CN116218703A - 一株植物乳杆菌、具肠道粘附力的组合物及其制法和作为高脂饮食肠道屏障保护剂的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）JY055，植物乳杆菌保藏于广东省微生物菌种保藏中心，广州，保藏日期为2022年08月27日，保藏编号为GDMCC NO：62720。本发明还公开了具肠道粘附力的组合物以及制法和应用，包括植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）JY055的胞外多糖和副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）JY062；本发明使用植物乳杆菌JY055的胞外多糖与副干酪乳杆菌JY062进行组合，提升对Caco‑2细胞的黏附率，验证了粘附组合物对高脂饮食小鼠肠道屏障的保护效果。

Description

一株植物乳杆菌、具肠道粘附力的组合物及其制法和作为高 脂饮食肠道屏障保护剂的应用
技术领域
本发明涉及一株植物乳杆菌、具肠道粘附力的组合物及其制法和作为高脂饮食肠道屏障保护剂的应用，属于微生物技术领域。
背景技术
乳酸菌作为研究最为广泛的一类益生菌，在生物体内发挥多种作用，乳酸菌对宿主健康有许多贡献，如提高消化效率、促进免疫系统发育、参与调节能量代谢、生成功能代谢物、维持肠道稳态、抑制病原菌。因此，如何提升机体益生菌含量从而发挥其更大益生功效成为研究的热点。
乳酸菌粘附是定殖的先决条件，并且是菌株和宿主相互作用的能力有关的重要特征。因此，粘附力一直是新益生菌菌株的主要评价标准之一。该特性对于乳酸菌的定殖很重要，并且与乳酸菌的某些益生功能有关。乳酸菌进入机体存在两个去向：1.部分留存在机体内并定殖在消化道各段，2.随肠道蠕动和机体代谢排出体外。尤其对于粘附力弱的乳酸菌，进入机体后会随着胃肠道的蠕动不断被排到体外，而高粘附性的乳酸菌可以与肠上皮细胞发生相互作用，得以在肠道内留存和繁殖，继而充分发挥其益生功效。当前提升乳酸菌粘附的方法主要有：选取合适的中间物质充当乳酸菌与肠道细胞的媒介(如益生元，有机化合物等)；通过改变乳酸菌培养基质(碳源，氮源等)或基因改型来改变乳酸菌代谢最终提升黏附；改变非特异性黏附影响因素(疏水相互作用，静电力等)，但这些方法存在安全性和成本较高的问题，同时，可以促进乳酸菌粘附的天然性来源物质尚未得到有效开发。所以，发明一种低成本、安全性高的、提升乳酸菌对肠道粘附力的方法，对于益生菌株的开发和利用具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种可以提高乳酸菌对肠道粘附力的组合物。
同时，本发明提供一株可产胞外多糖的植物乳杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)JY055。
同时，本发明提供一种具肠道粘附力的组合物的制法，该法采用优化后的MRS培养基，获得的植物乳杆菌JY055的胞外多糖的提取量提升了50％。
同时，本发明提供一种具肠道粘附力的组合物在作为高脂饮食肠道屏障保护剂中的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
一株植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)JY055，所述植物乳杆菌保藏于广东省微生物菌种保藏中心，广州，保藏日期为2022年08月27日，保藏编号为GDMCC NO：62720。
所述植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)JY055来源于西藏传统发酵乳制品，该菌株经测序分析，其16S rDNA序列如下(SEQ ID NO:1)：GACGTGGGGGGCGGGCCTAATACATGCAAGTCGAACGAACTCTGGTATTGATTGGTGCTTGCATCATGATTTACATTTGAGTGAGTGGCGAACTGGTGAGTAACACGTGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGTTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACTTTTGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGGGTAACGGCTCACCATGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTATTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGTATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATACCGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACTATGCAAATCTAAGAGATTAGACGTTCCCTTCGGGGACATGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTATCAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTGGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAACTCGCGAGAGTAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTAGGAACCAGCCGCTAAGGTGGACCGAAAGT，将测序得到的序列在NCBI数据库中进行核酸序列比对，结果显示菌株为植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)JY055，所述植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)JY055(下文中简称植物乳杆菌JY055)在MRS培养基上的表面光滑、圆形、水润有光泽、乳白色且不透明、直径为0.5～1.8mm。
植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)JY055的筛选、鉴定、培养、观察和保存如下：
1、筛选
取1g来源于西藏地区的传统发酵乳制品，梯度稀释后涂布于MRS固体培养基(含快速筛选)中，置于37℃厌氧环境中培养48h，观察并记录菌落形态；挑取表面湿润、白色有突起且挑起有明显拉丝效果的菌落在MRS固体培养基上划线，于37℃厌氧的条件下进行纯化培养48-72h，重复此操作3次，获得纯化后的单菌落；挑取单菌落在MRS固体培养基上划线，37℃厌氧培养48-72h。
2、鉴定
提取筛选得到的菌株的基因组，将菌株的16S rDNA进行扩增和测序(扩增得到的16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)，将获得的序列在NCBI-Blast中进行核酸序列比对，结果显示菌株为植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)JY055。
其中，16S rDNA扩增所用引物如下：
上游引物：5’-CTAATACCGCATAACAACT-3’；
下游引物：5’-CCTAAATAACCCGCAT-3’；
16S rDNA扩增程序如下：
95℃5min；35个循环(95℃30s；55℃30s；72℃2min)；72℃10min后冷却至4℃。
4、保存
挑取植物乳杆菌JY055的单菌落接入MRS液体培养基中，于37℃厌氧的条件下培养18h，得到菌液；将所得菌液与灭菌后的80％(v/v)甘油以3：1(v/v)的比例混匀后-80℃保存于冻存管中。同时，将所述植物乳杆菌保藏于广东省微生物菌种保藏中心，广州，保藏日期为2022年08月27日，保藏编号为GDMCC NO：62720。
所述植物乳杆菌JY055的活菌数不低于108CFU/mL。
包含一株植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)JY055的具肠道粘附力的组合物，包括植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)JY055的胞外多糖和副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)JY062；所述胞外多糖的浓度为30～50mg/mL，所述副干酪乳杆菌JY062的浓度为109～1010CFU/mL。
一种具肠道粘附力的组合物的制备方法，包括以下步骤：
步骤一，获得植物乳杆菌JY055菌株可利用的碳氮源；
步骤二，将可利用的碳氮源以等质量比替换MRS培养基中的碳氮源，获得优化后的MRS培养基；
步骤三，制备植物乳杆菌JY055的胞外多糖：
将活化好的植物乳杆菌JY055按4～5％体积转接至优化后的MRS培养基中，35～37℃培养24～36h，收获培养液后在高速冷冻离心机中离心，收取上清液，沸水浴5～8min，冷却至室温后加入80～85％三氯乙酸至三氯乙酸终浓度为10～20％，充分搅拌后静置30～40min，离心，收取上清液至洁净烧杯中，加入3～5倍体积的90～95％乙醇，4～5℃过夜后离心，收获沉淀后将其重新溶于去离子水中，转入透析袋，分子截留量＞8000KDa，在去离子水中透析，每4～5h换一次蒸馏水，透析至少48h；透析完成后使用真空冷冻干燥机冻干，得到胞外多糖，-10～-20℃保存。
步骤一的具体方法为：
将保藏菌种管在酒精灯火焰上方开盖，用玻璃三角瓶121.0℃灭菌10-30mL的生理盐水20～30min；将开封后的保藏菌种管内的冻干粉1-2g倒入生理盐水中，摇匀；用接种环沾取冻干粉倒入生理盐水后形成的菌液，转接于MRS培养基平板上，在35～37℃中恒温培养48～60h，进行活化；活化后的植物乳杆菌JY055菌株在平板上进行三区划线，MRS琼脂培养基培养至少48h后，用Inoculatorz棉签挑取直径3mm的菌落到接种液IF3中，配成菌悬液；将菌悬液以20～30r/min的速度搅拌均匀，保证菌悬液不起气泡，并用浊度仪检测，调节菌悬液的浓度至90-98％T；在Biolog GenIII微孔板中，每孔加入100μL的菌悬液，之后将微孔板直接放入OmniLog的孵育、读数仪中，37℃培养48h，分析菌株可利用的碳氮源；将可利用的碳氮源加入到无碳氮源的MRS培养基中，制备优化后的MRS培养基。
T为浊度单位，数值越小越浑浊，浊度仪检测前需检察、校准，使用标准比浊管(85％T或65％T)，根据浊度仪的使用手册验证浊度仪已经校准且运行正常。使用未接种的含有接种液的干净接种管(擦去管壁污垢及指纹)调整浊度仪空白。由于每只管子在光学性能上并不完全相同，所以分别针对每只接种液来调空白，将浊度仪透光度指针调至100％T。
孵育、读数仪为仪器名称。
所述MRS培养基的配方包括如下试剂：蛋白胨5.0g，胰蛋白胨10.0g，牛肉膏5.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖20.0g，柠檬酸氢二铵2.6g，磷酸氢二钾2.0g，乙酸钠5.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，Tween-80 1mL；
MRS培养基的制备方法为：按照上述配方准确称取上述试剂定容于1000mL蒸馏水中，混匀后，pH调至5.8，121℃灭菌15min，4℃保存备用。
所述可利用的碳氮源包括甘露糖，葡萄糖，乳糖和果糖。
所述优化后的MRS培养基的配方包括如下试剂：蛋白胨5.0g，胰蛋白胨10.0g，牛肉膏5.0g，酵母粉5.0g，甘露糖5.0g，葡萄糖5.0g，乳糖5.0g，果糖5.0g，柠檬酸氢二铵2.6g，磷酸氢二钾2.0g，乙酸钠5.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，Tween-80 1mL；
优化后的MRS培养基的制备方法为：按照上述配方准确称取上述试剂定容于1000mL蒸馏水中，混匀后，pH调至5.8，121℃灭菌15min，4℃保存备用。
步骤三中，离心工艺为10000r/min，4℃，10min。
接种液IF3的配方如下：0.40％氯化钠；0.03％聚醚F-68；0.02％结冷胶和余量的水；
接种液IF3的制备过程如下：加0.2g结冷胶至1L水中；煮沸并持续搅拌，直至结冷胶完全溶解；停止加热，继续搅拌；加4g氯化钠，搅拌至完全溶解；加0.3g聚醚F-68，搅拌至完全溶解；分装到20×150mm的试管中，每管装19～20mL；在121℃下灭菌30min。
一种具肠道粘附力的组合物在作为高脂饮食肠道屏障保护剂中的应用。
本发明具有以下有益效果：
1.本发明通过微生物表型分析，解析植物乳杆菌JY055可以同时利用果糖，甘露糖，葡萄糖和乳糖，以此为碳源，分泌产生胞外多糖；
2.本发明将果糖，甘露糖，葡萄糖和乳糖替换MRS培养基中的碳源作为优化后的MRS培养基，与正常MRS培养基做对比，比较提取胞外多糖量的差异性，发现优化碳源后，胞外多糖的提取量提升了50％；
3.使用植物乳杆菌JY055的胞外多糖与副干酪乳杆菌JY062进行组合，显著提升对Caco-2细胞的黏附率，副干酪乳杆菌粘附率为36.94±1.27％，提升了近1.5倍；
4.在小鼠体内验证了粘附组合物对高脂饮食小鼠肠道屏障的保护效果。
附图说明
图1为植物乳杆菌JY055菌落形态图；
图2为植物乳杆菌JY055碳源分析利用结果图；
图3为碳源优化前后培养基提取胞外多糖的提取量的差别图；
图4为小鼠结肠内Lactobacillus.paracasei JY062的荧光值；
图5为小鼠血清中FFA含量的对比图；
图6为小鼠血清中LPS含量的对比图；
图7为免疫荧光组化图；
图8为免疫组化蛋白平均光密度值。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作更进一步的说明。
本发明中，植物乳杆菌JY055的拉丁名为Lactiplantibacillus plantarumJY055，保藏于广东省微生物菌种保藏中心保藏，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所，保藏编号为GDMCC.No62720。副干酪乳杆菌JY062的拉丁名为Lactobacillus paracasei JY062，保藏于东北农业大学乳品重点实验室，本发明中的副干酪乳杆菌JY062的现有技术来源为：一株高产胞外多糖降血糖副干酪乳杆菌JY062(TD062)的黏附性与耐受性评价[J].中国乳品工业，2022，50(4)。
实施例1
本实施例的目的是为了提供一株植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)JY055，所述植物乳杆菌保藏于广东省微生物菌种保藏中心，广州，保藏日期为2022年08月27日，保藏编号为GDMCC NO：62720。
如图1所示，所述植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)JY055在MRS培养基上的菌落突起，表面光滑、圆形、水润有光泽、乳白色且不透明、直径为0.5～1.8mm。
本实施例的目的是为了提供一种可以提高乳酸菌对肠道粘附力的组合物。本实施例使用植物乳杆菌JY055的胞外多糖与副干酪乳杆菌JY062进行组合(109CFU/mL与30mg/mL的菌糖组合溶液)，能够显著提高副干酪乳杆菌JY062对Caco-2细胞的黏附率，副干酪乳杆菌JY062的黏附性从15.33±0.98％提高到36.94±1.27％，提高了近1.5倍；并在小鼠体内验证了组合物对高脂饮食小鼠肠道屏障的保护效果。
原理：胞外多糖是乳酸菌在生长代谢过程中分泌到细胞壁外常渗于培养基的一类糖类化合物，因其具有黏附素，与益生菌进行组合，可以利用胞外多糖的黏附素与细胞表面存在的粘附受体结合，显著提升黏附作用，进而发挥出益生菌更好的功能作用。
本实施例采用的实验菌株为副干酪乳杆菌JY062和植物乳杆菌JY055。
将菌种管顶端在火焰上加热，注意避免直接加热菌体或加热过度。用玻璃三角瓶121.0℃灭菌约10mL的生理盐水20min。将开封后的冻干粉1g倒入生理盐水中，摇匀。用接种环沾取冻干粉倒入生理盐水后形成的菌液，转接于MRS培养基平板上，在37℃中恒温培养48h，进行活化。
将活化后的植物乳杆菌JY055菌株在MRS培养基平板上进行三区划线，MRS琼脂培养基培养48h后，用Inoculatorz棉签挑取直径3mm的菌落到接种液IF3中，配成菌悬液。使用棉签少量多次蘸取菌落，将菌悬液轻轻搅拌均匀，保证菌悬液不起气泡，并用浊度仪检测，调节菌悬液的浓度至90-98％T。在Biolog GenIII微孔板中，每孔加入100μL的菌悬液，之后将微孔板直接放入OmniLog的孵育、读数仪中，37℃培养48h，分析菌株可利用的碳氮源。
T为NTU，浊度是散射浊度单位NTU，也称TU。1TU＝1JTU。
MRS培养基平板和MRS琼脂培养基均为现有的市售商品。
接种液IF3的配方如下：0.40％sodium chloride(氯化钠，NaCl)(维持渗透压)；0.03％Pluronic F-68(聚醚F-68，e.g Sigma#P7061)(一种非离子表面活性剂，可降低表面张力，使菌体易于分散在水中)；0.02％ Gellan Gum(结冷胶，e.g PhytagelSigma#P8169)(一种食用胶，可增大液体粘度，使菌体均匀分散不易沉降)。制备过程如下：加0.2gGellanGum至1L水中；煮沸并持续搅拌，直至Gellan Gum完全溶解；停止加热，继续搅拌；加4gNaCl，搅拌至完全溶解；加0.3g聚醚F-68，搅拌至完全溶解；分装到20×150mm的试管中，每管装19mL左右；在121℃下灭菌30min。
如图2所示，本实施例通过微生物表型分析，获得了植物乳杆菌JY055对碳源的利用情况，图2为植物乳杆菌JY055碳源分析利用结果，从图2中可以看到，植物乳杆菌JY055可以同时利用甘露糖，葡萄糖，乳糖和果糖。
将可利用的碳氮源加入到无碳氮源的MRS培养基中，制备优化后的MRS培养基。
MRS培养基的配方包括如下试剂：蛋白胨5.0g，胰蛋白胨10.0g，牛肉膏5.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖20.0g，柠檬酸氢二铵2.6g，磷酸氢二钾2.0g，乙酸钠5.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，Tween-80 1mL；
MRS培养基的制备方法为：按照上述配方准确称取上述试剂定容于1000mL蒸馏水中，混匀后，pH调至5.8，121℃灭菌15min，4℃保存备用。
优化后的MRS培养基的配方包括如下试剂：蛋白胨5.0g，胰蛋白胨10.0g，牛肉膏5.0g，酵母粉5.0g，甘露糖5.0g，葡萄糖5.0g，乳糖5.0g，果糖5.0g，柠檬酸氢二铵2.6g，磷酸氢二钾2.0g，乙酸钠5.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，Tween-80 1mL；
优化后的MRS培养基的制备方法为：按照上述配方准确称取上述试剂定容于1000mL蒸馏水中，混匀后，pH调至5.8，121℃灭菌15min，4℃保存备用。
将活化好的植物乳杆菌JY055(植物乳杆菌JY055的活化方法同上，将菌种管顶端在火焰上加热，注意避免直接加热菌体或加热过度。用玻璃三角瓶121.0℃灭菌约10mL的生理盐水15min。将开封后的植物乳杆菌JY055冻干粉1g倒入生理盐水中，摇匀。用接种环沾取冻干粉倒入生理盐水后形成的菌液，转接于MRS培养基平板上，在37℃中恒温培养48h，进行活化)按4％体积分别转接至MRS液体培养基和优化后的MRS培养基中，37℃培养24h，收获培养液后在高速冷冻离心机中离心(10000r/min，4℃，10min)收取上清液，沸水浴5min，冷却至室温后加入80％三氯乙酸至三氯乙酸终浓度为10％，充分搅拌后静置30min，10000r/min，4℃离心10min，收取上清液至洁净烧杯中，加入3倍体积的95％乙醇，4℃过48h后10000r/min，4℃离心10min，收获沉淀后将其重新溶于去离子水中，转入透析袋(分子截留量＞8000KDa)在去离子水中透析，每4h换一次蒸馏水，透析48h。透析完成后使用真空冷冻干燥机冻干，得到胞外多糖(-20℃保存)，比较MRS液体培养基和优化后的MRS培养基中提取胞外多糖的量的差异。
如图3所示，为碳源优化前后培养基提取胞外多糖提取量的差别图，从图3中可以看到，本实施例将果糖，甘露糖，葡萄糖和乳糖替换MRS培养基中的碳源作为优化后的MRS培养基，与正常MRS培养基做对比，比较提取胞外多糖量的差异性，发现优化碳源后，胞外多糖的提取量提升了50％。
cFDA-SE储备液的制备：在避光条件下，取5.0mg cFDA-SE溶于8.969mL的二甲基亚砜(DMSO)中，使用0.22μm滤膜过滤除菌得到1mM的荧光染料储备液，-20℃避光保存，避免反复冻融。
无菌DMEM细胞培养液的制备：10mL胎牛血清，90mL高糖培养液，1mL非必需氨基酸，1mL双抗(选择性添加)，混匀过滤除菌，4℃保存备用。
10mM的PBS溶液制备：NaCl 8g/L，KCl 0.2g/L，Na2HPO4 1.44g/L，KH2PO40.24g/L，1000mL蒸馏水，调节pH至7.2-7.4，过滤除菌，置于4℃保存备用。
Caco-2细胞的培养：将冻存于液氮罐中的Caco-2细胞取出，置于37℃水浴中迅速解冻，随后将细胞加入到含胎牛血清(20％，v/v)和青霉素-链霉素(1％，v/v)的无菌DMEM细胞培养液中(15mL离心管)，轻轻混匀后离心(1000rpm，5min)去除冻存液中残留的DMSO(二甲基亚砜)，收集细胞转入含完全培养基的细胞培养瓶中，在37℃，5％CO2的培养箱中孵育至细胞出现贴壁，每24h更换一次培养液，细胞培养至极化状态后按照1:3的比例传代。
乳酸菌的荧光标记：使用无菌DMEM细胞培养液配制浓度分别为0、10、20、30、40、50mg/mL的胞外多糖溶液，4℃保存待用。称取5mg cFDA-SE溶于8.969mL DMSO中，得到1mM/L的cFDA-SE储备液，-20℃避光保存。离心收集生长期在对数末期的乳酸菌(即副干酪乳杆菌JY062)，使用无菌PBS重复洗涤菌泥三次，将菌泥重悬于PBS。往乳酸菌悬液中加入cFDA-SE储备液使其终浓度为20μm/L，随即转入37℃水浴中避光孵育20min，孵育结束后用PBS缓冲液洗去菌液中残留的荧光染料(重复3～5次)。最后使用流式细胞仪检测荧光标记效果，将标记好的细菌重悬于不同浓度胞外多糖溶液中，调整菌浓度至109CFU/mL(EPS-乳酸菌荧光悬液)，使用荧光分光光度计测量荧光值，记为菌株初始荧光强度(F0)。荧光检测条件为：激发波长490nm，发射波长520nm。
菌糖组合与Caco-2细胞共培养：培养至极化状态的Caco-2细胞按照105个/孔接种于六孔板中，待培养至细胞单层近似铺满六孔板时，将六孔板中DMEM完全培养液吸出并使用PBS洗涤三次，加入不含双抗的培养液继续培养至细胞完全铺满六孔板。最后，吸出培养液并在每个孔中加入1mL的胞外多糖-乳酸菌荧光悬液，转入细胞培养箱中孵育2h，每组设置三个平行，全程避光操作。比较单菌与菌糖组合的黏附率差异。
黏附率计算：培育2h后，吸出六孔板中的液体并用PBS洗涤三次(洗去未黏附的乳酸菌)，随后向每个孔中加入0.5mL胰酶促使细胞脱落(37℃，4min)。胰酶消化完成后，向每个孔中再加入0.5mL不含双抗的培养液来终止消化。最后，收集各个孔中的细胞-乳酸菌菌悬液并使用移液枪反复吹吸，再次使用荧光分光光度计(荧光检测条件不变)测量细胞-乳酸菌悬液的荧光值，记为黏附后荧光强度(F1)。
黏附率计算公式：菌株粘附率(％)＝(F1/F0)×100％。
体内黏附试验：27只SPF级C57BL-6J雄性小鼠(五周龄，20±1g)置于23±1℃和55±5％湿度的环境中饲喂，在12小时的光/暗循环环境中自由地摄取食物和纯净饮水。经一周的适应性喂养后分为三组：正常饲喂组A(3只)、荧光标记的Lactobacillus paracaseiJY062灌胃组B(109CFU/mL，12只)、荧光标记的Lactobacillus paracasei JY062+EPS灌胃组C(109CFU/mL，30mg/mL，12只)，所有小鼠均使用质量分数为5％的脱脂乳作为灌胃基质，每只小鼠灌胃量为200μL。在灌胃结束后的12h、1d、3d、7d分别脱颈处死B、C组的小鼠，A组小鼠在灌胃结束后的第7日处死。收集各组小鼠结肠组织，在无菌操作台中避光剪开结肠肠壁，使用无菌PBS反复冲洗并收集冲洗液，随后使用细胞滤网过滤清洗液，在流式细胞仪中检测冲洗液的荧光值。以组A为对照，记录B组和C组的荧光强度。(注：在不额外补充乳酸菌且不改变饮食习惯的常规饲喂下，默认小鼠肠道菌群为稳定状态，所以A组小鼠只需做一次结肠采样)。
如表1所示，为副干酪乳杆菌JY062与胞外多糖复合前后黏附率的对比结果。
具体地，胞外多糖对副干酪乳杆菌JY062黏附率的影响见下表1。使用荧光探针标记乳酸菌，并通过黏附前后的荧光比值计算得到副干酪乳杆菌JY062的初始黏附率及与胞外多糖复合后的黏附率，对Caco-2细胞的黏附率得到提升，黏附率从15.33％上升到40.86％，提升率为166.54％，显著高于初始黏附率(p<0.01)。
表1胞外多糖对副干酪乳杆菌JY062黏附率的影响表
Figure BDA0003918700670000121
注：**P<0.01，与副干酪乳杆菌JY062组相比具有显著性差异。
如表2所示，菌株荧光标记前后的荧光迁移率，从表2中可以看出，使用流式细胞仪对荧光探针cFDA-SE标记的Lactobacillus paracasei JY062进行标记效果检测。检测结果如表2所示，标记后的菌株荧光迁移完全，表明荧光标记的效果良好。
表2菌株荧光标记前后的荧光迁移率
Figure BDA0003918700670000122
将cFDA-SE荧光探针标记的Lactobacillus paracasei JY062、EPS+Lactobacillus paracasei JY062分别灌胃给小鼠并在灌胃后的12h、1d、3d、7d使用流式细胞仪检测Lactobacillus paracasei JY062在小鼠结肠中的荧光强度。结果见图4。
如图4所示，灌胃后的12h至24h，菌株陆续进入结肠部位，荧光强度呈现上升趋势；自灌胃后24h至第7天，荧光强度逐步下降，这主要是因为荧光会随时间和菌株的分裂增殖而持续衰减，同时未黏附的菌株会随肠道蠕动被排出体外。但总体来看，自灌胃后的12h至第7天，EPS和Lactobacillus paracasei JY062复合灌胃的小鼠结肠洗脱液荧光值均高于单独灌胃Lactobacillus paracasei JY062的荧光值。这说明相比于单独灌胃Lactobacillus paracasei JY062，EPS和Lactobacillus paracasei JY062的复合灌胃对Lactobacillus paracasei JY062在结肠内的黏附具有明显的提升效果，这与体外细胞黏附试验结果具有一致性。
小鼠实验：菌糖组合物对高脂饮食小鼠肠道屏障的保护效果：
购入50只C57BL-6J五周龄雄性小鼠，适应性喂养一周后，随机平均分为五组：NC(正常饮食组)、HFD(高脂饮食组)、EPS(胞外多糖+高脂饮食组)、JY062(副干酪乳杆菌JY062+高脂高糖饮食组)、EPP(胞外多糖+副干酪乳杆菌JY062+高脂饮食组)。胞外多糖和乳酸菌的灌喂浓度分别为30mg/mL和109CFU/mL，每只小鼠每日灌胃200μL(使用5％脱脂乳做为灌胃基质)，持续喂养12周后，小鼠眼球取血后脱颈处死，回收完整结肠组织。
使用ELISA试剂盒对各组小鼠血清中游离脂肪酸(FFA)和脂多糖(LPS)进行测量，并对结肠中紧密连接蛋白Claudin-1、Occludin-1、ZO-1和粘蛋白Mucin-2进行免疫组化分析。
如图5所示，为各组小鼠血清中FFA含量的对比图，其中，*P<0.05；**P<0.01与HFD组相比具有显著性差异；##P<0.01，与NC组相比具有显著性差异。从图5中可以看出，HFD(高脂饮食组)小鼠血清中FFA含量显著增高，只有EPP(胞外多糖+副干酪乳杆菌JY062+高脂饮食组)组的FFA含量与NC(正常饮食组)相当。说明本实施例的组合物可以显著降低高脂饮食小鼠血清中FFA。
如图6所示，为各组小鼠血清中LPS含量的对比图，其中，*P<0.05；**P<0.01与HFD组相比具有显著性差异；##P<0.01，与NC组相比具有显著性差异。从图6中可以看出，HFD组小鼠血清中LPS含量显著增高，只有EPP组的LPS含量与NC组相当。说明本实施例的组合物可以显著降低高脂饮食小鼠血清中LPS。
如图7所示，为各组小鼠的免疫荧光组化图，紧密连接蛋白和粘蛋白是肠道屏障的重要分子组成，从图7中可以看出，HFD(高脂饮食组)小鼠结肠组织中紧密连接蛋白和粘蛋白的分布和平均密度显著低于NC组(p<0.01)；相比于HFD组，三个饮食干预组在不同程度上促进了紧密连接蛋白和粘蛋白的分泌(p<0.01，p<0.05)。这表明饮食干预对于维持肠屏障功能具有积极作用，EPP(胞外多糖+副干酪乳杆菌JY062+高脂饮食组)效果最为明显。
如图8所示，为各组小鼠的免疫组化蛋白平均光密度值，其中，*P<0.05；**P<0.01与HFD组相比具有显著性差异；##P<0.01，与NC组相比具有显著性差异，从图8中可以看出，HFD组小鼠胰岛β细胞数量显著低于NC组和三个饮食干预组(p<0.01，p<0.05)，这主要是因为STZ、机体炎症和糖毒性对胰岛β细胞的损伤以及胰岛素敏感度降低导致其持续过量的分泌胰岛素而过早衰亡造成的。饮食干预组小鼠的胰岛β细胞数目显著高于HFD组则表明饮食干预在一定程度上减轻了有害代谢物对胰岛β细胞的损伤，EPP(胞外多糖+副干酪乳杆菌JY062+高脂饮食组)效果最为明显。
实施例2
本实施例的目的是为了提供一种可以提高乳酸菌对肠道粘附力的组合物。本实施例使用植物乳杆菌JY055的胞外多糖与副干酪乳杆菌JY062进行组合(1010CFU/mL与50mg/mL的菌糖组合溶液)，能够显著提高副干酪乳杆菌JY062对Caco-2细胞的黏附率；并在小鼠体内验证了组合物对高脂饮食小鼠肠道屏障的保护效果。
本实施例还提供一种具肠道粘附力的组合物的制法，包括以下步骤：
步骤一，获得植物乳杆菌JY055菌株可利用的碳氮源；
步骤二，将可利用的碳氮源以等质量比替换MRS培养基中的碳氮源，获得优化后的MRS培养基；
步骤三，制备植物乳杆菌JY055的胞外多糖：
将活化好的植物乳杆菌JY055按5％体积转接至优化后的MRS培养基中，35℃培养36h，收获培养液后在高速冷冻离心机中离心，收取上清液，沸水浴8min，冷却至室温后加入85％三氯乙酸至三氯乙酸终浓度为20％，充分搅拌后静置40min，离心，收取上清液至洁净烧杯中，加入5倍体积的90％乙醇，5℃过夜后离心，收获沉淀后将其重新溶于去离子水中，转入透析袋，分子截留量＞8000KDa，在去离子水中透析，每5h换一次蒸馏水，透析60h；透析完成后使用真空冷冻干燥机冻干，得到胞外多糖，-10℃保存。
步骤一的具体方法为：
将菌种管顶端在火焰上加热，注意避免直接加热菌体或加热过度；用玻璃三角瓶121.0℃灭菌约30mL的生理盐水30min；将开封后的冻干粉2g倒入生理盐水中，摇匀；用接种环沾取冻干粉倒入生理盐水后形成的菌液，转接于MRS培养基平板上，在35℃中恒温培养60h，进行活化；活化后的植物乳杆菌JY055菌株在平板上进行三区划线，MRS琼脂培养基培养60h后，用Inoculatorz棉签挑取直径3mm的菌落到接种液IF3中，配成菌悬液；将菌悬液轻轻搅拌均匀，优选为30r/min，保证菌悬液不起气泡，并用浊度仪检测，调节菌悬液的浓度至90-98％T；在Biolog GenIII微孔板中，每孔加入100μL的菌悬液，之后将微孔板直接放入OmniLog的孵育、读数仪中，37℃培养48h，分析菌株可利用的碳氮源；将可利用的碳氮源加入到无碳氮源的MRS培养基中，制备优化后的MRS培养基。
实施例3
本实施例的目的是为了提供一种可以提高乳酸菌对肠道粘附力的组合物。本实施例使用植物乳杆菌JY055的胞外多糖与副干酪乳杆菌JY062进行组合(109CFU/mL与40mg/mL的菌糖组合溶液)，能够显著提高副干酪乳杆菌JY062对Caco-2细胞的黏附率；并在小鼠体内验证了组合物对高脂饮食小鼠肠道屏障的保护效果。
本实施例还提供一种具肠道粘附力的组合物的制法，包括以下步骤：
步骤一，获得植物乳杆菌JY055菌株可利用的碳氮源；
步骤二，将可利用的碳氮源以等质量比替换MRS培养基中的碳氮源，获得优化后的MRS培养基；
步骤三，制备植物乳杆菌JY055的胞外多糖：
将活化好的植物乳杆菌JY055按4.5％体积转接至优化后的MRS培养基中，36℃培养30h，收获培养液后在高速冷冻离心机中离心，收取上清液，沸水浴6min，冷却至室温后加入85％三氯乙酸至三氯乙酸终浓度为15％，充分搅拌后静置35min，离心，收取上清液至洁净烧杯中，加入4倍体积的90％乙醇，5℃过夜后离心，收获沉淀后将其重新溶于去离子水中，转入透析袋，分子截留量＞8000KDa，在去离子水中透析，每4.5h换一次蒸馏水，透析50h；透析完成后使用真空冷冻干燥机冻干，得到胞外多糖，-15℃保存。
步骤一的具体方法为：
将菌种管顶端在火焰上加热，注意避免直接加热菌体或加热过度；用玻璃三角瓶121.0℃灭菌约20mL的生理盐水25min；将开封后的冻干粉1.5g倒入生理盐水中，摇匀；用接种环沾取冻干粉倒入生理盐水后形成的菌液，转接于MRS培养基平板上，在36℃中恒温培养50h，进行活化；活化后的植物乳杆菌JY055菌株在平板上进行三区划线，MRS琼脂培养基培养60h后，用Inoculatorz棉签挑取直径3mm的菌落到接种液IF3中，配成菌悬液；将菌悬液轻轻搅拌均匀，优选为20r/min，保证菌悬液不起气泡，并用浊度仪检测，调节菌悬液的浓度至90-98％T；在Biolog GenIII微孔板中，每孔加入100μL的菌悬液，之后将微孔板直接放入OmniLog的孵育、读数仪中，37℃培养48h，分析菌株可利用的碳氮源；将可利用的碳氮源加入到无碳氮源的MRS培养基中，制备优化后的MRS培养基。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一株植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)JY055，其特征在于，所述植物乳杆菌保藏于广东省微生物菌种保藏中心，广州，保藏日期为2022年08月27日，保藏编号为GDMCC NO：62720。
2.包含权利要求1所述的一株植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)JY055的具肠道粘附力的组合物，其特征在于，包括植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)JY055的胞外多糖和副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)JY062；所述胞外多糖的浓度为30～50mg/mL，所述副干酪乳杆菌JY062的浓度为109～1010CFU/mL。
3.根据权利要求2所述的具肠道粘附力的组合物的制法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一，获得植物乳杆菌JY055菌株可利用的碳氮源；
步骤二，将可利用的碳氮源以等质量比替换MRS培养基中的碳氮源，获得优化后的MRS培养基；
步骤三，制备植物乳杆菌JY055的胞外多糖：
将活化好的植物乳杆菌JY055按4～5％体积转接至优化后的MRS培养基中，35～37℃培养24～36h，收获培养液后在高速冷冻离心机中离心，收取上清液，沸水浴5～8min，冷却至室温后加入80～85％三氯乙酸至三氯乙酸终浓度为10～20％，充分搅拌后静置30～40min，离心，收取上清液至洁净烧杯中，加入3～5倍体积的90～95％乙醇，4～5℃过夜后离心，收获沉淀后将其重新溶于去离子水中，转入透析袋，分子截留量＞8000KDa，在去离子水中透析，每4～5h换一次蒸馏水，透析至少48h；透析完成后使用真空冷冻干燥机冻干，得到胞外多糖，-10～-20℃保存。
4.根据权利要求3所述的制法，其特征在于，步骤一的具体方法为：
将保藏菌种管在酒精灯火焰上方开盖，用玻璃三角瓶121.0℃灭菌10-30mL的生理盐水20～30min；将开封后的保藏菌种管内的冻干粉1-2g倒入生理盐水中，摇匀；用接种环沾取冻干粉倒入生理盐水后形成的菌液，转接于MRS培养基平板上，在35～37℃中恒温培养48～60h，进行活化；活化后的植物乳杆菌JY055菌株在平板上进行三区划线，MRS琼脂培养基培养至少48h后，用Inoculatorz棉签挑取直径3mm的菌落到接种液IF3中，配成菌悬液；将菌悬液以20～30r/min的速度搅拌均匀，保证菌悬液不起气泡，并用浊度仪检测，调节菌悬液的浓度至90-98％T；在Biolog GenIII微孔板中，每孔加入100μL的菌悬液，之后将微孔板直接放入OmniLog的孵育、读数仪中，37℃培养48h，分析菌株可利用的碳氮源；将可利用的碳氮源加入到无碳氮源的MRS培养基中，制备优化后的MRS培养基。
5.根据权利要求4所述的制法，其特征在于，所述MRS培养基的配方包括如下试剂：蛋白胨5.0g，胰蛋白胨10.0g，牛肉膏5.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖20.0g，柠檬酸氢二铵2.6g，磷酸氢二钾2.0g，乙酸钠5.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，Tween-80 1mL；
MRS培养基的制备方法为：按照上述配方准确称取上述试剂定容于1000mL蒸馏水中，混匀后，pH调至5.8，121℃灭菌15min，4℃保存备用。
6.根据权利要求4所述的制法，其特征在于，所述可利用的碳氮源包括甘露糖，葡萄糖，乳糖和果糖。
7.根据权利要求4所述的制法，其特征在于，所述优化后的MRS培养基的配方包括如下试剂：蛋白胨5.0g，胰蛋白胨10.0g，牛肉膏5.0g，酵母粉5.0g，甘露糖5.0g，葡萄糖5.0g，乳糖5.0g，果糖5.0g，柠檬酸氢二铵2.6g，磷酸氢二钾2.0g，乙酸钠5.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，Tween-80 1mL；
优化后的MRS培养基的制备方法为：按照上述配方准确称取上述试剂定容于1000mL蒸馏水中，混匀后，pH调至5.8，121℃灭菌15min，4℃保存备用。
8.根据权利要求4所述的制法，其特征在于，步骤三中，离心工艺为10000r/min，4℃，10min。
9.根据权利要求4所述的制法，其特征在于，
接种液IF3的配方如下：0.40％氯化钠；0.03％聚醚F-68；0.02％结冷胶和余量的水；
接种液IF3的制备过程如下：加0.2g结冷胶至1L水中；煮沸并持续搅拌，直至结冷胶完全溶解；停止加热，继续搅拌；加4g氯化钠，搅拌至完全溶解；加0.3g聚醚F-68，搅拌至完全溶解；分装到20×150mm的试管中，每管装19～20mL；在121℃下灭菌30min。
10.根据权利要求2所述的具肠道粘附力的组合物在作为高脂饮食肠道屏障保护剂中的应用。
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