CN114990005B - 降解菲的复合菌群及其制备方法和应用 - Google Patents

降解菲的复合菌群及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及降解菲的复合菌群及其筛选方法和应用。本发明提供的降解菲的复合菌群包括假单胞菌属、短波单胞菌属、斯克尔曼氏菌属、根瘤菌属、玫瑰单胞菌属和鞘氨醇单胞菌属，可稳定快速的降解菲，有效用于菲的生物降解与环境修复。与现有技术相比，本发明可以在去除菲的同时保留基本的微生物生态交互网络，从而保持菌群的稳定性，菌群可以在污染土壤中更长时间存在，保持长时间的降解效果。

Description

降解菲的复合菌群及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及降解菲的复合菌群及其制备方法和应用。
背景技术
多环芳烃(PAHs)是环境中普遍存在的有机污染物，对人类健康存在巨大的威胁。大部分的多环芳烃对人具有致畸性和致癌性。同时多环芳烃在环境中具有快速的移动性，从而使其在空气、土壤、水环境、沉淀物等环境介质中广泛分布。PAHs主要来自于焦化厂、炼钢厂、化工厂等排放的废弃物，石油等燃料的不完全燃烧，垃圾的焚烧和填埋，飞机、汽车等交通工具所排放的废气等。土壤是最容易发生PAHs积累的介质。文献表明环境中90％以上的PAHs积聚在土壤中。2014年《全国土壤污染状况调查公报》中显示工业废弃地、化工类园区、重污染企业用地、采油区、污水灌溉区及其周边土壤己成为PAHs的主要污染区域。我国土壤中PAHs污染点位超标率为1.4％，而中重度污染点位超标率为0.4％。PAHs进入土壤后，会将土壤的孔间隙封堵，降低土壤的透水性和透气性，抑制微生物的生长，进一步抑制农作物的生长。
菲(PHE)是多环芳烃的典型代表物质，菲是一种低分子量的多环芳烃，其结构中具有一个“Bay-区域”和一个“K-区域"，这两个结构与致癌性密切相关。环境中的菲多以固态形式存在，会在环境中长期停留并通过食物链向人体富集。在土壤中，菲也多以固态存在，而其主要来源是含菲废气的沉降以及将含有菲的垃圾等直接以肥料施于农田。有研究对某焦化厂土壤中的PAHs分布进行研究后发现，其中菲的浓度达到了83.7±10.6mg/kg。由于以菲为代表的多环芳烃对于人类健康存在直接和间接的威胁，因此需要采用一定的措施来减少其带来的风险，尤其是减少其在土壤中的污染。
近年来用于修复污染土壤中多环芳烃的方法包括物理修复方法、化学修复方法和生物修复方法，但前两者有可能会对环境造成二次污染或者成本高昂。生物修复方法作为一种更加安全且低成本的污染物修复措施，已经被应用于污染土壤或者污染水源的修复。从20世纪60年代发现第一株可以降解多环芳烃的假单胞菌以来，已经发现了多株具有多环芳烃降解能力的细菌，包括伯克霍尔德氏菌、假单胞菌、分枝杆菌、鞘氨醇单胞菌等。其中现有研究表明，假单胞菌是一类能够有效地降解PAHs的细菌。在公开号CN101195811A的专利申请中报道了一株对菲和萘有厌氧降解效果的假单胞菌。鞘氨醇单胞菌也是一类对污染物有降解效果的细菌。在公开号CN1844361A的专利申请中涉及一种由鞘氨醇单胞菌属菌株组成的降解多环芳烃的菌剂。除了降解功能菌外，还有一些菌株通过产生营养物质、降解有毒副产物或者与入侵菌株拮抗等过程提高整个菌群的稳定性。如Methylorubrum extorquens可以分解木质素降解中产生的具有毒害作用的甲醇，使降解菌持续发挥作用。
尽管能够降解多环芳烃的细菌比较多，但几乎都是利用单一细菌进行降解。如中国专利CN110699294B就公布了一株降解多环芳烃的菌株。而生物降解在实际修复中面临着环境变化的影响，单一细菌很容易受到环境的影响而难以发挥预期的功能。但是不同菌株可以通过相互作用从而形成复杂、稳定的生态交互网络，在面对环境胁迫时，相比单一菌株有更强的抗压能力和自我恢复能力。
因此需要开发一种具有高环境适应性的复合菌群，更好地定植于复杂的土壤环境中，更高效地降解土壤中的以菲为代表的多环芳烃类污染物。
发明内容
本发明的目的是提供一种降解菲的复合菌群及其制备方法和应用，该菌群可稳定快速的降解菲，可有效用于菲的生物降解与环境修复。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一方面，本发明提供复合菌群，其特征在于，所述复合菌群包括假单胞菌属、短波单胞菌属、斯克尔曼氏菌属、根瘤菌属、玫瑰单胞菌属和鞘氨醇单胞菌属。
在一些实施方案中，所述复合菌群按菌液体积比包括假单胞菌属90.35％-95.53％、短波单胞菌属0.54％-1.05％、斯克尔曼氏菌属0.31％-6.97％、根瘤菌属0.08％-1.13％、玫瑰单胞菌属0.01％-1.28％和鞘氨醇单胞菌属0.0108％-0.0236％。
在一些实施方案中，所述复合菌群包括恶臭假单胞菌90.35％-95.53％、土壤短波单胞菌0.54％-1.05％、抗锑斯克尔曼氏菌0.31％-6.97％、根瘤菌0.08％-1.13％、颈玫瑰单胞菌0.01％-1.28％和多噬香鞘氨醇单胞菌0.0108％-0.0236％。
另一方面，本发明降解菲的复合菌群的筛选方法，其特征在于，包括：以受原油污染的土壤为样品，采用含有菲的无机盐培养基进行富集培养，而后通过梯度稀释的方法逐渐分离出降解菲的目的复合菌群，以目的复合菌群DNA为模版，选择16S rRNA V3-V4区域进行扩增，引物为27F-5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1492R-5’-TACGACTTAACCCCAATCGC-3’，对复合菌群的群落结构进行分析。
在一些实施方案中，受原油污染的土壤的原油含量≥200mg·kg-1。
在一些实施方案中，菲无机盐培养基(PHE-MSM)的配制方法为：先配制无机盐培养基，分装后灭菌，再在无菌环境中加入无菌菲储备液，放置于培养箱中，以挥发尽其中的丙酮；
无机盐培养基的配方为：NaNO3 0.5g·L-1、KH2PO4 1.0g·L-1、CaC12 0.02g·L-1、MgSO4 0.2g·L-1、(NH4)2SO4 0.5g·L-1、NaH2PO4 1.0g·L-1、FeSO4·7H2O 0.001g·L-1；2mL微量元素溶液；
微量元素溶液配方为：MoO3 0.001g·L-1、ZnSO4·7H2O 0.007g·L-1、CuSO4·5H2O0.0005g·L-1、H3BO3 0.001g·L-1、MnSO4·5H2O 0.001g·L-1、CoCl2·6H2O 0.001g·L-1、NiSO4·7H2O 0.001g·L-1；
无菌菲储备液：菲1g溶于100mL丙酮(分析纯)中，过0.22μm有机滤膜除菌后得到浓度为10000mg·L-1无菌菲的丙酮溶液，放入无菌的棕色玻璃瓶中，避光4℃保存。
在一些实施方案中，富集培养多代，且每次富集培养时菲的浓度逐渐递增。
在一些实施方案中，富集培养的步骤包括置于生化培养箱30℃，150-180rpm孵育7-10天。
在一些实施方案中，梯度稀释包括稀释0、10-2、10-4、10-6、10-8倍。
在一些实施方案中，对复合菌群的群落结构进行分析的扩增程序为：95℃预变性5min；94℃变性1min，55℃复性1min，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸10min。
在一些实施方案中，降解菲的复合菌群的筛选方法，包括以下步骤：
(1)取被原油污染的土壤(原油含量≥200mg·kg-1)，接种于含有菲的无机盐培养基(PHE-MSM)中进行富集培养，置于生化培养箱30℃，150-180rpm孵育7-10天，之后取1％-2％的富集液继续传代至下一个含有菲的无机盐培养基(PHE-MSM)，连续富集3代，其中菲的浓度逐渐递增。
(2)最后一代富集液取出部分制备菌悬液。具体方法为8000rpm下离心10min，以同体积的无菌磷酸缓冲液(PBS)进行冲洗，重复3次。最后一次冲洗后，加入相同体积的无菌PBS。
(3)将步骤(2)中的菌悬液按照1％的接种量加入含有菲的无机盐培养基(PHE-MSM)中进行筛选培养，置于生化培养箱30℃，150-180rpm孵育7-10天。
(4)利用GC-MS检测(3)中培养物剩余的菲浓度，选择菲浓度最低的一组按照(2)中的操作制作菌悬液，然后将菌悬液依次梯度稀释0、10-2、10-4、10-6、10-8倍。
(5)将步骤(4)中的稀释后菌悬液，按照1％的接种量加入含有菲的无机盐培养基(PHE-MSM)中进行筛选培养，置于生化培养箱30℃，150-180rpm孵育7-10天。之后取1％-2％的培养液继续传代至下一个含有菲的无机盐培养基(PHE-MSM)，连续3代，使群落结构和群落功能逐渐稳定。
(6)利用GC-MS检测(5)中培养物剩余的菲浓度，选择具有菲降解能力，且稀释倍数最高的一组按照(2)中的操作制作菌悬液，作为目标菌群。
另一方面，本发明提供上述降解菲的复合菌群在降解土壤中菲中的应用，其特征在于，将复合菌群的菌悬液直接喷洒到土壤并搅拌均匀。
有益效果
与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
(1)本发明的复合菌群能够有效的降解菲，能够在5天内降解约200mg·L-1的菲，同时该菌群能够在土壤中维持长达60天的降解效果。
(2)本发明可以在降解菲的同时保留基本的生态交互网络，从而保持菌群的稳定性，菌群可以在污染土壤中更长时间存在，保持长时间的降解效果。
(3)本发明的复合菌群最适生长温度为30℃，环境pH＝6.0-8.0。
附图说明
图1示出了筛选获得的菲降解菌群的实验室降解效果(5天)。
图2示出了菲降解菌群在属水平上的群落组成(1-4代菌群)。因为菌群是会进行传代的，本发明给出菌群组成比例的时候也是给出的每个菌株的占比范围而非固定占比。这里图片只给出前四代的群落组成图示，后续几代的群落组成都在本发明给出的占比范围里波动。
图3示出了菲降解菌群在土壤中的降解效果(60天)。
图4示出了复配的菲降解菌群实验室降解效果(5天)。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
本发明使用了以下培养基：
菲无机盐培养基(PHE-MSM)的配制方法为：先配制无机盐培养基，分装后在121℃，压力103.4kPa下灭菌22min。再在无菌环境中加入无菌菲储备液。放置于培养箱中，40℃避光培养24h，以挥发尽其中的丙酮。
无机盐培养基的配方为：NaNO3 0.5g·L-1、KH2PO4 1.0g·L-1、CaC12 0.02g·L-1、MgSO4 0.2g·L-1、(NH4)2SO4 0.5g·L-1、NaH2PO4 1.0g·L-1、FeSO4·7H2O 0.001g·L-1；2mL微量元素溶液。
微量元素溶液配方为：MoO3 0.001g·L-1、ZnSO4·7H2O 0.007g·L-1、CuSO4·5H2O0.0005g·L-1、H3BO3 0.001g·L-1、MnSO4·5H2O 0.001g·L-1、CoCl2·6H2O 0.001g·L-1、NiSO4·7H2O 0.001g·L-1。
无菌菲储备液：菲1g溶于100mL丙酮(分析纯)中，过0.22μm有机滤膜除菌后得到浓度为10000mg·L-1无菌菲的丙酮溶液，放入无菌的棕色玻璃瓶中，避光4℃保存。
实施例1.降解菲的复合菌群的获取
步骤一
将从青海某油田获取的原油污染土壤过2mm土筛，取2g被原油污染的土壤(原油含量≥200mg·kg-1)，接种于100ml含有菲的无机盐培养基(PHE-MSM)中进行富集培养，置于生化培养箱30℃，150rpm孵育7天，之后取2ml的富集液继续传代至下一个含有菲的富集培养基(PHE-MSM)，连续传代3次，其中菲的浓度逐渐递增(50mg·L-1-100mg·L-1-150mg·L-1)。
步骤二
最后一代富集液取出2ml，8000rpm下离心10min，以2ml的无菌磷酸缓冲液(PBS)进行冲洗，重复3次。最后一次冲洗后，加入2ml的无菌PBS，涡旋混匀。
步骤三
取步骤二中菌悬液200μL，加入到20ml含有200mg·L-1的菲无机盐培养基(PHE-MSM)中进行筛选培养。准备6-8组重复，置于生化培养箱30℃，150rpm孵育7天。
步骤四
根据GB/T 26411-2010利用GC-MS检测步骤三中培养物剩余的菲浓度，选择菲浓度最低的样品取出2ml，8000rpm下离心10min，以2ml的无菌磷酸缓冲液(PBS)进行冲洗，重复3次。最后一次冲洗后，加入2ml的无菌PBS，涡旋混匀。然后用相同的无菌PBS将菌悬液梯度稀释0、10-2、10-4、10-6、10-8倍。
步骤五
取步骤四中的不同稀释倍数菌悬液200μL，加入20ml含有200mg·L-1的菲无机盐培养基(PHE-MSM)中进行筛选培养，置于生化培养箱30℃，150rpm孵育7天。
步骤六
根据GB/T 26411-2010利用GC-MS检测步骤五中培养物中剩余的菲浓度，选择菲浓度最低的一组，8000rpm下离心10min，以2ml的无菌磷酸缓冲液(PBS)进行冲洗，重复3次。最后一次冲洗后，加入2ml的无菌PBS，涡旋混匀，作为目的菌群。
实施例2.降解菲的复合菌群的群落结构分析
步骤一
DNA提取：采用天根细菌基因组提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司，目录号DP302)，按照试剂盒说明书提取培养液中菌群DNA。
步骤二
PCR扩增：以目的菌群DNA为模版，选择16S rRNA V3-V4区域进行扩增，引物为27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-TACGACTTAACCCCAATCGC-3’)。反应体系为25μL，包括：12.5μL 2×EasyTaq PCR SuperMix(-dye)，1μL正向引物，1μL反向引物，1μL DNA模板和9.5μL ddH2O。扩增程序为：95℃预变性5min；94℃变性1min，55℃复性1min，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸10min。
步骤三
PCR产物纯化：产物使用2％浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测：根据PCR产物浓度进行等量混样，充分混匀后使用1×TAE浓度2％的琼脂糖凝胶电泳纯化PCR产物，剪切回收目标条带。利用Axygen公司的胶回收试剂盒回收目的条带。
步骤四
测序及生物信息学分析：将PCR产物建库后用Miseq PE350进行测序，并进一步分析其群落结构。对菌群在属水平上进行注释，物种及比例为:假单胞菌属(90.35％-95.53％)、短波单胞菌属(0.54％-1.05％)、斯克尔曼氏菌属(0.31％-6.97％)、根瘤菌属(0.08％-1.13％)、玫瑰单胞菌属(0.01％-1.28％)、鞘氨醇单胞菌属(0.0108％-0.0236％)。
实施例3.降解菲的复合菌群的功能分析
将200μL菌群加入20ml含有200mg·L-1的菲的无机盐培养基，培养7d(第0天起始，第0天默认初始浓度200mg·L-1，初始添加值已知，不再做测定)。参考GB/T 26411-2010海水中16种多环芳烃的测定气相色谱-质谱法对培养基中剩余的菲浓度进行检测。
将10ml正己烷加入全部培养液中摇匀，再倒入分液漏斗；以10ml正己烷冲洗；在分液漏斗振荡器上震荡5min，将水溶液从分液漏斗下层放出，将有机溶液从上层倒出，定容到40ml，过0.22μm孔径有机相滤膜后，GC-MS分析。
如图1所示，在5天的培养时间中，复合菌群能降解约200mg·L-1的菲，尤其在第3天到第5天期间可以达到40mg/L·d-1的降解率。
实施例4.降解菲的复合菌群的应用
实施例1获取的菌悬液按照每千克土100mL为标准接种到受菲污染的农田土中(在超净台中采用滴灌的方式加入10g/L的菲丙酮溶液，使得土壤中菲的含量为200mg/kg，用接种棒拌均匀，待菲溶液与土壤充分混合后，放置通风橱中挥发24h使丙酮完全挥发。)。每隔十天采样一次，持续60天。参考HJ 805-2016土壤和沉积物多环芳烃的测定气相色谱-质谱法对土壤中剩余菲浓度进行测定。
采用实施例1中方法获取的菲降解菌群：
1.可降解土壤中较高浓度的菲。该菌群可以在60天的培养时间中，降解土壤中200mg/kg的菲。
2.维持降解效果时间长。该菌群在前35天的培养时间中，能将含有200mg/kg菲的土壤中菲浓度降低至80mg/kg，而在后续的培养实验中，菌群仍可以以3mg/kg·d-1的速率持续降低土壤中的菲浓度，保持一个较长期的降解效果(如图3所示)。目前鲜有土壤中菲降解长达60天的相关研究。
实施例5.降解菲复合菌群的复配
从菌株保藏中心购入商品化菌株：恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida,隶属假单胞菌属，获取于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC 23685)；土壤短波单胞菌(Brevundimonas terrae,隶属短波单胞菌属，获取于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC1.8085)、抗锑斯克尔曼氏菌(Skermanellastibiiresistens,隶属斯克尔曼氏菌属，获取于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC1.10751)、根瘤菌(Rhizobium sp.,隶属根瘤菌属，获取于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC 10912)、颈玫瑰单胞菌(Roseomonascervicalis,隶属玫瑰单胞菌属，获取于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC1.9079)、多噬香鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas polyaromaticivorans,隶属鞘氨醇单胞菌属，获取于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC 10894)。
步骤一
菌株的活化：所有菌株的起始为冻干管，将菌株接种于LB液体培养基中为第一代，于30℃，150rpm下培养1-3d；之后涂布于LB固体培养基，30℃培养3-5d，有菌落生长。挑取单菌落再次接种到LB液体培养基，培养至OD600值为0.5。
步骤二
菌悬液的制备：将上一步的菌液在8000rpm下离心10min，以2ml的无菌磷酸缓冲液(PBS)进行冲洗，重复3次。最后一次冲洗后，用PBS将菌体稀释成OD600值为0.1的菌悬液。
步骤三
复合菌群的构建及功能分析：将实验中制备好的各单菌株的菌悬液按如下比例接种到含有200mg·L-1的菲无机盐培养基(PHE-MSM)。接种比例(单菌菌悬液体积比)为：恶臭假单胞菌(92％)、土壤短波单胞菌(1％)、抗锑斯克尔曼氏菌(4.98％)、根瘤菌(1％)、颈玫瑰单胞菌(1％)、多噬香鞘氨醇单胞菌(0.02％)。置于生化培养箱30℃，150rpm孵育7天。培养结束后利用GC-MS检测菲浓度，发现其能够在5天内降解约200mg·L-1的菲。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.复合菌群，其特征在于，所述复合菌群按单菌菌悬液体积比为恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）CICC 23685 92%、土壤短波单胞菌（Brevundimonas terrae）CGMCC1.8085 1%、抗锑斯克尔曼氏菌（Skermanella stibiiresistens）CGMCC1.107514.98%、根瘤菌（Rhizobium sp.）CICC 10912 1%、颈玫瑰单胞菌（Roseomonas cervicalis）CGMCC1.9079 1%和多噬香鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas polyaromaticivorans）CICC10894 0.02%。
2.根据权利要求1所述的复合菌群在降解土壤中菲中的应用，其特征在于，将复合菌群的菌悬液直接喷洒到土壤并搅拌均匀。
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