CN114032197B - 一种Pseudocitrobacter faecalis B3-1及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及Pseudocitrobacter faecalis B3‑1及应用，可有效解决高效降解多环芳烃，用于修复多环芳烃污染环境的问题，一种Pseudocitrobacter faecalis B3‑1，分类命名为Pseudocitrobacter faecalis，2020年10月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC NO.20857，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。本发明菌株Pseudocitrobacter faecalis B3‑1，具有高效降解多环芳烃的功能，可有效用于对多环芳烃污染环境的修复，能够在酸性或碱性环境、重金属污染等逆境条件下高效降解多环芳烃，有效解决目前在有重金属双重污染作用下对多环芳烃降解的微生物修复，有效治理多环芳烃对生活环境的污染，利于人类生活和生命的健康，经济和社会效益巨大。

Description

一种Pseudocitrobacter faecalis B3-1及应用

技术领域

本发明涉及微生物，特别是一种Pseudocitrobacter faecalis B3-1及应用。

背景技术

多环芳烃（PAHs）是一种广泛存在于环境中的毒性有机化合物，很多PAHs会在生物体内积累，通过细胞毒性、遗传毒性和免疫毒性对生物体产生致癌、致畸、致突变作用，对自然界生物安全和人类健康构成巨大威胁。多环芳烃主要来源于生活中有机物的不完全燃烧（原油和煤炭）和各项的工业活动（化石燃料的提炼过程），近几年来由于城市化和工业化速度的不断加快，多环芳烃的污染形势更加严峻，而且多环芳烃具有易迁移、难降解和生物积累等特性，在生态系统中可以不断循环，因此，如何有效治理多环芳烃污染一直是世界各国所面临的重大环境问题。

在多环芳烃的污染土壤中，研究发现污染逐渐趋于复杂化和多元化，污染物多以复合污染的形式存在。重金属如铜（Cu）、镉（Cd）、铬（Cr）和铅（Pb）等是土壤中常见的无机污染物，常与与PAHs以复合污染的形式存在，是土壤中最典型的无机－有机型复合污染，已受到众多研究者的关注。在重金属中，镉是一种在土壤中移动性强、中毒浓度低和污染面积广的有毒重金属。众所周知的公害病“痛痛病”就是由于日本当地居民长期食用“镉米”和饮用含Cd的水而引起的疾病。2014年我国原环境保护部和原国土资源部公布的《全国土壤污染状况调查公报》指出，全国土壤总超标率为16.1%，污染类型以无机型为主，其中我国农田镉污染点位超标率高达7.0%，在农田重金属污染种类中排位第一，超标率为无机污染物之首。

在重金属和PAHs复合污染中，重金属和PAHs之间的相互作用往往会改变其自身的物理化学性质、迁移转化规律甚至生物毒性这使得复合污染的协同治理难度通常高于单一污染物，进而造成更大的环境威胁。生物修复作为重金属和多环芳烃单一污染的重要修复手段，在二者复合污染的PAHs修复中也同样因其成本低、无二次污染等优势被人们所重视，其中微生物的转化和降解一直被认为比较有效的去除和降解多环芳烃的实用方法。研究发现在微生物修复复合污染PAHs的过程中，由于重金属的毒性，微生物对复合污染中PAHs的去除和降解效果被减弱，有些微生物甚至不具备降解能力。

因此针对现有研究的缺陷，筛选出复合污染条件下能够高效降解多环芳烃的菌株尤为重要，但至今未见有真正有效用于高效降解多环芳烃的菌株，用于修复多环芳烃污染环境的公开报导。

发明内容

针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种Pseudocitrobacter faecalis B3-1及应用，可有效解决高效降解多环芳烃，用于修复多环芳烃污染环境的问题。

本发明解决的技术方案是，一种Pseudocitrobacter faecalis B3-1，分类命名为Pseudocitrobacter faecalis，2020年10月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC NO.20857，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

该菌株Pseudocitrobacter faecalis B3-1具有降解多环芳烃之功能，实现在修复多环芳烃污染环境中的应用。

本发明菌株新筛选出的一株Pseudocitrobacter faecalis B3-1，具有高效降解多环芳烃的功能，可有效用于对多环芳烃污染环境的修复，能够在酸性或碱性环境、重金属污染等逆境条件下高效降解多环芳烃，有效解决目前在有重金属双重污染作用下对多环芳烃降解的微生物修复，有效治理多环芳烃对生活环境的污染，利于人类生活和生命的健康，经济和社会效益巨大。

具体实施方式

以下结合具体情况对本发明的具体实施方式作详细说明。

本发明一种Pseudocitrobacter faecalis B3-1，是从河南省南阳市油田污染土壤筛选得到，分类命名为Pseudocitrobacter faecalis，2020年10月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC NO.20857，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；

该菌株Pseudocitrobacter faecalis B3-1具有降解多环芳烃之功能，实现在修复多环芳烃与重金属污染环境中的应用，所述的污染环境为酸性或碱性环境，pH4.0-11.0，重金属为Cd²⁺，Cd²⁺浓度为20-40 mg L^-1，多环芳烃为芘，浓度50 mg L^-1。

最适宜的污染环境为pH5.0-8.0酸性或碱性环境。

该菌株经试验，能够在酸性或碱性环境、重金属污染等逆境条件下高效降解多环芳烃，并经试验取得了非常好的有益技术效果，有关资料如下：

一、菌株的筛选与鉴定

1、初筛

采取河南省南阳市油田污染土壤，土壤样品过2 mm筛子，准确称取10.00 g，加入50 mLM9液体培养基中，放入摇床25℃、180rpm培养24 h，取5 mL上层培养液转接于45 mLM9液体培养基中，该培养基中含有浓度为250 mgL^-1菲和芘，当看见微生物增长明显时，再次取5 mL培养液转接到含有菲和芘新鲜的M9液体培养基中，经过几次的转接培养后梯度稀释，取0.1mL梯度稀释的培养液涂布M9固体培养基上，M9固体培养基含有100 mgL^-1菲和芘，放置37℃培养箱培养。待长出菌落后挑取培养基上的细菌平板划线得出细菌单菌落。通过多次的富集培养和分离纯化，从污染土壤中共筛选出14株细菌，这些细菌都能够在以菲和芘为唯一碳源时进行生长。

所述的M9液体培养基(1L)：Na₂HPO₄ 6g，KH₂PO₄ 3g，NaCl 0.5g，NH₄Cl 1g，加入2.5mL营养液，pH7.2-7.4，加蒸馏水至1L，混匀制成；营养液组成(L)：MgCl₂ 10.75g，CaCO₃2.0g，FeSO₄ 4.5g，ZnSO₄ 1.44g，MnSO₄ 1.12g，CuSO₄ 0.25g，CoSO₄ 0.24g，H₃BO₄ 0.06g，HCl51.3mL，加蒸馏水至1L，混匀制成；M9固体培养基加入1.5%琼脂粉；菲和芘用正己烷配置成母液，用0.22µm有机滤膜过滤灭菌后加入灭好菌的M9培养基中作为唯一碳源。

2、复筛

金属离子分析：考察金属离子Cd²⁺对菌株生长的影响，分别用去离子水配置1g L^-1Cd²⁺母液。挑取上述筛选出的14株单菌落接种于OMM固体培养基中，在培养基中加入0.5%葡萄糖作为唯一碳源，加入金属离子Cd²⁺，使其终浓度均为为40 mg L^-1，放置培养箱培养1-3d，观察菌株的生长情况。

pH分析：考察酸性和碱性环境对菌株生长的影响，用过滤灭菌的HCl或NaOH将M9固体培养基的pH调至5.0-11，观察菌株的生长情况。

经上述复筛最终得到即耐金属离子Cd²⁺又能在pH5.0-11条件下生长的菌株1株，将其命名为B3-1。

OMM固体培养基(1L)：KH₂PO₄ 0.1g，HNa₂PO₄ 0.1g，NH₄NO₃ 0.5g，NH₄SO₄ 0.5g，MgSO₄0.2g，CaCl₂ 0.02g，FeCl₂ 0.002g，MnSO₄ 0.002g，琼脂15-20g，pH6.5。

3、菌株鉴定

通过菌落形态和分子生物学16sDNA对菌株B3-1进行鉴定；

挑取单菌落接种于LB培养基中，37℃、180rpm培养24h，用菌液直接进行PCR扩增。用于PCR扩增反应的引物序列：前引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'），后引物1492R（5'-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3'）。

PCR扩增程序：95℃预变性10min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环。PCR反应产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，检测后送华大基因公司进行测序分析。将测序结果在Genbank中用Blast进行同源性比较。

通过将菌株B3-1的16S rRNA序列与Genbank中已知序列比对分析所分离的菌株为Pseudocitrobacter faecalis，分类命名为Pseudocitrobacter faecalis，2020年10月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC NO.20857，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

二、菌株活性功能试验

试验1、Pseudocitrobacter faecalis B3-1在复合污染条件下对多环芳烃芘的降解试验

菌液的制备：从M9固体培养基中挑取菌株B3-1，接种于M9液体培养基中，180rpm，37℃，摇床培养16-24h，之后离心弃上清，加入新鲜灭菌含有0.5%葡萄糖的M9液体培养基使菌株的OD600为1.0备用。同时该M9液体培养基中加入金属离子Cd²⁺使其终浓度分别为40mgL^-1，pH分别为5.0、6.0和8.0。

用正己烷配备芘标品浓度为150mg L^-1，在棕色玻璃瓶中加入1mL芘标品溶液，待正己烷完全挥发后，取OD600nm=1.0的3mL细胞菌液加入棕色玻璃瓶中，对照样为在吸附芘的玻璃瓶中加入3mL相同浓度的热杀菌，置于25℃，180rmp的恒温摇床中进行降解实验。每批样品3组平行样。降解率％=(对照样浓度-降解样浓度)/对照样浓度×100%。

液相样品预处理方法：萃取相用色谱级的正己烷，每样品中加入3mL正己烷萃取，旋涡震荡10min，摇床震荡20min，静置待样品分层稳定后，取上层有机相加入一定量无水硫酸钠分析。

HPLC分析：采用安捷伦LC-1200型高效液相色谱仪测定PAHs含量。样品注入量为20µL，分离柱为ZORBAX SB-C18 column(0.46×150mm，安捷伦)，柱温30℃，紫外检测波长254nm，流动相为乙腈和水(体积比为80%∶20%)，流速1.0mL min^-1。

结果表明，经过5天后液相检测，三种pH条件下菌株对芘的降解率为70%以上。

试验2、Pseudocitrobacter faecalis B3-1在复合污染土壤中对多环芳烃芘的降解试验

污染土壤的制备：取新乡县农田中不含多环芳烃的土样，自然风干，然后土壤过筛子（2mm）去除土壤中的石头和植物碎片。土壤pH值为7.6，土壤中的有机质(OM)、碱解氮、速效钾和速效磷含量分别为是24.1g/kg，91mg/kg，57.04 mg/kg和30.07mg/kg，取5g土样添加到棕色玻璃小瓶，121℃灭菌20min。灭菌土壤样本中加入芘溶液使其终浓度为50mg/kg。其中芘溶液为1g/L的丙酮溶液，然后将土壤样品放置通风橱48h使丙酮自然挥发。丙酮挥发后加入无菌的50g/LCd²⁺水溶液，使其终浓度为40mgL^-1。最后，污染土壤于25℃平衡至少2周。

菌液的制备：从M9固体培养基中挑取菌株B3-1，接种于LB液体培养基中，180rpm，37℃，摇床培养16-24h备用。

将菌液按照15%的接种量接种于污染土壤中，对照为不含菌株的发酵基质，将接种的污染土样放置37℃培养箱中，所有处理反应过程中均通过添加灭菌蒸馏水以维持土壤含水率达60%，15天后检测。每个处理3个重复。

土壤样品预处理方法：萃取相用色谱级的正己烷，每样品中加入10mL正己烷萃取，旋涡震荡15min，静置待样品分层稳定后，取上层有机相加入一定量无水硫酸钠分析。

HPLC分析：采用安捷伦LC-1200型高效液相色谱仪测定PAHs含量。样品注入量为20µL，分离柱为ZORBAX SB-C18 column(0.46×150mm，安捷伦)，柱温30℃，紫外检测波长254nm，流动相为乙腈和水(体积比为80%: 20%)，流速1.0mL min^-1。

结果表明，经过15天后液相检测，菌株对芘的降解率为20%左右。

本发明菌株经多次反复实验，均取得了与上述实验相同或相近似的效果，表明本发明微生物能在重金属Cd²⁺存在以及酸碱条件下能够有效去除多环芳烃芘。预示着该菌株在重金属和多环芳烃复合污染条件下具有潜在的生物修复应用价值。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：本发明提供的菌株Pseudocitrobacter faecalis B3-1在酸性或碱性环境条件下能够高效降解重金属和多环芳烃复合污染中的多环芳烃芘，其中重金属为Cd²⁺，其浓度分别为20～40mg L^-1，芘的初始浓度为50mg L^-1，在pH5.0-8.0条件下，多环芳烃芘的降解率高达70%以上。菌株在灭菌复合污染土壤中15天后芘的降解率为20%左右。可有效用于对多环芳烃污染环境的修复，有效解决目前在有重金属双重污染作用下对多环芳烃降解的微生物修复，有效治理多环芳烃对生活环境的污染，利于人类生活和生命的健康，经济和社会效益巨大。

序列表

<110> 河南省科学院生物研究所有限责任公司

<120> 一种Pseudocitrobacter faecalis B3-1及应用

<130> 2021

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1162

<212> DNA

<213> Pseudocitrobacter faecalis

<400> 1

ggcaagatcc tcgtggttag cgccctcccg aaggttaagc tacctacttc ttttgcaacc 60

cactcccatg gtgtgacggg cggtgtgtac aaggcccggg aacgtattca ccgtagaatt 120

ctgatctacg attactagcg attccgactt catggagtcg agttgcagac tccaatccgg 180

actacgacat actttatgaa accgcttgct ctcgcgaggt cgcttctctt tgtatatgcc 240

attgtagcac gtgtgtagcc ctggtcgtaa gggccatgat gacttgacgt catccccacc 300

ttcctccagt ttatcactgg cagtctcctt tgagttcccg gcctaaccgg tggcaacaaa 360

agataaaggt tgcgctcgtt gcgggactta acccaacatt tcacaacacg aactgaacac 420

cgccatgcaa cacctggctc acagttcccg aaaggaccaa tccatctctg gaaagttctg 480

tgaatggcaa gaccaagtaa gggtcttccc gttgcatcca attaaaccac atggtccacc 540

gcttgggcgg gcccccgtca attcatttga attttaacct tgccgccgta ctccccaagc 600

ggtcgaatta acgcgttagc tcccgaagcc acgactcaag ggctcaacct ccatatcgac 660

atcgtttacc gcgtggacta cccaggtatc taatcctggt tgctccccac gctttcgcac 720

ctgagcgtca gtctttgtcc agggggccgc cttcgccacc tgtagtcctt cacatctcta 780

cgcatttcac cgctacacct ggaaatctac ccccctctac aagactctaa cctgccagtt 840

tctaatgccg ttcccaaggt gagaccccgg gatttcacat tcgacttgac cgacgcctgc 900

gtgcgcttta cgcccagtaa ttccgaataa cgcttgcacc cctctcgatt accgcggctg 960

cttgcaagag ttagccggtg cttcattctg cgtgttacgt catagacaaa ggtttaacta 1020

ctgcttcctc ccgactgaag tgcttacacc gagacttctt caccacgccg catgctcatc 1080

agctgcccat tgcaattcca tgctgctccg tagacttgaa cgttcagtca gagtggatga 1140

ctcctctcga acggtacgat ct 1162

Claims (4)

1.一种粪产假柠檬酸杆菌（Pseudocitrobacter faecalis）B3-1，从河南省南阳市油田污染土壤筛选得到，分类命名为Pseudocitrobacter faecalis，2020年10月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC NO.20857，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

2.权利要求1所述的粪产假柠檬酸杆菌B3-1菌株在降解芘中的应用。

3.权利要求1所述的粪产假柠檬酸杆菌B3-1菌株在修复芘与重金属污染环境中的应用，所述的污染环境为酸性或碱性环境，pH4.0-11.0，重金属为Cd²⁺，Cd²⁺浓度为20-40 mg L^-1，芘浓度50mg L^-1。

4.根据权利要求3所述的粪产假柠檬酸杆菌B3-1菌株在修复芘与重金属污染环境中的应用，所述的污染环境为pH5.0-8.0酸性或碱性环境。