CN110835618B - 一种赤红球菌及其在降解烟碱类杀虫剂中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种红球菌及其在降解烟碱类杀虫剂中的应用，该红球菌经鉴定为赤红球菌Rhodococcusruber，菌株名为D188，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.17550，保藏日期为2019年4月10日。与现有农药降解技术相比，本发明的新菌株赤红球菌CGMCC17550，可有效地降解烟碱类杀虫剂，特别是烯啶虫胺，可用作农药降解菌剂，具有较好的应用前景。

Description

一种赤红球菌及其在降解烟碱类杀虫剂中的应用
技术领域
本发明属于微生物生物技术领域，具体涉及一种赤红球菌及其在降解烟碱类杀虫剂中的应用。
背景技术
烯啶虫胺又名吡虫胺，是继吡虫啉之后的第二代烟碱类杀虫剂。1989年由日本武田公司创制开发，是目前最新的烟碱类杀虫剂之一。烯啶虫胺对害虫具有神经阻断作用，其杀虫机理与传统的杀虫剂有所不同。拟除虫菊酯类杀虫剂作用于昆虫神经轴突，有机磷、氨基甲酸酯类阻碍乙酰胆碱酯酶，而烯啶虫胺作用于昆虫神经接合部后膜，通过与乙酰胆碱受体结合使昆虫异常兴奋，全身痉挛，麻痹而死。烯啶虫胺具有高效、低毒、内吸和无交互抗性四大优点，是防治同翅目及半翅目害虫的优良药剂，可广泛应用于粮谷、蔬菜、水果和茶树上防治各种稻飞虱、蚜虫、蓟马、自粉虱、烟粉虱、叶蝉、蓟马等刺吸式口器害虫，对传统杀虫剂已产生抗性的害虫有较好的烟碱类杀虫剂也是我国主要的杀虫剂品种之一。然而长期大量使用烟碱类杀虫剂对食品安全和生态环境产生了严重影响，如烯啶虫胺对传粉昆虫蜜蜂和鸟类毒性高，从而引发的生态链问题；烯啶虫胺和噻虫啉在谷物、蔬菜和茶叶中有残留，从而产生食品安全问题；80～98％的烟碱类杀虫剂最终进入到土壤环境中，导致污染土壤和地表水并对水生昆虫产生威胁。近几年来，烟碱类杀虫剂对环境生态的影响已引起了全球的广泛关注，其在环境中的归趋受到的高度重视。
微生物降解是烟碱类杀虫剂土壤代谢的主要途径之一，也是消除该类杀虫剂环境污染的最经济有效的方法之一。目前已报道的可降解烯啶虫胺的菌株仅有白腐菌Phanerochaetesordida YK-624一种，未见有赤红球菌降解烯啶虫胺的文献报道，也未见有赤红球菌降解噻虫啉的报道。
发明内容
本发明提供了一种赤红球菌及其在降解烟碱类杀虫剂中的应用。
本发明提供了一种红球菌，经分类学鉴定为赤红球菌(Rhodococcusruber)，菌株名为D188，保藏编号为：CGMCC No.17550。
所述赤红球菌的培养方法为：将所述赤红球菌CGMCCNo.17550接种于LB琼脂培养基上，于温度为30±1℃的培养箱中培养；或接种于LB液体培养基中，于30±1℃的摇床中振荡培养。
本发明还提供了所述的赤红球菌CGMCCNo.17550在降解烟碱类杀虫剂中的应用。
所述烟碱类杀虫剂为烯啶虫胺和噻虫啉。
应用方法为：将所述赤红球菌CGMCCNo.17550接种于含烯啶虫胺的的液体矿物盐培养基中振荡培养，赤红球菌CGMCCNo.17550在生长过程中降解烯啶虫胺。或将所述赤红球菌CGMCCNo.17550接种于液体LB培养基中，振荡培养后离心收集和洗涤菌体；将菌体悬浮于含烯啶虫胺或噻虫啉的磷酸盐缓冲溶液中，振荡培养，赤红球菌CGMCCNo.17550的静息细胞降解烯啶虫胺、噻虫啉。
与现有技术相比，本发明的新菌株赤红球菌CGMCCNo.17550，其静息细胞可有效降解烟碱类杀虫剂，特别是烯啶虫胺。因此该菌株可用作农药降解菌剂，具有很好的应用前景。
附图说明
图1为本发明赤红球菌CGMCC No.17550在LB固体培养基上的菌落形态。
图2为本发明赤红球菌CGMCC No.17550革兰氏染色后的显微形态。
图3为本发明赤红球菌CGMCC No.17550的静息细胞降解烯啶虫胺的HPLC图，其中：A图为静息细胞降解烯啶虫胺；B图为底物烯啶虫胺对照(未接种菌体)。
图4为本发明赤红球菌CGMCC No.17550的静息细胞降解噻虫啉的HPLC图，其中：A图为静息细胞降解噻虫啉；B图为噻虫啉底物对照(未接种菌体)。
本发明中D188菌株于2019年4月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；分类命名为赤红球菌Rhodococcusruber，保藏编号为CGMCC No.17550。
具体实施方式
结合下面的具体实施例详细阐述本发明赤红球菌CGMCCNo.17550及其应用。
实施例1：可降解烯啶虫胺微生物的分离纯化、筛选和鉴定
1、菌株分离
从江苏南通江山农药化工股份有限公司的用于处理烯啶虫胺生产中产生的废水的污水处理池中采集样本，取1ml水样稀释至10-3和10-4后，涂布于含有500mg/L烯啶虫胺的固体矿物盐培养基平板上。矿物盐培养基(MSM)的组成为(g/L)：KH2PO4 1.36，Na2HPO42.13，MgSO4·7H2O 0.5和10mL金属离子液，pH 7.0。金属离子液组成为(g/L)：CaCl2·2H2O0.40,H3BO3 0.30,CuSO4·5H2O 0.04,FeSO4·7H2O 0.20，MnSO4·7H2O 0.40,NaMoO4·2H2O0.20，KI0.10和10.0mL/L浓盐酸。待含烯啶虫胺的固体矿物盐培养基平板上长出单菌落后，挑取不同形态的菌落划线至新的烯啶虫胺矿物盐固体培养基，固体平板于30℃培养箱中培养3d，长出的单菌落在LB培养基平板上再次进行划线分离纯化。LB培养基的配方为(g/L)：酵母粉5，蛋白胨10，氯化钠10，水1000mL，pH 7.2±0.2。
2、筛选菌株降解烯啶虫胺能力的测定
取上述纯化的菌株划线于LB固体培养基上，于30℃培养箱中培养至长出单菌落。用无菌牙签挑选单菌落，接种于含20mL LB液体培养基的100mL锥形瓶中，30℃，220rpm下振荡培养48h，作为种子液。然后，按照1％的接种量，将其转接于含100mL LB液体培养基的500mL锥形瓶中，30℃，220rpm下振荡培养24h。菌液于4℃，8000rpm离心6min，收集菌体，随后用30mL磷酸盐缓冲液(pH7.0)洗涤两次，菌体沉淀重新悬浮于上述磷酸盐缓冲液(含100mg/L的烯啶虫胺)并调节OD600为5。取2mL上述静息细胞转化液于50mL的离心管中，用透气膜封口后，离心管置于30℃，220rpm摇床振荡培养96h。采用安捷伦1200型HPLC仪分析检测烯啶虫胺含量变化。HPLC条件：流动相为15％乙腈和85％去离子水(含0.01％乙酸)，流速为1mL/min；HPLC柱为安捷伦HC-C18反相柱(4.6×250mm，5μm)，柱温为30℃；检测波长为270nm。比较零时样品和96h样品中的烯啶虫胺的含量变化。
3、D188菌株的鉴定
对上述实验组中烯啶虫胺浓度有明显减少的菌株进行菌种鉴定，一是染色后采用光学显微镜观察菌体显微形态；二是提取菌株的基因组DNA，PCR扩增其16S rRNA基因，对扩增的基因序列进行blastn分析。在固体LB培养基平板上D188单菌落为桔黄色，圆形不透明，表面粗糙、干燥；细胞形态为球状或短杆状。D188菌落形态及结晶紫单染色的光学显微镜形状分别如附图1、2所示。提取基因组DNA和PCR扩增16S rRNA基因的方法如下：使用TakaRaMiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver 3.0基因组提取试剂盒，并采用Gram-negative Bacteria裂解提取基因组DNA。引物为16S rRNA基因PCR扩增通用引物K1和K2。K1引物序列为：5′-AACTGAAGAGTTTGATCC-3′(SEQ ID No：1)，K2引物序列为：5′-TAGGTTACCTTGTTGTTACGACTT-3′(SEQ ID No：2)。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。反应体系：10×LA buffer 2.0μL、MgCl2(25mmol/L)2.0μL、dNTP(2.5mmol/L)2.0μL、K1(50mmol/L)0.4μL、K2(50mmol/L)0.4μL、去离子水11.0μL、LA Taq酶(2U/μL)0.2μL、DNA模板2.0μL，共20μL总反应体积。PCR反应条件为：95℃预变性5min后，95℃变性50s，58℃退火40s，72℃延伸2min，共30个循环，然后72℃延伸10min。所得序列由生工生物工程有限公司测序后，得到的16S rRNA基因序列(SEQ ID No：3)在美国国家生物技术信息中心的Genbank数据库中进行核酸比对分析。比对结果显示，D188菌株与赤红球菌Rhodococcusruber的16SrRNA基因的相似性的概率达到100％。形态观察和16S rRNA基因序列分析结果表明，D188菌株为赤红球菌Rhodococcusruber。
实施例2：赤红球菌CGMCC17550的静息细胞降解烯啶虫胺
取-80℃保藏的赤红球菌CGMCC No.17550划线于LB固体培养基上，于30℃培养箱中培养24h至长出单菌落。用牙签挑选单菌落，接种于含20mL LB液体培养基的100mL锥形瓶中，30℃，220rpm下振荡培养16h，作为种子液。然后，按照1％的接种量，将其转接于含100mLLB液体培养基的500mL锥形瓶中，于30℃，220rpm下振荡培养48h，菌液于4℃，8000rpm离心6min，收集菌体，随后用30mL磷酸盐缓冲液(pH7.0)洗涤两次，菌体沉淀重新悬浮于上述磷酸盐缓冲液(含100mg/L的烯啶虫胺)并调节OD600为5。取2mL上述静息细胞转化液于50mL的离心管中，用透气膜封口后，离心管置于30℃，220rpm摇床振荡培养96h。采用安捷伦1200型HPLC仪分析检测烯啶虫胺含量变化。HPLC条件：流动相为15％乙腈和85％去离子水(含0.01％乙酸)，流速为1mL/min；HPLC柱为安捷伦HC-C18反相柱(4.6×250mm，5μm)，柱温为30℃；检测波长为270nm。结果(HPLC分析结果如图3A所示)显示，30h后烯啶虫胺减少87.0μmol/L，烯啶虫胺的降解率为26.0％，未接种菌体的底物对照(HPLC分析结果如图3B所示)未产生烯啶虫胺降解。上述结果表明赤红球菌CGMCC No.17550的静息细胞可降解烯啶虫胺。
实施例3：与实施例2基本相同，只是降解时间为72h，赤红球菌CGMCC No.17550的静息细胞降解烯啶虫胺的降解率为40.0％。
实施例4：赤红球菌CGMCCNo.17550的生长细胞降解烯啶虫胺
取-80℃保藏的赤红球菌CGMCC No.17550划线于LB固体培养基上，于30℃培养箱中培养24h至长出单菌落。用牙签挑选单菌落，接种于含20mLLB液体培养基的100mL锥形瓶中，30℃，220rpm下振荡培养16h，作为种子液。然后，按照1％的接种量，将其转接于含100mLMSM(含100mg/L的烯啶虫胺)液体培养基的500mL锥形瓶中，于30℃，220rpm下振荡培养48h，补水取样进行HPLC分析。结果表明接种赤红球菌CGMCC 17550烯啶虫胺浓度减少33.37μmol/L，赤红球菌CGMCC No.17550的生长细胞在34d可降解12.9％烯啶虫胺。
实施例5：葡萄糖促进赤红球菌CGMCC No.17550的生长细胞转化烯啶虫胺
与实例4的条件基本相同，只是在MSM培养液中添加2％葡萄糖作为碳源和能源，赤红球菌CGMCC 17550的生长细胞在24d可降解14.4％的烯啶虫胺。
实施例6:赤红球菌CGMCC No.17550的静息细胞降解噻虫啉
与实例2的条件基本相同，底物为噻虫啉，其浓度为250mg/L。HPLC条件中流动相为35％乙腈和65％的含0.01％乙酸的去离子水，检测波长为242nm，其他条件同烯啶虫胺HPLC条件。结果(HPLC分析结果如图4A所示)显示，未接种菌体的底物对照(HPLC分析结果如图图4B所示)未产生噻虫啉降解。上述结果表明赤红球菌CGMCCNo.17550的静息细胞可降解噻虫啉，72h的降解率为23.8％。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京国环环境研究院有限公司
南京师范大学
生态环境部南京环境科学研究所
<120> 一种赤红球菌及其在降解烟碱类杀虫剂中的应用
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（manual sequence）
<400> 1
aactgaagag tttgatcc 18
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（manual sequence）
<400> 2
taggttacct tgttgttacg actt 24
<210> 3
<211> 1421
<212> DNA
<213> 赤红球菌(Rhodococcusruber)
<400> 3
gggtaagcgg cagctataca tgcaagtcga acgggtggtc gcaagaccac tagtggcgca 60
cgggtgcgta acgcgtaacc aacctgcccc gatctggggg atagcccgcc gaaaggcgga 120
ttaataccgc atatacccgc agcctggcat caggcaacgg ggaaagattt attggatcgg 180
gatggggttg cgtgacatta gctagttggc ggggtaacgg cccaccaagg cgacgatgtc 240
taggggacct gagagggtga tcccccacac tggcactgag atacgggcca gactcctacg 300
ggaggcagca gtagggaata ttgggcaatg ggcgagagcc tgacccagcc atgccgcgtg 360
ccggatgaag gccttctggg ttgtaaacgg cttttctcag ggaagaaaaa gaccttgcga 420
ggtacactga cggtacctga ggaataagca ccggctaact ccgtgccagc agccgcggta 480
atacggaggg tgcaagcgtt gtccggattt attgggttta aagggtgcgt aggcggcttg 540
ttaagtccgg ggtgaaagcc cactgctcaa cagtggaact gccctggata ctggcaagct 600
tgagtccaga cgaggttggc ggaatggatg gtgtagcggt gaaatgcata gataccatcc 660
agaaccccga ttgcgaaggc agctgactag gctggtactg acgctgaggc acgaaagcgt 720
ggggagcgaa caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacgatgg atactcgctg 780
gtggcgatag acagtcactg gcttagggaa accggtaagt atcccacctg gggagtacgc 840
tcgcaagagt gaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca caagtggtgg agcatgtggt 900
ttaattcgat gatacgcgag gaaccttacc taggctagaa tgcgcgtgac cggctcagag 960
atgagccttt ccttcgggac acaaagcaag gtgctgcatg gccgtcgtca gctcgtgccg 1020
tgaggtgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccccta tgtttagttg ccatcaggtg 1080
atgctgggga ctctaaacag actgcctgcg caagcagtga ggaaggcggg gacgacgtca 1140
ggtcatcatg gcccttacgc ctagggctac acacgtgcta caatgggcgg tacagagggt 1200
cgctacctgg tgacaggatg ccaatctcaa aaaaccgttc tcagttcgga ttgaagtctg 1260
caactcgact tcatgaagct ggaatcacta gtaatcgcgt atcagccatg acgcggtgaa 1320
tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg tcaagccatg gaagtttggt agacctgaag 1380
ctggtgctcg tcacagaagc cagtaggtga gcaaatggcc t 1421

Claims (6)

1.一种赤红球菌(Rhodococcus ruber)，保藏编号为：CGMCC No.17550。
2.赤红球菌(Rhodococcus ruber)CGMCC No.17550的培养方法，其特征在于，将所述赤红球菌(Rhodococcus ruber)CGMCC No.17550接种于营养琼脂培养基上，于温度为30±1℃的培养箱中培养；或接种于LB液体培养基中，于温度为30±1℃的摇床中振荡培养。
3.权利要求1所述赤红球菌(Rhodococcus ruber)CGMCC No.17550在降解烟碱类杀虫剂中的应用。
4.根据权利要求3所述的赤红球菌在降解烟碱类杀虫剂中的应用，其特征在于，所述烟碱类杀虫剂为烯啶虫胺和噻虫啉。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，应用方法为：将所述赤红球菌(Rhodococcus ruber)CGMCC No.17550接种于含烟碱类杀虫剂的液体矿物盐培养基中振荡培养，赤红球菌(Rhodococcus ruber)CGMCC No.17550在生长过程中降解烟碱类杀虫剂。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，应用方法为：将所述赤红球菌(Rhodococcus ruber)CGMCC No.17550的菌体接种于液体LB培养基中，振荡培养后收集菌体细胞；将菌体细胞悬浮于含烟碱类杀虫剂的磷酸盐缓冲溶液中，振荡培养，赤红球菌(Rhodococcus ruber)CGMCC No.17550的静息细胞降解烟碱类杀虫剂。
CN201911181403.XA 2019-11-27 2019-11-27 一种赤红球菌及其在降解烟碱类杀虫剂中的应用 Active CN110835618B (zh)

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