 동물들을 실험실에 도착 후 1주일간 환경에 적응시켰고, 이 기간 동안 특별한 증상을 보이지 않는 동물들만 실험에 사용하였다. 적응기간 동안, 동물들은 온도는 섭씨 22± 2℃, 상대습도 55± 10%, 명/암 사이클은 12시간/12시간에서 사육하였고, 시판되는 설치류 사료 및 물은 자유롭게 섭취할 수 있게 하였다.

본 실시예에서 당뇨를 유발시키기 위하여 쥐를 16시간 동안 단식시키고, 쥐의 꼬리 정맥에 pH 7.4인 0.01M 시트르산 완충용액(citrate buffer)으로 용해된 스트렙토조토신 50mg/kg을 주사하였다. 스트렙토조토신은 췌장 내 랑게르한스섬의 베타세포를 선별적으로 공격하여 실험적 당뇨병을 유발시키는 것으로 알려져 있다. 당뇨 유도를 확인하기 위하여 쥐를 16시간 동안 단식시킨 후, 48시간이 경과하면 혈당측정기기(ACCU-CHEK Active: Roche, Germany)를 이용하여 혈당을 측정하여 300mg/dl 또는 그 이상의 혈당농도를 가지는 쥐들만 당뇨병 쥐로 간주하여 실험에 사용하였다. 스트렙토조토신을 투여하기 바로 전에 체중을 측정하고, 시료 투여 30일 후 매주 단식하기 바로 전에 체중을 측정하였다.

구분	표시	실험 시료	동물
비교예 1	Sham	-	정상군
비교예 2	Control	-	당뇨 유발(STZ)
실시예 1	Probiotic	유산균(생세포)	당뇨 유발(STZ)
실시예 2	Probiotic	유산균(사멸세포)	당뇨 유발(STZ)
비교예 3	Acarbose	아카보스	당뇨 유발(STZ)
실시예 3	Mixture	아카보스+3종 유산균	당뇨 유발(STZ)

3. 체중 및 혈당 분석

3-1. 체중 측정

제 1형 당뇨병의 특성인 체중의 감소가 있었는지 측정하기 위하여, 스트렙토조토신에 의해 당뇨-유발된 쥐들은 27일까지 매 6일마다 체중을 측정하여 하기 표 6에 나타내었다. 표 6을 통해서 확인되는 바와 같이, 체중은 제 1형 당뇨병 쥐의 특징과 일치하여, 거짓 대조군(비교예 1)에서만 증가하였고, 스트렙토조토신에 의해서 실험적 당뇨병이 유발된 그룹들에서는 증가하지 않았다. 거짓 대조군에서 개별 쥐들의 평균 체중은 당뇨가 체중감소에 영향을 미친다고 제안했던 비교예 2의 당뇨 대조군의 개별 쥐들의 평균 체중 보다 무거웠다. 또한, 측정 시점으로부터 2주일 후에는 실험 그룹들 사이의 공복 시 혈당농도는 큰 차이가 없었고, 그 다음 27일 후에는 실험 그룹들간 공복시 혈당농도가 비교예 2의 당뇨 대조군은 450mg/dl이고, 아카보스와 유산균 혼합물을 병용 투여한 실시예 3의 그룹은 350mg/dl로 그룹간 차이가 두드러지게 증가하였다(p〈0.05). 따라서, 유산균과 아카보스 혼합물은 체중감소 및 혈당농도증가에 대하여 치료효과를 가질 수 있다는 것을 입증한다. 본 발명의 세 종류의 유산균을 포함하는 조성물은 당뇨로 인한 체중감소를 개선하는데 효과적임을 확인할 수 있다.

3-2. 식전 혈당 측정

혈당은 6일에 한 번씩, 16시간 절식후 꼬리 정맥에서 채혈하여 식전 혈당으로 측정하여, 도 11에 그래프로서 도시하였다. 도 11을 참고하면, 혈당농도는 시료를 모든 치료(treatment) 그룹에 투여한지 15일 후에 비교예 2의 당뇨 대조군을 제외하고 급격하게 증가하였다. 당뇨병 쥐에게 유산균을 투여한지 15일 후부터 당뇨에 대한 유산균의 치료 효과가 나타나기 시작하였고, 21일 및 27일 후에서 비교예 3의 아카보스만 투여한 그룹 및 실시예 3의 유산균 혼합물과 아카보스를 병용 투여한 그룹의 혈당농도는 비교예 2의 당뇨 대조군과 비교하였을 때 둘 다 상당하게 감소하였다. 실시예 1의 유산균 생세포만 투여한 그룹 및 실시예 2의 유산균 사멸세포만 투여한 그룹의 혈당농도 또한 비교예 2의 당뇨 대조군에 비하여 감소하였다. 혈당농도와 관련한 유산균의 치료효과는 비교예 3의 아카보스만 투여한 그룹 및 실시예 3의 유산균 혼합물과 아카보스를 병용 투여한 그룹이 실시예 1의 유산균 생세포만 투여한 그룹보다 더 높았다. 혈청 콜레스트롤 농도는 비교예 2의 당뇨 대조군 보다 실시예 1의 유산균 생세포만 투여한 그룹이 더 낮았다. 이러한 결과를 종합해 볼 때, 본 발명의 유산균 균주들은 혈당농도 및 혈청 콜레스트롤 농도를 감소시킬 수 있음을 확인할 수 있다.

3-3. 식후 혈당 측정

식후 혈당은 당뇨병 쥐들을 12시간 동안 단식시킨 후, 시험 시료를 경구투여하고, 1시간 동안 먹이를 준 후에 측정하였다. 시험 시료의 투여에 따른 혈당농도의 변화를 검사하기 위하여 1시간 간격으로 3시간 동안 3회에 걸쳐서 혈당농도를 측정하였다. 비교예 2의 당뇨 대조군에서는 식후 혈당농도가 증가하여 식후 3시간 동안 높이 유지되었다. 실시예 1의 유산균 생세포만 투여한 그룹 및 실시예 2의 유산균 사멸세포만 투여한 그룹에서는 식후 혈당농도가 당뇨병 그룹과 유사한 농도로 증가하였으나, 식후 3시간까지 농도가 급격하게 감소하였다. 반면에, 비교예 3의 아카보스만 투여한 그룹과 실시예의 유산균 혼합물과 아카보스를 병용 투여한 그룹에서는 식후 혈당농도가 비교예 2의 당뇨 대조군 보다 두드러지게 낮았으며(p〈0.05), 식후 3시간 동안 200mg/dl의 혈당농도 변화를 유지하였다. 이러한 결과는 본 발명의 유산균 및 이를 포함하는 조성물이 식후 혈당농도를 감소시킬 수 있음을 입증한다.

4. 췌장의 조직병리학 검사

쥐를 마취하여 치사시킨 후 혈액 샘플을 채혈한다. 그리고 나서 관류고정(perfusion fixation)을 한 후, 췌장을 절제하여 10% 포르말린에 고정시킨다. 고정한 췌장을 얇게 자른 후 다시 10% 포르말린에 상온에서 24시간 동안 고정시킨 후에 1시간 동안 수돗물로 세척한다. 세척한 조직은 자동 조직 치료기(automatic tissue processor, Hypercenter XP, Shandon, London)에 로딩한다. 자동조직 치료기에서 탈수 및 클리어링(clearing), 침윤(infiltration)과정 후, 파라핀에 조직을 고정한 후, 박절기(microtome)를 사용하여 조직절편(histologic section)을 절단한다. 파라핀 제거 및 탈수과정 이후, 조직절편은 헤마톡실린 및 에오신 염색(H&E staining)하여 광학 현미경으로 관찰한다.

랑게르한스섬의 조직학 비교

제 1형 당뇨병을 고려해보면, 인슐린을 분비하고 주로 췌장내 랑게르한스섬을 구성하고 있는 베타세포를 파괴하여 혈당이 조절되지 않게 되므로, 헤마톡실린과 에오신 염색을 이용하여 랑게르한스섬의 크기를 관찰하였다. 측정 결과는 도 13에 나타내었다. 도 13에서 화살표는 췌장의 랑게르한스 섬(Langerhans islets)을 가리킨다. 도 13을 참고하면, 비교예 2의 당뇨 대조군(도 13의 C 및 4D)의 랑게르한스섬의 크기는 거짓 대조군과 비교하였을 때 상당히 감소하였다(도 13의A 및 B). 실시예 1의 유산균 생세포만 투여한 그룹(도 13의 E 및 F) 및 실시예 2의 유산균 사멸세포만 투여한 그룹(도 13의 G 및 H)의 랑게르한스섬의 크기는 비교예 2의 당뇨 대조군에 비하여 증가하였다. 비교예 3의 아카보스만 투여한 그룹(도 13의 I 및 J) 및 실시예 3의 유산균 혼합물과 아카보스를 병용 투여한 그룹(도 13의 K 및 L)의 랑게르한스섬의 크기는 비교예 2의 당뇨 대조군과 비교하였을 때 증가하였다.

이상의 결과들을 종합하여 고려해볼 때, 스트렙토조토신에 의해서 유발된 당뇨병 쥐에 유산균, 아카보스 또는 둘의 혼합물이 투여되는 경우에 랑게르한스섬의 크기가 증가했다. 당뇨병의 중요한 지표인 식후 혈당농도가 비교예 2의 당뇨 대조군의 농도와 비슷하게 증가하였다 하더라도, 식후 3시간까지 급격히 감소했다. 비교예 3의 아카보스만 투여한 그룹과 실시예 3의 유산균 혼합물과 아카보스를 병용 투여한 그룹의 혈당농도는 식사 후에도 다른 그룹의 혈당농도보다 낮았고, 더욱이 아카보스가 탄수화물 소화효소들의 기능을 억제하여 혈당농도를 감소시킨다는 Leonhardt 등의 연구결과와 일치했다. 특히, 비교예 3의 아카보스만 투여한 그룹과 실시예 3의 유산균 혼합물과 아카보스를 병용 투여한 그룹의 낮은 혈당농도 증가율은 식후 혈당농도 조절에서 유산균의 상승 효과(synergy effect) 때문인 것으로 생각되었다. 비교예 2의 당뇨 대조군을 제외하고 모든 그룹에서는 혈당농도가 식후 3시간 까지 일정 수준으로 감소하는데, 유산균의 단독 투여로도 당뇨병에 대한 치료효과를 가질 수 있음을 나타낸다.

제 1형 당뇨병의 회복은 인슐린을 분비하는 랑게르한스섬의 크기로 결정할 수 있었다. 도 13에 도시된 바와 같이, 모든 치료 그룹의 랑게르한스섬의 크기는 비교예 2의 당뇨 대조군의 랑게르한스섬의 크기에 비해 증가하였다. 치료 그룹들 사이에서, 랑게르한스섬의 크기 회복과 관련한 치료 효과는 실시예 3의 유산균 혼합물과 아카보스를 병용 투여한 그룹이 실시예 1의 유산균 생세포만 투여한 그룹 및 실시예 2의 유산균 사멸세포만 투여한 그룹 보다 높았다. 더욱이, 아카보스와 유산균의 병용 투여는 아카보스의 단독투여 보다 인슐린 분비조절기능의 회복과 관련하여 더 우수한 치료 효과를 나타내었다.

5. 신장의 조직학적 분석

쥐는 실험이 종료하는 즉시 마취 후 치사시켜 복부동맥(abdominal artery)에서 혈액 샘플을 채혈하고, 혈액 샘플로부터 혈청을 분리하여 FUJIFILM DRI-CHEM 4000i biochemical analyzer(Kanagawa, Japan)을 사용하여 혈청지질을 분석하였다. 당뇨병의 합병증으로 가능한 당뇨병성 신장증(diabetic nephropathy)의 존재를 확인하기 위하여, 신장의 피질(cortex) 및 수질외부(outer medullar) 및 내부(inner medullar)를 염색한다. 도 14는 이러한 조직 분석 결과를 나타낸 것으로, 도 14에서 화살표는 사이질 팽창(interstitial expansion) 또는 확장 세관(dilated tubule)을 나타낸다.

당뇨병성 신장증에서는 사구체 기저막(glomerular basement membrane)의 비대(thickening), 세관 기저막(tubular basement membrane)의 비대, 혈관사이세포(mesangial)의 팽창(expansion), 사이질(interstitial)의 팽창, 세관(tubular)의 확장(dilation), 결절사구체경화증(nodular glomerulosclerosis), 수입성(afferent) 및 수출성(efferent) 세동맥 유리질증(efferent arteriolar hyalinosis)과 같은 다양한 조직학적 변화가 발생하게 된다.

본 실시예에서, 비교예 2의 당뇨 대조군의 피질에서는 어떠한 조직학적 변화도 일어나지 않았으나(도 14의 D, E, F), 수질에서는, 사이질의 팽창 및 세관의 확장과 같은 조직학적 변화가 관찰되었다. 실시예 1(유산균 생세포만 투여한 그룹), 실시예 2(가열 사멸세포 그룹), 비교예 3(아카보스만 투여한 그룹), 실시예 3(유산균 혼합물과 아카보스를 병용 투여한 그룹)에서는 사이질의 팽창 및 세관의 확장과 같은 조직학적 변화가 거의 사라졌다. 그러므로, 도 14에 도시된 바와 같이,당뇨병성 신장증의 치료 효과는 실시예 1의 유산균 생세포만 투여한 그룹 및 비교예 3의 아카보스만 투여한 그룹이 실시예 2의 유산균 사멸세포만 투여한 그룹보다 높은 것으로 나타났다. 비교예 2의 당뇨 대조군과는 다르게, 실시예 1(유산균 생세포만 투여한 그룹), 실시예 2(가열 사멸세포 그룹), 비교예 3(아카보스만 투여한 그룹), 실시예 3(유산균 혼합물과 아카보스를 병용 투여한 그룹)에서는 사이질의 팽창 및 세관의 확장과 같은 조직병리학적 변화가 거의 일어나지 않았다. 따라서, 본 발명의 신규한 유산균 균주들 및 아카보스와 유산균의 혼합물은 당뇨병성 신장증의 치료에 유용함을 확인할 수 있다.

6. 당뇨병 쥐의 혈중 콜레스테롤 농도 분석

혈청 콜레스테롤과 혈청 지질은 동맥경화(arterial sclerosis)를 유발할 수 있고, 당뇨병의 합병증인 당뇨병성 신장증의 발병에 영향을 미칠 수 있다고 알려져 있다. 시료를 투여한지 27일이 지난 쥐의 복부 정맥(abdominal vein)에서 혈액 샘플을 채혈하여 혈청 콜레스테롤 농도를 측정하였다.

비교예 2의 당뇨 대조군에서 혈청 콜레스테롤 농도는 88 mg/dl이었고, 비교예 3의 아카보스만 투여한 그룹에서는 86.7 mg/dl으로 두 그룹 사이에 두드러진 차이는 없었다. 이것은 아카보스가 혈청 콜레스트롤 농도에 영향을 미치지 않는다는 Leonhardt 등의 보고와 일치한다. 반면에, 실시예 1의 유산균 생세포 투여 그룹의 혈청 콜레스트롤 농도는 비교예 2의 당뇨 대조군보다 20% 가량 낮은 69 mg/dl으로서, 유산균은 스트렙토조토신에 의해서 유발된 혈청 콜레스테롤 농도의 증가를 감소시킬 수 있다는 것을 확인할 수 있었다(도 15 참조).

이상의 결과를 종합해 보면, 당뇨병에 대한 치료 효과를 갖는 생존하거나 사멸한 락토바실루스 파라카제이 LPC4, 락토바실루스 람노수스 LR3 및 스트렙토코쿠스 서모필루스 ST3의 유산균 혼합물 및 아카보스와 유산균 혼합물은 이러한 질병들의 치료에 대하여 상승 효과를 가짐을 확인할 수 있다.

본 발명은 그 사상 및 범위로부터 벗어남 없이 다양하게 변형 및 변화되어 실시될 수 있고, 이러한 사실은 당업자에게 자명할 것이다. 본 명세서에 기재된 구체적 실시예는 단지 본 발명의 바람직한 구현예를 설명하기 위한 것으로, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 보호범위는 첨부된 특허청구범위에 의해서 정해져야 하며, 상기의 다양한 변형 및 변화는 본 발명의 보호범위에 포함되는 것으로 의도된다.

한국생명공학연구원 KCTC11870BP 20110302 한국생명공학연구원 KCTC11868BP 20110302 한국생명공학연구원 KCTC11866BP 20110302

Claims (11)

1. 한국생명공학연구원 미생물자원센터(Korean Collection for Type Culture; KCTC)에 수탁 번호 KCTC 11870BP로서 국제기탁된 스트렙토코쿠스 서모필루스 ST3(Streptococcus thermophilus ST3) 유산균.
   
2. 한국생명공학연구원 미생물자원센터(Korean Collection for Type Culture; KCTC)에 수탁 번호 KCTC 11868BP로서 국제기탁된 락토바실루스 람노수스 LR3 (Lactobacillus rhamnosus LR3) 유산균.
   
3. 한국생명공학연구원 미생물자원센터(Korean Collection for Type Culture; KCTC)에 수탁 번호 KCTC 11866BP로서 국제기탁된 락토바실루스 파라카제이 LPC4(Lactobacillus paracasei LPC4) 유산균.
   
4. 스트렙토코쿠스 서모필루스 ST3(Streptococcus thermophilus ST3)(KCTC 11870BP);
   락토바실루스 람노수스 LR3 (Lactobacillus rhamnosus LR3)(KCTC 11868BP); 및
   락토바실루스 파라카제이 LPC4(Lactobacillus paracasei LPC4) (KCTC 11866BP)를 포함하는 당뇨병 예방 및 치료용 조성물.
   
5. 제4항에 있어서, 상기 세 종류의 유산균 균주들은 단백질 및 다당류에 의해 2중 코팅되거나 단백질, 다당류 및 나노입자에 의해 3중 코팅된 것임을 특징으로 하는 당뇨병 예방 및 치료용 조성물.
   
6. 제4항에 있어서, 상기 조성물이 조성물 총 중량에 대해, 유효성분으로서 상기 세 종류의 유산균 균주들의 혼합물을 10⁸ 내지 10¹² cfu/g의 함량으로 포함하거나, 동등한 수의 생균을 가진 배양물을 포함하는 것을 특징으로 하는 당뇨병 예방 및 치료용 조성물.
   
7. 제4항에 있어서, 상기 조성물은 락토바실루스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실루스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 비피도박테리움 브레브(Bifidobacterium breve), 비피토박테리움 락티스 (Bifidobacterium lactis), 비피도박테리움 롱굼(Bifidobacterium longum), 락토바실루스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 락토바실루스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실루스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실루스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum), 락토바실루스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실루스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실루스 델브루에키(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실루스 레우테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실루스 부츠네리(Lactobacillus buchneri), 락토바실루스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실루스 존스니(Lactobacillus johonsonii), 락토바실루스 케피르(Lactobacillus kefir), 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis), 비피도박테리움 비피듐(Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis), 비피도박테리움 수도롱굼(Bifidobacterium pseudolongum), 비피도박테리움 서모필룸 (Bifidobacterium themophilum), 비피도박테리움 아돌센티스 (Bifidobacterium adolescentis)로 구성되는 군에서 선택되는 1종 이상의 유산균을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 당뇨병 예방 및 치료용 조성물.
   
8. 제4항에 있어서,상기 조성물이 제약학적 허용되는 담체 또는 부형제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 당뇨병 예방 및 치료용 조성물.
   
9. 제4항에 있어서, 상기 유산균 균주들을 동결-건조하여 생균제 형태로 제조된 것임을 특징으로 하는 당뇨병 예방 및 치료용 조성물.
   
10. 제4항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 당뇨병 예방 및 치료용 조성물로 이루어진 것을 특징으로 하는 약품.
    
11. 제4항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 당뇨병 예방 및 치료용 조성물로 이루어진 것을 특징으로 하는 식품.

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