CN116716217A - 一株蒙氏假单胞菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株蒙氏假单胞菌及其应用，涉及微生物技术领域。该蒙氏假单胞菌命名为蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)XC‑1，保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心，保藏单位：2023年1月9日，保藏编号：GDMCC No:63127。蒙氏假单胞菌XC‑1对不同环境具有良好适应性，可以耐受5～9的酸碱度、15℃～35℃的温度范围、0.4％～5％的盐度，能够降解菲、咔唑、蒽和芘等多种PAHs，具有很好的应用前景。

Description

一株蒙氏假单胞菌及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其是涉及一株蒙氏假单胞菌及其应用。
背景技术
多环芳烃(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，PAHs)是一类由两个或多个苯环组成的芳族化合物，具有熔点高、沸点高、溶解性低和疏水性强的理化特征。PAHs进入环境后，易于吸附在固体表面，使得微生物难以接近；同时，由于PAHs结构稳定，自然降解率低，使其在环境介质中长期存在。PAHs可通过呼吸道、皮肤和消化道进入人体，具有“三致”效应(致畸性、致癌性和致突变性)。近年，煤炭和石油等化石燃料的不然完全燃烧，以及原油开采、运输和生产过程中的泄露、排污等，导致PAHs的环境排放量激增，环境PAHs正在影响着人类及整个生态系统的安全。
为管控PAHs的环境污染问题，须对受PAHs污染的环境介质实施修复。早期采用热脱附、溶剂提取和电化学修复等物理化学修复技术，此类技术修复效果好，但成本投入较高且易引起二次污染。近年来，PAHs生物修复技术，因具有环境友好、成本可控、可再生利用等优势，日益受到重视。PAHs的生物修复效果，主要受降解菌株性能的影响。因此，筛选出PAHs高效降解菌株，是进行PAHs污染生物修复的关键。在受PAHs污染的介质中，常有多种PAHs同时存在，这增加了生物修复的难度。
因此，提供一种能够高效降解PAHs的菌株非常重要。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一株蒙氏假单胞菌，能够有效降解多环芳烃。
本发明还提供一种菌剂。
本发明还提供一种用于降解多环芳烃的产品。
本发明还提供上述蒙氏假单胞菌或菌剂或产品在降解多环芳烃中的应用。
本发明还提供一种降解多环芳烃的方法。
根据本发明的第一方面实施例的一株蒙氏假单胞菌，命名为蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)XC-1，保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心，地址：广东省广州市越秀区先烈中路100号，保藏时间：2023年1月9日，保藏编号：GDMCC No:63127。
根据本发明实施例的蒙氏假单胞菌，至少具有如下有益效果：
实施例的蒙氏假单胞菌XC-1对不同环境具有良好适应性，可以耐受5～9的酸碱度、15℃～35℃的温度范围、0.4％～5％的盐度，能够降解菲、咔唑、蒽和芘等多种PAHs，具有很好的应用前景。并且，高温、高盐度、偏酸、偏碱环境能够显著促进蒙氏假单胞菌XC-1对PAHs的降解，还对吐温80具有很好的耐受性。
根据本发明的第二方面实施例的一种菌剂，所述菌剂含有上述蒙氏假单胞菌XC-1。由于菌剂采用了上述实施例的蒙氏假单胞菌XC-1菌体的全部技术方案，因此至少具有上述实施例的技术方案所带来的所有有益效果。
根据本发明的一些实施例，所述菌剂还包括表面活性剂。
根据本发明的一些实施例，所述表面活性剂包括吐温80。
根据本发明的一些实施例，所述菌剂含有蒙氏假单胞菌XC-1菌体的活细胞、冷冻干燥得到的干菌体、固定化的细胞、液体菌剂、固体菌剂，或以其他任何形式存在的蒙氏假单胞菌XC-1菌株。
根据本发明的一些实施例，所述菌剂还含有其他细菌或真菌。
根据本发明的一些实施例，所述菌剂的活性成分包括上述蒙氏假单胞菌XC-1。
根据本发明的一些实施例，所述菌剂还可以包括载体、表面活性剂、稳定剂和pH调节剂中的至少一种。
根据本发明的一些实施例，所述菌剂的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。
根据本发明的第三方面实施例的一种用于降解多环芳烃的产品，包括上述蒙氏假单胞菌XC-1或上述菌剂。由于产品采用了上述实施例的蒙氏假单胞菌XC-1菌体的全部技术方案，因此至少具有上述实施例的技术方案所带来的所有有益效果。
根据本发明的一些实施例，所述多环芳烃包括菲、咔唑、蒽和芘中的至少一种。
根据本发明的第四方面实施例的A1)至A3)中任一种在降解多环芳烃中的应用，
A1)第一方面实施例中所述的蒙氏假单胞菌XC-1；
A2)第二方面实施例中所述的菌剂；
A3)第三方面实施例中所述的产品。
根据本发明的一些实施例，所述多环芳烃包括菲、咔唑、蒽和芘中的至少一种。
根据本发明的第五方面实施例的一种降解多环芳烃的方法，包括以下步骤：
用A1)至A3)中任一种接触多环芳烃；
A1)第一方面实施例中所述的蒙氏假单胞菌XC-1；
A2)第二方面实施例中所述的菌剂；
A3)第三方面实施例中所述的产品。由于方法采用了上述实施例的蒙氏假单胞菌XC-1菌体的全部技术方案，因此至少具有上述实施例的技术方案所带来的所有有益效果。
根据本发明的一些实施例，所述降解中的温度条件为15℃～35℃。进一步可以为20℃～35℃。更进一步可以为30℃～35℃。
根据本发明的一些实施例，所述降解中的盐度条件为0.5％～5％。
根据本发明的一些实施例，所述降解中的pH条件为5～9。
根据本发明的一些实施例，所述降解中还包括表面活性剂。
根据本发明的一些实施例，所述表面活性剂的含量为0.5％以上。进一步可以为0.5％～6％。
根据本发明的一些实施例，所述表面活性剂为吐温80。
根据本发明的一些实施例，所述接触具体可以为：将上述蒙氏假单胞菌XC-1或上述菌剂或上述产品接种至含多环芳烃的水体或土壤中。
根据本发明的一些实施例，接触过程中，含蒙氏假单胞菌XC-1的菌悬液的接种量为1％～20％(V/V)。所述菌悬液的OD600nm为0.75～1.25。所述菌悬液的OD600nm约为1。
根据本发明的一些实施例，所述水体中，菲浓度为5mg/L～120mg/L。优选为10mg/L～40mg/L。
根据本发明的一些实施例，降解时间为3～20天。优选为3～15天。
本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。
附图说明
图1为Pseudomonas monteilii XC-1的菌落形态图(A)和革兰氏染色结果(B)；
图2为Pseudomonas monteilii XC-1的SEM图(比例尺为5μm)；
图3为基于Pseudomonas monteilii XC-1和相关菌株的16S rDNA序列建立的系统发育树；
图4为Pseudomonas monteilii XC-1在不同pH(A)、不同温度(B)和不同盐度(C)下的生长状况；
图5为Pseudomonas monteilii XC-1在以菲为唯一碳源的MSM培养基中的生长曲线；
图6为Pseudomonas monteilii XC-1对菲的降解曲线；
图7为Pseudomonas monteilii XC-1利用不同浓度的菲形成生物膜的检测结果；
图8为Pseudomonas monteilii XC-1利用不同PAHs形成生物膜的检测结果(A)及其降解效率(B)；
图9为Pseudomonas monteilii XC-1在不同浓度吐温80下的生长状况；
图10为Pseudomonas monteilii XC-1在不同浓度吐温80下对菲的降解率；
图11为1.0g/L吐温80存在下，Pseudomonas monteilii XC-1对不同浓度的菲的去除率；
图12为Pseudomonas monteilii XC-1在不同环境条件下对菲的去除率。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
在本发明的描述中，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
实施例1(菌株的分离筛选及鉴定)
1、菌株的筛选分离
(1)从深圳市某市政污水处理厂采集活性污泥，用人工废水(葡萄糖500mg/L，酵母提取物100mg/L，(NH4)2SO4 236mg/L，MgSO4·7H2O 22.5mg/L，NH4Cl 1.7mg/L，CaCl2·2H2O27.5mg/L，FeCl3·6H2O 0.25mg/L，NaHCO3 840mg/L，K2HPO4·12H2O 21.75mg/L，KH2PO48.5mg/L，Na2HPO4·12H2O 44.6mg/L)对活性污泥稳定化培养7天。
(2)分别配制菲、芘和苯并[a]芘的浓缩液(溶剂为乙腈)，将3种PAHs浓缩液加至摇瓶，待溶剂挥发后，加入基础盐培养基(MSM培养基，NaHPO4 2800mg/L，KH2PO4 1000mg/L，(NH4)2PO4 500mg/L，MgCl2 53mg/L，Ca(NO3)2 50mg/L，EDTA-2Na 0.5mg/L，FeSO4·7H2O0.2mg/L，ZnSO4 0.01mg/L，MnCl2 0.003mg/L，H3BO3 0.03mg/L，CoCl2 0.02mg/L，CuCl2·2H2O0.001mg/L，NiCl2·6H2O 0.001mg/L，NaMoO4·2H2O 0.003mg/L)，得到以PAHs为碳源的MSM培养基(含100mg/L菲、100mg/L芘和50mg/L苯并[a]芘)。将稳定化培养后的活性污泥以10％的体积比接种至以PAHs为碳源的MSM培养基中，摇瓶培养7天后，将污泥按10％的体积比转接至新鲜的以PAHs为碳源的MSM培养基中，继续培养7天后，再次转接，共重复转接三次。富集PAHs降解菌株。
(3)将富集得到的污泥用无菌水稀释并涂布至含PAHs的MSM培养基琼脂平板(含100mg/L菲、100mg/L芘和50mg/L苯并[a]芘)，置于30℃培养箱中培养3天；用无菌针随机挑取平板单菌落48个，分别接种于两个24孔板，每孔含2mL相同PAHs浓度(含100mg/L菲、100mg/L芘和50mg/L苯并[a]芘)的MSM培养基。将24孔板置于恒温培养箱30℃培养7天后，将悬浮菌液转移至96孔板，利用酶标仪分析OD600nm，选取长势最好的5孔，再次将所得菌液涂布至含PAHs的MSM培养基琼脂平板(含100mg/L菲、100mg/L芘和50mg/L苯并[a]芘)，获得可降解PAHs的纯菌。分别挑取所得5株纯菌单菌落至含PAHs的MSM培养基(含100mg/L菲、100mg/L芘和50mg/L苯并[a]芘)中培养7天，测定OD600nm，选择OD600nm最高的菌株(记为：XC-1)。将该菌株的菌液涂布至LB培养基(胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，酵母提取物5g/L，pH7.0)琼脂平板上，形成单菌落后于4℃冰箱保存用于后续研究。
2、菌株的鉴定
(1)形态学特征鉴定
1)平板菌落：挑取XC-1的单菌落于LB培养基中隔夜培养，用灭菌生理盐水清洗菌体两遍后，用等体积灭菌生理盐水重悬菌体，用接种棒蘸取菌液来回划线分离纯菌，于30℃培养24h后观察菌落生长状态。
2)革兰氏染色：取20μL的XC-1菌液至干净载玻片上，用酒精灯外焰缓慢干燥和固定菌液后，滴加结晶紫染色2min，洗净后滴加碘液(碘化钾1.0g、碘0.5g溶于150mL蒸馏水)染色2min，洗净后再滴加95％酒精脱色10s，最后滴加番红(2.5％(w/v)番红乙醇溶液与蒸馏水按体积比1：4混合)复染1min后冲洗，置于显微镜下观察。
3)扫描电镜：取1mL菌液去掉上清，加入1mL 2.5％戊二醛溶液重悬菌液，置于4℃冰箱固定过夜。用无菌水清洗菌液3遍后重悬于1mL无菌水中，吸取50μL至盖玻片，自然晾干后依次用浓度为50％、70％、80％、90％、95％的乙醇水溶液和无水乙醇进行梯度脱水20min，再用冷冻干燥机中干燥48h。将样品置于磁控溅射仪中喷金后，用扫描电镜观察。
形态学特征鉴定结果如图1和图2所示。
形态学特征鉴定结果显示，XC-1的菌落为乳白色的圆形凸起，边缘清晰且较湿润；经革兰氏染色后菌体为红色，XC-1为革兰氏阴性菌；XC-1菌体大小约为0.5μm×2.0μm，呈直且两端顿圆的杆状。
(2)分子生物学鉴定
按照Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒的说明书，提取XC-1的基因组DNA；验证纯度后，以通用扩增引物7F(5’-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’)及1540R(5’-AGGAGGTGATCCAGCCGCA3’)对XC-1的基因组DNA进行PCR扩增。将PCR所得的扩增片段进行凝胶电泳，并切割、纯化回收大小为1500bp左右的条带，将回收产物装入离心管中保存，委托上海生工生物工程有限公司进行16S rDNA序列的测定。
测序结果如下：
>XC-1(5’→3’)
AGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGATGACGGGAGCTTGCTCCTTGATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGACAACGTTTCGAAAGGAACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTAAGTTAATACCTTGCTGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTTGTTAAGTTGGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGGCAAGCTAGAGTACGGTAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCTCCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGAATCCTTGAGATTTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGCCTTGACATGCAGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCTGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACGTTATGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAGAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGCGGAGCTAATCTCACAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGAATCAGAATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCACCAGAAGTAGCTAGTCTAACCTTCGGGAGGACGGTTACCACGGTGTGATTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAA。
将测得的XC-1菌株的16S rDNA序列输入GenBank数据库，通过局部对比搜索工具BLAST将XC-1菌株的16S rDNA序列与已知的16S rDNA序列进行同源性比对，并用邻接法(N-J法)构建系统进化树。
构建得到的进化树如图3所示。
综合形态学特征鉴定结果和分子生物学鉴定结果，XC-1菌体为直且两端钝圆的杆菌，属革兰氏阴性菌；XC-1菌株与Pseudomonas monteilii菌株序列相似度达99.93％，将该菌命名为Pseudomonas monteilii XC-1。
蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)XC-1已于2023年1月9日在广东省微生物菌种保藏中心保藏，地址：广东省广州市越秀区先烈中路100号，保藏编号：GDMCC No:63127。
实施例2(Pseudomonas monteilii XC-1的生长条件)
挑取Pseudomonas monteilii XC-1的单菌落于LB培养基中隔夜培养，将菌液于4000rpm离心15min后弃上清，用新鲜LB培养基(pH7.0)调节OD600nm至1.0，得到Pseudomonas monteilii XC-1菌液，以用于后续实验。
(1)最适生长pH
配制初始pH约为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0的LB培养基(用0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲体系调节pH4.0～5.0；用0.1mol/LKH2PO4和NaOH调节pH6.0～8.0；用0.1mol/L HCl和NaHCO3调节pH9.0～11.0)，灭菌备用。向96孔板分别加入200μL上述不同pH的LB培养基和4μL Pseudomonas monteilii XC-1菌液(OD600nm＝1.0)。每个pH条件三个重复，用酶标仪连续24h测定OD600nm数值，绘制Pseudomonas monteilii XC-1在不同初始pH(30℃)培养条件下的生长曲线，以确定最适生长pH。
(2)最适生长温度
向50mL的灭菌离心管中，加入10mL LB培养基(pH7.0)和100μL Pseudomonasmonteilii XC-1菌液(OD600nm＝1.0)，分别置于15℃、20℃、25℃、30℃、35℃和40℃摇床(转速200rpm)中培养24h后，取样200μL菌液至96孔板测定OD600nm，以确定最适生长温度。每个温度条件三个重复。
(3)最适生长盐度
向LB培养基(原含1.0％ NaCl)中继续加入NaCl，配置盐度(NaCl浓度)分别为2％、3％、4％、5％、6％、7％和8％的LB培养基。在96孔板中依次加入200μL上述不同盐度的LB培养基和4μL Pseudomonas monteilii XC-1菌液(OD600nm＝1.0)。每个盐度条件三个重复，用酶标仪连续24h测定OD600nm数值，获取Pseudomonas monteilii XC-1在不同盐度培养条件下(30℃，pH7.0)的生长曲线，以确定最适生长盐度。
测试结果如图4所示。
Pseudomonas monteilii XC-1在较为宽泛的pH(6～9)，温度(15℃～35℃)和盐度(1％～5％)条件下均能维持良好长势。这表明Pseudomonas monteilii XC-1对不同环境条件均有良好适应性，具备应用于环境修复的潜力。
实施例3(Pseudomonas monteilii XC-1对菲的降解作用)
(1)将隔夜培养的Pseudomonas monteilii XC-1菌液于4000rpm离心10min，去上清，用MSM培养基(pH7.0)清洗两次后重悬菌液，调菌液OD600nm＝1.0，得到XC-1重悬菌液；取3个50mL无菌离心管，向其中加入菲浓缩液(终浓度为100mg/L)，在超净台中待溶剂完全挥干后，加入5mL MSM培养基，并加入50μL XC-1重悬菌液，设置不加菲的实验组作为空白对照，混匀后放入30℃，200rpm恒温摇床培养，每24h取样分析菌液OD600nm数值。
结果如图5所示。
在以菲为唯一碳源的MSM培养基中，Pseudomonas monteilii XC-菌株在2天内即可完成大量增殖，且在较长时间内能保持菌量。这表明Pseudomonas monteilii XC-1可利用菲用于自身生长，表现出较好的应用潜能。
(2)将菲浓缩液加入50mL离心管，待有机溶剂吹干后，加入4mL MSM培养基和1mLPseudomonas monteilii XC-1菌液(OD600nm＝1.0)，菲的终浓度为100mg/L；不加菌液的处理组作为空白对照组，每组三个重复。
将各处理组的试管于30℃、200rpm摇床遮光连续培养15天，分别在第1天、3天、5天、7天、10天和15天时随机取3个试管，加入内标(咔唑和苯并[a]蒽)和10mL二氯甲烷，于30℃摇床(转速200rpm)提取2h。准确吸取1mL有机相至棕色色谱进样瓶中，用氮吹仪吹干溶剂后，加入1mL色谱纯乙腈复溶，得到复溶样品。将复溶样品用0.22μm尼龙滤膜过滤后，将滤液转至新的色谱进样瓶中，用高效液相色谱仪(Ultimate 3000)对菲实施定量分析。
色谱柱为ZORBAX Eclipse PAH(4.6*150mm*3.5μm)；运行参数为：流动相为乙腈和脱气去离子水，0～0.75min 62％乙腈，0.75～5.25min 62％→100％乙腈，5.25～7.5min100％乙腈，7.5～9.75min 100％→62％乙腈，9.75～11min 62％乙腈；流速2mL/min，保留时间12min，柱温25℃，进样量5μL，检测波长250nm(菲)、290nm(内标)；所有样品的加标回收率在90％～110％，定量下限为0.01mg/L。
检测结果如图6所示。
较低浓度的Pseudomonas monteilii XC-1以起始浓度为100mg/L的菲为唯一碳源，能够在7天内降解去除约50％的菲，在15天内降解去除约80％的菲。
(3)挑Pseudomonas monteilii XC-1单菌落隔夜培养，用MSM培养基清洗两遍，调菌液OD600nm为1.0，得到清洗菌液；将MSM培养基与清洗菌液按体积比4:1混合，得到稀释菌液。在超净台中，向96孔板中加入不同体积的菲浓缩液，待有机溶剂挥发后，向其中加入200μL稀释菌液，菲的终浓度分别为0mg/L(空白对照)、50mg/L、100mg/L、200mg/L、400mg/L、600mg/L、800mg/L和1000mg/L，各浓度均设置8个重复；并在首尾两列加入200μL LB培养基，以检验培养过程中是否存在污染。将96孔板用封口膜密封，置于30℃培养箱中培养。培养3天后，轻柔翻转孔板倾去悬浮菌液，每孔加入磷酸盐缓冲液(pH7.3)轻柔清洗三次，将孔板正置于60℃烘箱处理1h，对生物膜实施固定。再向每孔加入1％结晶紫溶液避光染色30min后，彻底洗去残余的结晶紫溶液，自然晾干孔板。利用95％乙醇溶液将固定在生物膜的结晶紫复溶，用酶标仪测定OD595nm。OD595nm数值越高代表Pseudomonas monteilii XC-1的生物膜生成量越高。
检测结果如图7所示。
与空白对照组相比，随着菲浓度的升高，形成的生物膜量越高。这表明Pseudomonas monteilii XC-1在较高的菲浓度范围内能够存活，且可利用菲为碳源合成生物膜。
实施例4(Pseudomonas monteilii XC-1对不同PAHs的降解作用)
挑Pseudomonas monteilii XC-1单菌落隔夜培养，用MSM培养基清洗两遍，调菌液OD600nm为1.0，得到清洗菌液，用于后续实验。
(1)将MSM培养基与清洗菌液(OD600nm＝1.0)按体积比4:1制备稀释菌液。在超净台中打开无菌24孔板，依次加入咔唑、蒽或芘的浓缩液，待溶剂挥发后，加入1mL稀释菌液。设置不加PAHs(咔唑、蒽和芘)的处理组作为空白对照组；实验组中3种PAHs的终浓度均为100mg/L；实验组和空白对照组均重复四次。将24孔板用封口膜密封，置于30℃培养箱中培养。静置培养3天后，分析每孔中形成的生物膜量(方法同实施例3)。
(2)将MSM培养基与清洗菌液按体积比4:1制备稀释菌液。取50mL灭菌塑料离心管，分别加入咔唑、蒽或芘的浓缩液，待有机溶剂吹干后加入5mL稀释菌液进行混合。咔唑、蒽或芘的最终浓度为10mg/L，各组设置三组重复，同时设置不加菌的实验对照度。在30℃、200rpm条件下恒温振荡培养3天后，用HPLC分析PAHs余量，以计算PAHs的去除率。
检测结果如图8所示。
与空白对照相比，Pseudomonas monteilii XC-1能利用不同PAHs(咔唑、蒽和芘)作为碳源用于合成生物膜；3天内，对10mg/L起始浓度的咔唑、蒽和芘的降解率能够达到8.8％±1.8％，15.8％±3.6％，30.1％±5.9％。这表明Pseudomonas monteilii XC-1具有降解多种PAHs的功能。
实施例5(吐温80对Pseudomonas monteilii XC-1对菲降解作用的影响)
在实际土壤修复过程中，通常需加入表面活性剂以强化PAHs的生物可利用性。吐温80 是一种代表性非离子型表面活性剂，常用于PAHs等有机污染物的土壤修复过程。但是以吐温80作为表面活性剂时，有抑制PAHs降解菌的降解性能的倾向。
挑Pseudomonas monteilii XC-1单菌落隔夜培养，用MSM培养基清洗两遍，调菌液OD600nm为1.0，得到清洗菌液，用于后续实验。
(1)向50mL离心管中加入1mL清洗菌液和4mL含吐温80的MSM培养基，吐温80 的最终质量(g)与液体体积(mL)百分比(w/v)分别为0(空白对照组)，0.50％，1％，2％，3％，4％和5％，每组重复3次。30℃，200rpm条件下恒温振荡培养14天，用酶标仪分析OD600nm，以评估Pseudomonas monteilii XC-1的生长情况。
检测结果如图9所示。
培养的前4天，不同含量的吐温80对OD600nm略有抑制；从第5天开始，空白对照组(未添加吐温80)的Pseudomonas monteilii XC-1进入衰亡期，OD600nm逐渐下降；而实验组中，吐温80含量越多，Pseudomonas monteilii XC-1越晚进入衰亡期。其中，含5％吐温80的实验组中，OD600nm在14天内保持增长，推测Pseudomonas monteilii XC-1可利用吐温80为碳源进行生长。
(2)向50mL离心管中加入菲浓缩液，待溶剂挥干后，加入1mL清洗菌液和4mL含吐温80的MSM培养基，吐温80的终浓度分别为0、0.5％、1％、2％、3％、4％和5％，菲的终浓度为40mg/L，每组重复3次。于30℃，200rpm条件下恒温振荡培养3天后，用HPLC分析PAHs余量。
检测结果如图10所示。
添加1％、2％、3％、4％和5％吐温80时，Pseudomonas monteilii XC-1对菲的平均降解率分别为27.4％±4.0％，28.3％±2.5％，26.0％±3.4％，24.6％±1.4％，27.8％±4.1％，组间无显著性差异(P-value：1.0)。因此，添加较高浓度的吐温80表面活性剂对Pseudomonas monteilii XC-1降解菲的效率无较大负面影响。
(3)向50mL离心管中加入终浓度分别为5mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L、80mg/L和120mg/L的菲，待溶剂挥干后，加入1mL清洗菌液和4mL含吐温80的MSM培养基，吐温80的终浓度为1.0g/L，每组设3个重复。于30℃、200rpm条件下恒温振荡培养3天后，用HPLC分析PAHs余量。
检测结果如图11所示。
Pseudomonas monteilii XC-1对不同起始浓度的菲表现出不同的降解效率。当菲起始浓度在10～40mg/L时，平均降解率可在30％以上；而当浓度低至5mg/L或增至80和120mg/L时，降解效率下降至20％左右。因此，过低和过高的PAHs起始浓度均会影响XC-1的降解效率。在实际修复应用过程中，应根据实际PAHs浓度调整XC-1的添加量，以期实现良好的降解修复效果。
在实际土壤修复过程中，往往需要添加表面活性剂以促进PAHs的溶解，增强其微生物可利用性。部分降解菌对表面活性剂的适应性较差，进而在有表面活性剂存在时其PAHs降解性能受到抑制。而本发明的Pseudomonas monteilii XC-1在有无表面活性剂存在时，对PAHs均能表现出稳定的降解性能，表明其具备良好实用潜力。
实施例6(环境条件对Pseudomonas monteilii XC-1对菲降解作用的影响)
污染土壤的理化性质会影响土壤修复效果，因此需考察不同环境条件对菌株的影响。实验选取pH、温度和盐度三个主要环境因素，以菲降解率为衡量指标，评估其临界条件对Pseudomonas monteilii XC-1菌株的影响。
挑Pseudomonas monteilii XC-1单菌落隔夜培养，用MSM培养基清洗两遍后，调菌液OD600nm为1.0，得到清洗菌液；向50mL离心管中加入菲浓缩液，待溶剂挥干后，加入1mL清洗菌液和4mL MSM培养基，菲的终浓度40mg/L，混匀后，在200rpm摇床中分别培养3天，用HPLC分析PAHs余量。
其中，本实验中所用MSM培养基的pH均为具体实验组对应pH条件。探究的pH设置为5.0和9.0(分别使用0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲体系和0.1mol/L HCl-NaHCO3调节培养基pH)；盐度设置为3％和5％(通过添加NaCl来改变培养基盐度)；培养温度设置为15℃、20℃和35℃。将实验条件为pH7.0、培养温度为30℃、盐度为MSM中所含基础盐浓度总和0.44％的实验组设置为空白对照组，每组重复3次。
检测结果如图12所示。
与对照组相比，高温(35℃)、高盐度(3％和5％)、偏酸(pH5.0)和偏碱(pH9.0)条件下，菲降解率不仅未见明显下降，反而有所提高。温度对菲降解率影响较大，但即使在低温(15℃)条件下，菲的3天降解率仍能维持在14.5％。这表明Pseudomonas monteilii XC-1对不同环境临界条件适应性较强，在实际土壤修复中具备良好应用潜力。
上面结合实施例对本发明实施例作了详细说明，但本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。

Claims (10)

1.一株蒙氏假单胞菌，其特征在于，命名为蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)XC-1，保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心，保藏时间：2023年1月9日，保藏编号：GDMCCNo:63127。
2.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂含有权利要求1所述的蒙氏假单胞菌XC-1。
3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂还包括表面活性剂。
4.一种用于降解多环芳烃的产品，其特征在于，包括权利要求1所述的蒙氏假单胞菌XC-1或权利要求2至3任一项所述的菌剂。
5.A1)至A3)中任一种在降解多环芳烃中的应用，
A1)权利要求1所述的蒙氏假单胞菌XC-1；
A2)权利要求2或3所述的菌剂；
A3)权利要求4所述的产品。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述多环芳烃包括菲、咔唑、蒽和芘中的至少一种。
7.一种降解多环芳烃的方法，其特征在于，包括以下步骤：
用A1)至A3)中任一种接触多环芳烃；
A1)权利要求1所述的蒙氏假单胞菌XC-1；
A2)权利要求2或3所述的菌剂；
A3)权利要求4所述的产品。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述降解中的温度条件为15℃～35℃。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述降解中的盐度条件为0.5％～5％。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述降解中的pH条件为5～9。
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