CN110283756A - 一种胶状溶杆菌发酵液的制备方法及应用 - Google Patents

一种胶状溶杆菌发酵液的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种胶状溶杆菌发酵液的制备方法及应用，将胶状溶杆菌接种到SDB培养基中，28℃～30℃恒温摇床内培养4天～5天，发酵液离心分离菌液和菌体，上清液在1～5℃保存备用，得到胶状溶杆菌的活性发酵液，胶状溶杆菌发酵液在制备毒杀南方根结线虫和秀丽隐杆线虫生物制剂中的应用，本发明具有制备方法简单，高效低毒的优点，发酵原液在24小时对秀丽隐杆线虫的致死率达到100％，在48小时对南方根结线虫的致死率也达到100％。

Description

一种胶状溶杆菌发酵液的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及一种胶状溶杆菌发酵液的制备方法及应用，属微生物生物农药 技术领域。
背景技术
植物病原线虫引起的病害是农业生产中的重要病害之一。长期以来，植物 病原线虫的防治主要依靠化学农药，其在保障农作物高产稳产中发挥了重要作 用；但由于化学农药高毒性，长期不合理使用以及过度依赖，造成农产品和环 境污染问题非常突出，部分化学杀线虫剂被禁用。因此，利用更加环保的资源 开发生物杀线虫剂的研究受到普遍关注。
发酵液是指将菌种接种与培养基培养一段时间的液体，细菌的发酵液具有 发酵周期短，容易制备，易处理等优点，一般是作为肥料使用。
胶状溶杆菌(Lysobacter gummosus)的发酵液在毒杀线虫活性中的应用， 经国内外文献检索，未见相关的公开报道。
发明内容
本发明提供一种胶状溶杆菌发酵液的制备方法，具体步骤如下：
在装有100～120mL SDB液体培养基的三角瓶中接种100～120μL胶状溶 杆菌(Lysobacter gummosus)，28℃～30℃恒温摇床内培养4天～5天，发酵液 离心分离菌液和菌体，吸取上清液放在1～5℃的冰箱中备用，得到胶状溶杆菌 (Lysobacter gummosus)的活性发酵液。
所述SDB培养基的制备方法：称取蛋白胨10.0～12.0g，葡萄糖15.0～ 20.0g，用去离子水溶解并定容至1L，调节pH到6.8～7.2，121℃灭菌20分钟， 得到SDB液体培养基。
所述离心分离是用高速离心机在8000～10000rpm下离心15～20min。
所述胶状溶杆菌(Lysobacter gummosus)已于2018年3月23日保藏在中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址：北京市朝阳区 北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏号：CGMCC No.15505。
本发明还提供胶状溶杆菌发酵液在制备毒杀南方根结线虫(Meloidogyneincognita)和秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)生物制剂中的应用，将 含有南方根结线虫(M.incognita)和秀丽隐杆线虫(C.elegans)的悬液分别 与胶状溶杆菌(Lysobacter gummosus)的活性发酵液混匀后，将培养皿室温放 置，在解剖镜下随机选择10个视野定时(12小时、24小时、48小时)进行观 察，计数死亡线虫数和总线虫数，每个测试样品设三个重复，并以未接种菌株 的空白SDB培养基为对照，得到测试样品对线虫的致死率，以致死率高低评 定样品对线虫的毒力。
本发明的有益效果：
本发明具有制备方法简单，高效低毒的优点，发酵原液在24小时对秀丽 隐杆线虫(C.elegans)的致死率达到100％，在48小时对南方根结线虫(M. incognita)的致死率也达到100％，能够在制备毒杀南方根结线虫(M.incognita) 和秀丽隐杆线虫(C.elegans)生物制剂中应用。
具体实施方式
下面用实施例来进一步详述本发明，但本发明的内容并不局限于此。
实施例1
一种胶状溶杆菌发酵液的制备方法，具体步骤如下：
(1)SDB培养基：称取蛋白胨10.0g，葡萄糖15.0g，用去离子水溶解并 定容至1L，用2mol/L的NaOH溶液将pH调节到6.8，121℃灭菌20分钟，得 到SDB液体培养基；
(2)在装有100mL SDB液体培养基的三角瓶中接种100μL胶状溶杆菌 (Lysobactergummosus)，胶状溶杆菌(Lysobacter gummosus)已于2018年3 月23日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地 址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏号： CGMCC No.15505，在28℃恒温摇床内180rpm条件下培养4天，发酵液用高 速离心机在8000rpm下离心20min菌液和菌体，吸取上清液放在1℃的冰箱中 备用，得到细菌胶状溶杆菌(Lysobacter gummosus)的活性发酵液。
取制备得到的上清细菌胶状溶杆菌(Lysobacter gummosus)的活性发酵 液作为测试样品，测定对秀丽隐杆线虫(C.elegans)的活性，具体方法是：
(1)燕麦培养基用于秀丽隐杆线虫(C.elegans)培养；燕麦片10.0g，水 10mL浸润燕麦片，120℃高温灭菌20min，接种线虫放置于28℃的培养箱中 培养7天后，置于4℃冰箱中保存备用，使用时用无菌水制成线虫悬液备用(每 毫升1000条左右秀丽隐杆线虫)；
(2)取4.5mL上清细菌胶状溶杆菌(Lysobacter gummosus)的活性发酵 液作为测试样品溶液、500μL约含有500条线虫的线虫悬液于直径为6cm的培 养皿中，轻轻混匀后将培养皿室温放置；在解剖镜下随机选择10个视野定时 (12小时、24小时、48小时)进行观察，计数死亡线虫数和总线虫数，并以 未接种胶状溶杆菌的SDB培养基为对照，检测其中线虫的毒杀结果。
每个测试样品设三个重复，并均以未接种菌株的空白SDB培养基为对照， 得到测试样品对线虫的致死率，以致死率高低评定样品对线虫的毒力。
测试结果见表1，表中数据为三次重复试验的平均值。
表1胶状溶杆菌发酵液对C.elegans线虫的毒杀结果(％)
结果表明：胶状溶杆菌(Lysobacter gummosus)发酵液对秀丽隐杆线虫(C.elegans)有极强的毒杀作用，发酵液在24小时对秀丽隐杆线虫(C.elegans) 的致死率达到100％，而未接种胶状溶杆菌的SDB培养基对照中的线虫死亡率 仅为2.38％，发酵液的杀虫效果远高于未接种胶状溶杆菌的SDB培养基。
实施例2
一种胶状溶杆菌发酵液的制备方法，具体步骤如下：
(1)SDB培养基：称取蛋白胨12.0g，葡萄糖15.0g，用去离子水溶解并 定容至1L，用2mol/L的NaOH溶液将pH调节到7.2，121℃灭菌20分钟，得 到SDB液体培养基；
(2)在装有120mL SDB液体培养基的三角瓶中接种120μL胶状溶杆菌 (Lysobactergummosus)，胶状溶杆菌(Lysobacter gummosus)已于2018年3 月23日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地 址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏号： CGMCC No.15505，在30℃恒温摇床内180rpm条件下培养5天，发酵液用高 速离心机在10000rpm下离心15min菌液和菌体，吸取上清液放在5℃的冰箱中备用，得到细菌胶状溶杆菌(Lysobacter gummosus)的活性发酵液。
取制备得到的上清细菌胶状溶杆菌(Lysobacter gummosus)的活性发酵 液作为测试样品，测定对南方根结线虫(M.incognita)的活性的影响，具体方 法是：
(1)番茄根系用于南方根结线虫(M.incognita)的制备：将已侵染发病 的番茄根部冲洗干净，用质量百分比浓度为1％NaClO消毒5分钟，用清水洗 3遍，再用一次性注射器针头挑取成熟卵块并将其置于200μm的筛网中，将筛 网置于盛有去离子水的9cm平板中，于28℃恒温培养箱中进行孵化，孵化后 的二龄幼虫(J2)储于4℃的冰箱中备用，使用时用无菌水制成线虫悬液备用 (每毫升1000条左右南方根结线虫)；
(2)取4.5mL上清细菌胶状溶杆菌(Lysobacter gummosus)的活性发酵 液作为测试样品溶液、500μL约含有500条线虫的线虫悬液于直径为6cm的培 养皿中，轻轻混匀后将培养皿室温放置；在解剖镜下随机选择10个视野定时 (12小时、24小时、48小时)进行观察，计数死亡线虫数和总线虫数，并以 未接种胶状溶杆菌的SDB培养基为对照，检测其中线虫的毒杀结果。
每个测试样品设三个重复，并均以未接种菌株的空白SDB培养基为对照， 得到测试样品对线虫的致死率，以致死率高低评定样品对线虫的毒力。
测试结果见表2，表中数据为三次重复试验的平均值。
表2胶状溶杆菌发酵液对南方根结线虫(M.incognita)的毒杀结果(％)
结果表明：胶状溶杆菌(Lysobacter gummosus)发酵液对南方根结线虫(M.incognita)有强的毒杀作用，发酵原液在48小时对南方根结线虫(M.incognita) 的致死率达到100％，而未接种胶状溶杆菌的SDB培养基对照中的线虫死亡率 仅为6.42％，发酵液的杀虫效果远高于未接种胶状溶杆菌的SDB培养基。
实施例3
一种胶状溶杆菌发酵液的制备方法，具体步骤如下：
(1)SDB培养基：称取蛋白胨11.0g，葡萄糖18.0g，用去离子水溶解并 定容至1L，用2mol/L的NaOH溶液将pH调节到7.1，121℃灭菌20分钟，得 到SDB液体培养基；
(2)在装有110mL SDB液体培养基的三角瓶中接种110μL胶状溶杆菌 (Lysobactergummosus)，胶状溶杆菌(Lysobacter gummosus)已于2018年3 月23日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地 址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏号： CGMCC No.15505，在29℃恒温摇床内180rpm条件下培养4天，发酵液用高 速离心机在9000rpm下离心18min菌液和菌体，吸取上清液放在1℃的冰箱中 备用，得到细菌胶状溶杆菌(Lysobacter gummosus)的活性发酵液。
取制备得到的上清细菌胶状溶杆菌(Lysobacter gummosus)的活性发酵液 作为测试样品，测定对南方根结线虫(M.incognita)的活性的影响，具体方法 见实施例2，每个测试样品设三个重复，并均以未接种菌株的空白SDB培养基 为对照，得到测试样品对线虫的致死率，以致死率高低评定样品对线虫的毒力。
测试结果见表3，表中数据为三次重复试验的平均值。
表3胶状溶杆菌发酵液对南方根结线虫(M.incognita)的毒杀结果(％)
结果表明：胶状溶杆菌(Lysobacter gummosus)发酵液对南方根结线虫(M.incognita)有强的毒杀作用，发酵原液在48小时对南方根结线虫(M.incognita) 的致死率达到100％，而未接种胶状溶杆菌的SDB培养基对照中的线虫死亡率 仅为6.05％，发酵液的杀虫效果远高于未接种胶状溶杆菌的SDB培养基。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节， 而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现 本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非 限制性的，本发明范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在 权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。此外，应当 理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个 技术方案，说明书这种叙述方式仅为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书 视为一个整体，各实施例中的技术方案也可以进行组合，形成本领域技术人员 其他可以理解的实施例。

Claims (5)

1.一种胶状溶杆菌发酵液的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
在装有100～120mL SDB液体培养基的三角瓶中接种100～120μL胶状溶杆菌，28℃～30℃恒温摇床内培养4天～5天，发酵液离心分离菌液和菌体，上清液在1～5℃保存备用，得到胶状溶杆菌的活性发酵液。
2.根据权利要求1所述胶状溶杆菌发酵液的制备方法，其特征在于，SDB培养基的制备方法：称取蛋白胨10.0～12.0g，葡萄糖15.0～20.0g，用去离子水溶解并定容至1L，调节pH到6.8～7.2，121℃灭菌20分钟，得到SDB液体培养基。
3.根据权利要求1所述胶状溶杆菌发酵液的制备方法，其特征在于，离心分离是在8000～10000rpm离心15～20min。
4.根据权利要求1所述胶状溶杆菌发酵液的制备方法，其特征在于，所述胶状溶杆菌已于2018年3月23日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏号：CGMCC No.15505。
5.权利要求1胶状溶杆菌发酵液在制备毒杀南方根结线虫和秀丽隐杆线虫生物制剂中的应用。
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