JP2016163551A - インビトロバイオフィルム、及び洗浄剤の臭気除去効果の評価方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】洗濯槽に形成されるバイオフィルムの評価モデルとしてのインビトロバイオフィルム、及びこれを用いた洗浄剤の臭気除去効果の評価方法を提供する。
【解決手段】一般式（１）で表される化合物、一般式（２）で表される化合物、及びピリジンからなる群より選択される１種以上を発生する、インビトロバイオフィルム。式（１）中、Ｒ１は、アルキル基、アルケニル基又は水素原子である。Ｒ２は、アルキル基、アルケニル基、水素原子又はヒドロキシ基である。Ｘは、硫黄原子を含む基、又はカルボニル基である。式（２）中、Ｒ３ａ〜Ｒ３ｃは、それぞれ独立に、アルキル基、アルケニル基又は水素原子である。Ｙは、窒素原子を含む基である。
［化１］
【選択図】なし
【解決手段】一般式（１）で表される化合物、一般式（２）で表される化合物、及びピリジンからなる群より選択される１種以上を発生する、インビトロバイオフィルム。式（１）中、Ｒ１は、アルキル基、アルケニル基又は水素原子である。Ｒ２は、アルキル基、アルケニル基、水素原子又はヒドロキシ基である。Ｘは、硫黄原子を含む基、又はカルボニル基である。式（２）中、Ｒ３ａ〜Ｒ３ｃは、それぞれ独立に、アルキル基、アルケニル基又は水素原子である。Ｙは、窒素原子を含む基である。
［化１］
【選択図】なし
Description
本発明は、インビトロバイオフィルム、及び洗浄剤の臭気除去効果の評価方法に関する。
近年、衛生意識の高まりから、衣料用の洗浄剤には、被洗物に付着した汚れを除去すること（洗浄力）に加え、被洗物から発生する不快なにおい（臭気）を除去することや、被洗物から臭気が発生するのを防止することが求められている。被洗物から臭気が発生するのは、主として、被洗物の乾燥中や保管中に、繊維に付着した微生物が増殖することに起因する。
昨今の生活スタイルの変化に伴い、夜に洗濯を行い、洗濯後の被洗物を室内で乾かすという、部屋干し、を行う家庭が増えている。部屋干しは風通しが悪く、被洗物が乾きにくいことで、繊維に付着した微生物が増殖しやすい。このため、被洗物から臭気（部屋干し臭）が発生する。
洗浄剤による洗浄後の被洗物から発生する臭気についての評価としては、実際に洗浄後の被洗物を嗅いで、臭いの強さ等を判定する官能評価が行われている。また、被洗物から臭気成分を抽出し、この臭気成分を定性又は定量的に分析する機器評価が行われている（例えば、特許文献１参照）。
昨今の生活スタイルの変化に伴い、夜に洗濯を行い、洗濯後の被洗物を室内で乾かすという、部屋干し、を行う家庭が増えている。部屋干しは風通しが悪く、被洗物が乾きにくいことで、繊維に付着した微生物が増殖しやすい。このため、被洗物から臭気（部屋干し臭）が発生する。
洗浄剤による洗浄後の被洗物から発生する臭気についての評価としては、実際に洗浄後の被洗物を嗅いで、臭いの強さ等を判定する官能評価が行われている。また、被洗物から臭気成分を抽出し、この臭気成分を定性又は定量的に分析する機器評価が行われている（例えば、特許文献１参照）。
ところで、本発明者らの検討によると、生活者の中には「洗濯槽から臭気が感じられる」、「洗濯槽の汚れが原因で被洗物から臭気が発生する」という不満があることが分かった。
洗濯機において洗濯水が溜まる洗濯槽は、被洗物が投入される内側に比べて外側に水気が残りやすい。このため、洗濯槽の外側は、菌又はカビ等の微生物が発生しやすく、不衛生になりやすい場所である。
洗濯槽には、多種多様な微生物が存在する。特に、洗濯槽の外側には、微生物によってバイオフィルムが形成されやすい。
洗濯機において洗濯水が溜まる洗濯槽は、被洗物が投入される内側に比べて外側に水気が残りやすい。このため、洗濯槽の外側は、菌又はカビ等の微生物が発生しやすく、不衛生になりやすい場所である。
洗濯槽には、多種多様な微生物が存在する。特に、洗濯槽の外側には、微生物によってバイオフィルムが形成されやすい。
洗濯槽から発生する臭気についての評価には、家庭で実際に使用された洗濯機（洗濯槽）の実物が用いられている。しかし、家庭での実使用によってバイオフィルムが形成するまでには、長期間を要する。また、多くのサンプル数を確保するには、多大な労力及び費用も要する。
これに対し、洗濯槽に形成されるバイオフィルムの評価モデルとして、インビトロバイオフィルムの利用が考えられる。
洗濯槽から発生する臭気をインビトロで評価するには、洗濯槽に実在する菌と同様の菌種を用いて、洗濯槽と同様の臭気を発生するインビトロバイオフィルムが必要である。
しかしながら、従来、洗濯槽に形成されるバイオフィルムと同様の臭気を発生するインビトロバイオフィルムは報告されていない。
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、洗濯槽に形成されるバイオフィルムの評価モデルとしてのインビトロバイオフィルム、及びこれを用いた洗浄剤の臭気除去効果の評価方法、を課題とする。
これに対し、洗濯槽に形成されるバイオフィルムの評価モデルとして、インビトロバイオフィルムの利用が考えられる。
洗濯槽から発生する臭気をインビトロで評価するには、洗濯槽に実在する菌と同様の菌種を用いて、洗濯槽と同様の臭気を発生するインビトロバイオフィルムが必要である。
しかしながら、従来、洗濯槽に形成されるバイオフィルムと同様の臭気を発生するインビトロバイオフィルムは報告されていない。
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、洗濯槽に形成されるバイオフィルムの評価モデルとしてのインビトロバイオフィルム、及びこれを用いた洗浄剤の臭気除去効果の評価方法、を課題とする。
本発明者らは、検討により、洗濯槽に実在する微生物のうち、特定の微生物を培養すれば、洗濯槽に形成されるバイオフィルムから発生する臭気成分であるスルフィド等が検出されること；特定の微生物が、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属等であることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明のインビトロバイオフィルムは、下記一般式（１）で表される化合物、下記一般式（２）で表される化合物、及びピリジンからなる群より選択される１種以上を発生することを特徴とする。
本発明のインビトロバイオフィルムにおいては、マイコバクテリウム属細菌、ブレブンディモナス属細菌、メチロバクテリウム属細菌、及びスフィンゴモナス属細菌からなる群より選択される１種以上の微生物を含むことが好ましい。
本発明のインビトロバイオフィルムにおいては、マイコバクテリウム属細菌及びブレブンディモナス属細菌からなる群より選択される１種以上の微生物を含むことがより好ましい。
本発明のインビトロバイオフィルムにおいては、さらに、シュードモナス属細菌を含むことが好ましい。
本発明のインビトロバイオフィルムにおいては、マイコバクテリウム属細菌及びブレブンディモナス属細菌からなる群より選択される１種以上の微生物を含むことがより好ましい。
本発明のインビトロバイオフィルムにおいては、さらに、シュードモナス属細菌を含むことが好ましい。
本発明のインビトロバイオフィルムは、マイコバクテリウム属細菌、ブレブンディモナス属細菌、メチロバクテリウム属細菌、及びスフィンゴモナス属細菌からなる群より選択される１種以上を含む微生物群を培養して作製されたものが好ましい。
本発明のインビトロバイオフィルムは、マイコバクテリウム属細菌及びブレブンディモナス属細菌からなる群より選択される１種以上を含む微生物群を培養して作製されたものがより好ましい。
前記微生物群は、さらに、シュードモナス属細菌を含むことが好ましい。
本発明のインビトロバイオフィルムは、マイコバクテリウム属細菌及びブレブンディモナス属細菌からなる群より選択される１種以上を含む微生物群を培養して作製されたものがより好ましい。
前記微生物群は、さらに、シュードモナス属細菌を含むことが好ましい。
本発明のインビトロバイオフィルムは、合成樹脂体、金属体又はガラス体の表面に作製されたものが好ましい。
本発明の洗浄剤の臭気除去効果の評価方法は、前記本発明のインビトロバイオフィルムを洗浄対象物とし、前記洗浄対象物を洗浄剤により洗浄する前と後で、前記インビトロバイオフィルムから発生する臭気成分の発生量を測定することを特徴とする。
本発明の洗浄剤の臭気除去効果の評価方法においては、前記のインビトロバイオフィルムから発生する臭気成分が、前記一般式（１）で表される化合物、前記一般式（２）で表される化合物、及びピリジンからなる群より選択される１種以上であることが好ましい。
本発明の洗浄剤の臭気除去効果の評価方法においては、前記のインビトロバイオフィルムから発生する臭気成分が、前記一般式（１）で表される化合物、前記一般式（２）で表される化合物、及びピリジンからなる群より選択される１種以上であることが好ましい。
本発明のインビトロバイオフィルムによれば、洗濯槽に形成されるバイオフィルムの評価モデルを提供できる。
また、本発明の洗浄剤の臭気除去効果の評価方法によれば、洗濯槽に形成されるバイオフィルムに対する洗浄剤の臭気除去効果を、インビトロバイオフィルムを用いて簡便に評価できる。
また、本発明の洗浄剤の臭気除去効果の評価方法によれば、洗濯槽に形成されるバイオフィルムに対する洗浄剤の臭気除去効果を、インビトロバイオフィルムを用いて簡便に評価できる。
（インビトロバイオフィルム）
本発明のインビトロバイオフィルムは、下記一般式（１）で表される化合物、下記一般式（２）で表される化合物、及びピリジンからなる群より選択される１種以上を発生する。
本発明において、バイオフィルムとは、微生物により形成されるフィルム状の構造体からなるものをいう。
本発明のインビトロバイオフィルムは、下記一般式（１）で表される化合物、下記一般式（２）で表される化合物、及びピリジンからなる群より選択される１種以上を発生する。
本発明において、バイオフィルムとは、微生物により形成されるフィルム状の構造体からなるものをいう。
前記式（１）中、Ｒ１は、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基又は水素原子である。Ｒ１におけるアルキル基、アルケニル基は、それぞれ、直鎖状であっても分岐鎖状であってもよい。Ｒ１におけるアルキル基の炭素数は、好ましくは炭素数１〜５であり、より好ましくは炭素数１〜３である。Ｒ１におけるアルケニル基の炭素数は、好ましくは炭素数２〜５であり、より好ましくは炭素数２又は３である。
Ｒ２は、炭素数１〜５のアルキル基、炭素数２〜５のアルケニル基、水素原子又はヒドロキシ基である。Ｒ２におけるアルキル基、アルケニル基は、それぞれ、直鎖状であっても分岐鎖状であってもよい。
Ｘは、硫黄原子を含む基、又はカルボニル基である。Ｘにおける、硫黄原子を含む基は、好ましくは硫黄原子１〜５個を含む基であり、より好ましくは硫黄原子１〜３個を含む基である。
Ｒ２は、炭素数１〜５のアルキル基、炭素数２〜５のアルケニル基、水素原子又はヒドロキシ基である。Ｒ２におけるアルキル基、アルケニル基は、それぞれ、直鎖状であっても分岐鎖状であってもよい。
Ｘは、硫黄原子を含む基、又はカルボニル基である。Ｘにおける、硫黄原子を含む基は、好ましくは硫黄原子１〜５個を含む基であり、より好ましくは硫黄原子１〜３個を含む基である。
前記式（１）で表される化合物としては、スルフィド化合物（スルフィド、ジスルフィド、トリスルフィド等）、炭素数１０以下の脂肪酸、炭素数１０以下のアルデヒドが挙げられる。
前記式（１）で表される化合物は、例えば、硫化水素、ジメチルスルフィド、ジメチルジスルフィド、ジメチルトリスルフィド、メチルメルカプタン、エチルメルカプタン、酢酸、酪酸、吉草酸、ヘキサン酸、ヘプタン酸、オクタン酸、ノナン酸、デカン酸、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブタナール、ペンタナール、ヘキサナール、ヘプタナール、オクタナール、ノナナール、デカナール等である。
前記式（１）で表される化合物は、例えば、硫化水素、ジメチルスルフィド、ジメチルジスルフィド、ジメチルトリスルフィド、メチルメルカプタン、エチルメルカプタン、酢酸、酪酸、吉草酸、ヘキサン酸、ヘプタン酸、オクタン酸、ノナン酸、デカン酸、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブタナール、ペンタナール、ヘキサナール、ヘプタナール、オクタナール、ノナナール、デカナール等である。
前記式（２）中、Ｒ３ａ〜Ｒ３ｃは、それぞれ独立に、炭素数１〜５のアルキル基、炭素数２〜５のアルケニル基又は水素原子である。Ｒ３ａ〜Ｒ３ｃにおけるアルキル基、アルケニル基は、それぞれ、直鎖状であっても分岐鎖状であってもよい。Ｒ３ａ〜Ｒ３ｃは、互いに同一であってもよいし異なっていてもよい。
Ｙは、窒素原子を含む基であり、好ましくは窒素原子１個を含む基である。
Ｙは、窒素原子を含む基であり、好ましくは窒素原子１個を含む基である。
前記式（２）で表される化合物としては、アンモニア、アミンが挙げられる。
前記式（２）で表されるアミンは、例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン等である。
前記式（２）で表されるアミンは、例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン等である。
中でも、本発明のインビトロバイオフィルムは、指標となりやすい臭気成分を発生することから、一般式（１）で表される化合物及びピリジンからなる群より選択される１種以上を発生するものが好ましく、一般式（１）で表される化合物を発生するものがより好ましい。
一般式（１）で表される化合物の中でも、スルフィド、ジスルフィドがさらに好ましい。
一般式（１）で表される化合物の中でも、スルフィド、ジスルフィドがさらに好ましい。
本発明のインビトロバイオフィルムとしては、微生物を含むものが挙げられる。
かかるインビトロバイオフィルムに含まれる微生物としては、特に制限はなく、好ましくは生菌であり、例えば、アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属細菌、アシドボラクス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ）属細菌、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属細菌、アクチノバクテリウム（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、アクチノマイセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）属細菌、アクチノマイストスポラ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｏｓｐｏｒａ）属細菌、アクチノテルリア（Ａｃｔｉｎｏｔｅｌｌｕｒｉａ）属細菌、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属細菌、アフピア（Ａｆｉｐｉａ）属細菌、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、アグロコッカス（Ａｇｒｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属細菌、アマリコッカス（Ａｍａｒｉｃｏｃｃｕｓ）属細菌、アムニバクテリウム（Ａｍｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、アルセニシコッカス（Ａｒｓｅｎｉｃｉｃｏｃｃｕｓ）属細菌、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属細菌、アトポビウム（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ）属細菌、オーランチモナス（Ａｕｒａｎｔｉｍｏｎａｓ）属細菌、アゾスピリラム（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属細菌、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、ブデロビブリオ（Ｂｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏ）属細菌、ベイジェリンキア（Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉａｃｅａｅ）属細菌、ベルナピア（Ｂｅｌｎａｐｉａ）属細菌、ブラストバクター（Ｂｌａｓｔｏｂａｃｔｅｒ）属細菌、ブラストコッカス（Ｂｌａｓｔｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、ボセア（Ｂｏｓｅａ）属細菌、ブラキバクテリウム（Ｂｒａｃｈｙｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、ブラジリゾビウム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属細菌、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、ブレブンディモナス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ）属細菌、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属細菌、カンジダタス（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ）属細菌、カプノサイトファガ（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ）属細菌、カウロバクター（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ）属細菌、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属細菌、セルロシミクロビウム（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）属細菌、クリセオバクテリウム（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、クラウロコッカス（Ｃｒａｕｒｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、キュープリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）属細菌、ダクチロスポランギウム（Ｄａｃｔｙｌｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ）属細菌、デイノコッカス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、デルフチア（Ｄｅｌｆｔｉａ）属細菌、デメトリア（Ｄｅｍｅｔｒｉａ）属細菌、デルマコッカス（Ｄｅｒｍａｃｏｃｃｕｓ）属細菌、デルマトフィラス（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ）属細菌、デボシア（Ｄｅｖｏｓｉａ）属細菌、ディエジア（Ｄｉｅｔｚｉａ）属細菌、ドクドネラ（Ｄｏｋｄｏｎｅｌｌａ）属細菌、ディアドバクター（Ｄｙａｄｏｂａｃｔｅｒ）属細菌、ディスゴノモナス（Ｄｙｓｇｏｎｏｍｏｎａｓ）属細菌、エリザベスキンギア（Ｅｌｉｚａｂｅｔｈｋｉｎｇｉａ）属細菌、エミチシチア（Ｅｍｔｉｃｉｃｉａ）属細菌、エンハイドロバクター（Ｅｎｈｙｄｒｏｂａｃｔｅｒ）属細菌、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属細菌、エスケリチア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｃｉａ）属細菌、フィブリソーマ（Ｆｉｂｒｉｓｏｍａ）属細菌、フィネゴルディア（Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ）属細菌、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、ゲメラ（Ｇｅｍｅｌｌａ）属細菌、ゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）属細菌、グラニュリカテラ（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ）属細菌、グリモンテラ（Ｇｒｉｍｏｎｔｅｌｌａ）属細菌、ヘマトバクター（Ｈａｅｍａｔｏｂａｃｔｅｒ）属細菌、ヘモフィラス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）属細菌、ヘルバスピリルム（Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属細菌、ヒドロゲノフィラス（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｐｈｉｌｕｓ）属細菌、ジャニバクター（Ｊａｎｉｂａｃｔｅｒ）属細菌、ジェオトガリコッカス（Ｊｅｏｔｇａｌｉｃｏｃｃｕｓ）属細菌、コクリア（Ｋｏｃｕｒｉａ）属細菌、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｂａｃｃｉｌｌｕｓ）属細菌、ラウトロピア（Ｌａｕｔｒｏｐｉａ）属細菌、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）属細菌、レイフソニア（Ｌｅｉｆｓｏｎｉａ）属細菌、レプトスリクス（Ｌｅｐｔｏｔｈｒｉｘ）属細菌、マクロコッカス（Ｍａｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、マルモリコラ（Ｍａｒｍｏｒｉｃｏｌａ）属細菌、マシリア（Ｍａｓｓｉｌｉａ）属細菌、メチリビウム（Ｍｅｔｈｙｌｉｂｉｕｍ）属細菌、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、メチロシナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）属細菌、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、ミクロテリコラ（Ｍｉｃｒｏｔｅｒｒｉｃｏｌａ）属細菌、ミクロビルガ（Ｍｉｃｒｏｖｉｒｇａ）属細菌、ミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）属細菌、ミリシア（Ｍｉｌｌｉｓｉａ）属細菌、モラクセラ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）属細菌、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、ナカムレラ（Ｎａｋａｍｕｒｅｌｌａ）属細菌、ナキシバクター（Ｎａｘｉｂａｃｔｅｒ）属細菌、ネイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）属細菌、ネステレンコニア（Ｎｅｓｔｅｒｅｎｋｏｎｉａ）属細菌、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属細菌、ノカルディオイデス（Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ）属細菌、ノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌、オクロバクトラム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）属細菌、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属細菌、パラッコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属細菌、パツリバクター（Ｐａｔｕｌｉｂａｃｔｅｒ）属細菌、ペドバクター（Ｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ）属細菌、フェニロバクテリウム（Ｐｈｅｎｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、ポンチコッカス（Ｐｏｎｔｉｃｏｃｃｕｓ）属細菌、ポルフィロモナス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）属細菌、プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）属細菌、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細菌、シュードノカルディア（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ）属細菌、シュードルロドフェラクス（Ｐｓｅｕｄｏｒｈｏｄｏｆｅｒａｘ）属細菌、シュードキサンモナス（Ｐｓｅｕｄｏｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属細菌、サイクロバクター（Ｐｓｙｃｈｏｒｏｂａｃｔｅｒ）属細菌、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属細菌、リゾビアレス（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）属細菌、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）属細菌、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、ロセオモナス（Ｒｏｓｅｏｍｏｎａｓ）属細菌、ロシア（Ｒｏｔｈｉａ）属細菌、ルベリミクロビウム（Ｒｕｂｅｌｌｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）属細菌、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属細菌、シノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属細菌、スケルマネラ（Ｓｋｅｒｍａｎｅｌｌａ）属細菌、スフィンゴバクテリウム（Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、スフィンゴビウム（Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属細菌、スフィンゴピキシス（Ｓｐｈｉｎｇｏｐｙｘｉｓ）属細菌、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、ステノトロフォモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）属細菌、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、テッサラコッカス（Ｔｅｓｓａｒａｃｏｃｃｕｓ）属細菌、テトラコッカス（Ｔｅｔｒａｃｏｃｃｕｓ）属細菌、テトラスファエラ（Ｔｅｔｒａｓｐｈａｅｒａ）属細菌、ツカムレッラ（Ｔｓｕｋａｍｕｒｅｌｌａ）属細菌、バリオボラックス（Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ）属細菌、ウィリアムシア（Ｗｉｌｌｉａｍｓｉａ）属細菌、キサンソモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属細菌、キシロフィラス（Ｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ）属細菌、マラセチア（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ）属酵母、サッカロマイセス（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ）属酵母、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属酵母などが挙げられる。
かかるインビトロバイオフィルムに含まれる微生物としては、特に制限はなく、好ましくは生菌であり、例えば、アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属細菌、アシドボラクス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ）属細菌、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属細菌、アクチノバクテリウム（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、アクチノマイセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）属細菌、アクチノマイストスポラ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｏｓｐｏｒａ）属細菌、アクチノテルリア（Ａｃｔｉｎｏｔｅｌｌｕｒｉａ）属細菌、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属細菌、アフピア（Ａｆｉｐｉａ）属細菌、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、アグロコッカス（Ａｇｒｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属細菌、アマリコッカス（Ａｍａｒｉｃｏｃｃｕｓ）属細菌、アムニバクテリウム（Ａｍｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、アルセニシコッカス（Ａｒｓｅｎｉｃｉｃｏｃｃｕｓ）属細菌、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属細菌、アトポビウム（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ）属細菌、オーランチモナス（Ａｕｒａｎｔｉｍｏｎａｓ）属細菌、アゾスピリラム（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属細菌、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、ブデロビブリオ（Ｂｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏ）属細菌、ベイジェリンキア（Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉａｃｅａｅ）属細菌、ベルナピア（Ｂｅｌｎａｐｉａ）属細菌、ブラストバクター（Ｂｌａｓｔｏｂａｃｔｅｒ）属細菌、ブラストコッカス（Ｂｌａｓｔｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、ボセア（Ｂｏｓｅａ）属細菌、ブラキバクテリウム（Ｂｒａｃｈｙｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、ブラジリゾビウム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属細菌、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、ブレブンディモナス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ）属細菌、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属細菌、カンジダタス（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ）属細菌、カプノサイトファガ（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ）属細菌、カウロバクター（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ）属細菌、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属細菌、セルロシミクロビウム（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）属細菌、クリセオバクテリウム（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、クラウロコッカス（Ｃｒａｕｒｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、キュープリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）属細菌、ダクチロスポランギウム（Ｄａｃｔｙｌｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ）属細菌、デイノコッカス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、デルフチア（Ｄｅｌｆｔｉａ）属細菌、デメトリア（Ｄｅｍｅｔｒｉａ）属細菌、デルマコッカス（Ｄｅｒｍａｃｏｃｃｕｓ）属細菌、デルマトフィラス（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ）属細菌、デボシア（Ｄｅｖｏｓｉａ）属細菌、ディエジア（Ｄｉｅｔｚｉａ）属細菌、ドクドネラ（Ｄｏｋｄｏｎｅｌｌａ）属細菌、ディアドバクター（Ｄｙａｄｏｂａｃｔｅｒ）属細菌、ディスゴノモナス（Ｄｙｓｇｏｎｏｍｏｎａｓ）属細菌、エリザベスキンギア（Ｅｌｉｚａｂｅｔｈｋｉｎｇｉａ）属細菌、エミチシチア（Ｅｍｔｉｃｉｃｉａ）属細菌、エンハイドロバクター（Ｅｎｈｙｄｒｏｂａｃｔｅｒ）属細菌、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属細菌、エスケリチア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｃｉａ）属細菌、フィブリソーマ（Ｆｉｂｒｉｓｏｍａ）属細菌、フィネゴルディア（Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ）属細菌、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、ゲメラ（Ｇｅｍｅｌｌａ）属細菌、ゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）属細菌、グラニュリカテラ（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ）属細菌、グリモンテラ（Ｇｒｉｍｏｎｔｅｌｌａ）属細菌、ヘマトバクター（Ｈａｅｍａｔｏｂａｃｔｅｒ）属細菌、ヘモフィラス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）属細菌、ヘルバスピリルム（Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属細菌、ヒドロゲノフィラス（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｐｈｉｌｕｓ）属細菌、ジャニバクター（Ｊａｎｉｂａｃｔｅｒ）属細菌、ジェオトガリコッカス（Ｊｅｏｔｇａｌｉｃｏｃｃｕｓ）属細菌、コクリア（Ｋｏｃｕｒｉａ）属細菌、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｂａｃｃｉｌｌｕｓ）属細菌、ラウトロピア（Ｌａｕｔｒｏｐｉａ）属細菌、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）属細菌、レイフソニア（Ｌｅｉｆｓｏｎｉａ）属細菌、レプトスリクス（Ｌｅｐｔｏｔｈｒｉｘ）属細菌、マクロコッカス（Ｍａｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、マルモリコラ（Ｍａｒｍｏｒｉｃｏｌａ）属細菌、マシリア（Ｍａｓｓｉｌｉａ）属細菌、メチリビウム（Ｍｅｔｈｙｌｉｂｉｕｍ）属細菌、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、メチロシナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）属細菌、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、ミクロテリコラ（Ｍｉｃｒｏｔｅｒｒｉｃｏｌａ）属細菌、ミクロビルガ（Ｍｉｃｒｏｖｉｒｇａ）属細菌、ミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）属細菌、ミリシア（Ｍｉｌｌｉｓｉａ）属細菌、モラクセラ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）属細菌、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、ナカムレラ（Ｎａｋａｍｕｒｅｌｌａ）属細菌、ナキシバクター（Ｎａｘｉｂａｃｔｅｒ）属細菌、ネイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）属細菌、ネステレンコニア（Ｎｅｓｔｅｒｅｎｋｏｎｉａ）属細菌、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属細菌、ノカルディオイデス（Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ）属細菌、ノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌、オクロバクトラム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）属細菌、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属細菌、パラッコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属細菌、パツリバクター（Ｐａｔｕｌｉｂａｃｔｅｒ）属細菌、ペドバクター（Ｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ）属細菌、フェニロバクテリウム（Ｐｈｅｎｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、ポンチコッカス（Ｐｏｎｔｉｃｏｃｃｕｓ）属細菌、ポルフィロモナス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）属細菌、プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）属細菌、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細菌、シュードノカルディア（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ）属細菌、シュードルロドフェラクス（Ｐｓｅｕｄｏｒｈｏｄｏｆｅｒａｘ）属細菌、シュードキサンモナス（Ｐｓｅｕｄｏｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属細菌、サイクロバクター（Ｐｓｙｃｈｏｒｏｂａｃｔｅｒ）属細菌、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属細菌、リゾビアレス（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）属細菌、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）属細菌、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、ロセオモナス（Ｒｏｓｅｏｍｏｎａｓ）属細菌、ロシア（Ｒｏｔｈｉａ）属細菌、ルベリミクロビウム（Ｒｕｂｅｌｌｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）属細菌、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属細菌、シノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属細菌、スケルマネラ（Ｓｋｅｒｍａｎｅｌｌａ）属細菌、スフィンゴバクテリウム（Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、スフィンゴビウム（Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属細菌、スフィンゴピキシス（Ｓｐｈｉｎｇｏｐｙｘｉｓ）属細菌、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、ステノトロフォモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）属細菌、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、テッサラコッカス（Ｔｅｓｓａｒａｃｏｃｃｕｓ）属細菌、テトラコッカス（Ｔｅｔｒａｃｏｃｃｕｓ）属細菌、テトラスファエラ（Ｔｅｔｒａｓｐｈａｅｒａ）属細菌、ツカムレッラ（Ｔｓｕｋａｍｕｒｅｌｌａ）属細菌、バリオボラックス（Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ）属細菌、ウィリアムシア（Ｗｉｌｌｉａｍｓｉａ）属細菌、キサンソモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属細菌、キシロフィラス（Ｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ）属細菌、マラセチア（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ）属酵母、サッカロマイセス（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ）属酵母、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属酵母などが挙げられる。
上記の中でも、かかるインビトロバイオフィルムに含まれる微生物としては、検出頻度が高いことから、アシドボラクス属細菌、アシネトバクター属細菌、アクチノマイストスポラ属細菌、アフピア属細菌、アルスロバクター属細菌、アゾスピリウム属細菌、バチルス属細菌、ボセア属細菌、ブラジリゾビウム属細菌、ブレビバクテリウム属細菌、ブレブンディモナス属細菌、バークホルデリア属細菌、クリセオバクテリウム属細菌、クロストリジウム属細菌、コリネバクテリウム属細菌、ドクドネラ属細菌、エンハイドロバクター属細菌、フソバクテリウム属細菌、ゴルドニア属細菌、ジャニバクター属細菌、メチロバクテリウム属細菌、ミクロバクテリウム属細菌、モラクセラ属細菌、マイコバクテリウム属細菌、ノルカディア属細菌、パラッコッカス属細菌、プレボテラ属細菌、パツリバクター属細菌、シュードモナス属細菌、シュードノカルディア属細菌、シュードキサンモナス属細菌、ラルソトニア属細菌、ロドバクター属細菌、ロドコッカス属細菌、ロセオモナス属細菌、スフィンゴビウム属細菌、スフィンゴモナス属細菌、スタフィロコッカス属細菌、ストレプトコッカス属細菌、テトラコッカス属細菌、バリオボラックス属細菌、ウィリアムシア属細菌、キサンソモナス属細菌、サッカロマイセス属酵母、マラセチア属酵母、ロドトルラ属酵母が好ましい。
これらの中でも、かかるインビトロバイオフィルムにおいては、洗濯槽から発生する臭気を再現できることから、マイコバクテリウム属細菌、ブレブンディモナス属細菌、メチロバクテリウム属細菌、及びスフィンゴモナス属細菌からなる群より選択される１種以上の微生物を含むことがより好ましい。
その中でも、マイコバクテリウム属細菌及びブレブンディモナス属細菌からなる群より選択される１種以上の微生物を含むことがさらに好ましく、マイコバクテリウム属細菌を含むことが特に好ましい。
マイコバクテリウム属細菌を含むことで、洗濯槽から発生する臭気成分に含まれるスルフィド化合物が発生する。
その中でも、マイコバクテリウム属細菌及びブレブンディモナス属細菌からなる群より選択される１種以上の微生物を含むことがさらに好ましく、マイコバクテリウム属細菌を含むことが特に好ましい。
マイコバクテリウム属細菌を含むことで、洗濯槽から発生する臭気成分に含まれるスルフィド化合物が発生する。
さらに、本発明のインビトロバイオフィルムにおいては、マイコバクテリウム属細菌、ブレブンディモナス属細菌、メチロバクテリウム属細菌、及びスフィンゴモナス属細菌からなる群より選択される１種以上の微生物と、シュードモナス属細菌と、の両方を含むことがより好ましい。
その中でも、マイコバクテリウム属細菌及びブレブンディモナス属細菌からなる群より選択される１種以上の微生物と、シュードモナス属細菌と、の両方を含むことがさらに好ましく、マイコバクテリウム属細菌とシュードモナス属細菌との両方を含むことが特に好ましい。
その中でも、マイコバクテリウム属細菌及びブレブンディモナス属細菌からなる群より選択される１種以上の微生物と、シュードモナス属細菌と、の両方を含むことがさらに好ましく、マイコバクテリウム属細菌とシュードモナス属細菌との両方を含むことが特に好ましい。
かかるインビトロバイオフィルムに含まれる微生物として、より具体的には、アシドボラクス・アベナエ（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ａｖｅｎａｅ）、アシドボラクス・ラディシス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ｒａｄｉｃｉｓ）、アシネトバクター・セプティクス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｅｐｔｉｃｕｓ）、アクチノマイストスポラ・クロラ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｏｓｐｏｒａ ｃｈｌｏｒａ）、アクチノマイストスポラ・ルテア（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｏｓｐｏｒａ ｌｕｔｅａ）、ブレブンディモナス・エスピー（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｓｐ.）、ブレブンディモナス・ベシクラリス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｖｅｓｉｃｕｌａｒｉｓ）、バークホルデリア・プランタリ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｌａｎｔａｒｉｉ）、エンハイドロバクター・アエロサックス（Ｅｎｈｙｄｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｓａｃｃｕｓ）、ゴルドニア・ポリイソプレニボランス（Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓ）、ゴルドニア・エスピー（Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｓｐ.）、ゴルドニア・スプチ（Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｓｐｕｔｉ）、ヘルバスピリルム・セロペディカ（Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｅｒｏｐｅｄｉｃａｅ）、ジャニバクター・エスピー（Ｊａｎｉｂａｃｔｅｒ ｓｐ.）、メチロバクテリウム・アクアチクム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｑｕａｔｉｃｕｍ）、メチロバクテリウム・ブラチアツム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、メチロバクテリウム・ポダリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｏｄａｒｉｕｍ）、メチロバクテリウム・サルスギニス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｌｓｕｇｉｎｉｓ）、メチロバクテリウム・エスピー（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ.）、メチロバクテリウム・バリアビレ（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖａｒｉａｂｉｌｅ）、ミクロバクテリウム・スケレイフェリ（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｃｈｌｅｉｆｅｒｉ）、ミクロバクテリウム・エスピー（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ.）、モラクセラ・オスロエンシス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｏｓｌｏｅｎｓｉｓ）、モラクセラ・エスピー（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｓｐ.）、マイコバクテリウム・フォーチュイツム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）、マイコバクテリウム・エスピー（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ.）、マイコバクテリウム・バンバアレニイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖａｎｂａａｌｅｎｉｉ）、ノルカディア・エスピー（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｓｐ.）、パラコッカス・イー（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｙｅｅｉ）、シュードモナス・アルカリゲネス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シュードモナス・アルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・オレオボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）、シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ.）、シュードノカルディア・ディオキサニボランス（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ ｄｉｏｘａｎｉｖｏｒａｎｓ）、シュードキサンモナス・メキシカーナ（Ｐｓｅｕｄｏｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｍｅｘｉｃａｎａ）、ラルストニア・エスピー（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｐ.）、ロドコッカス・エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ.）、スフィンゴビウム・エスピー（Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ｓｐ.）、スフィンゴモナス・アサッカロリティカ（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ａｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃａ）、スフィンゴモナス・ドクドネンシス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｄｏｋｄｏｎｅｎｓｉｓ）、スフィンゴモナス・エスピー（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｓｐ.）、スフィンゴモナス・ユンナネンシス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・エピデルミデス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、テトラコッカス・セッチ（Ｔｅｔｒａｃｏｃｃｕｓ ｃｅｃｈｉｉ）、バリオボラックス・パラドクス（Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ ｐａｒａｄｏｘｕｓ）、サッカロマイセス・セレビジエ（Ｓａｃｃａｌｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ロドトルラ・ムシラギノーサ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ）、ロドトルラ・スルーフィエ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｓｌｏｏｆｆｉａｅ）が挙げられる。
上記の中でも、かかるインビトロバイオフィルムに含まれる具体的な微生物としては、ブレブンディモナス・ベシクラリス、メチロバクテリウム・ブラチアツム、マイコバクテリウム・フォーチュイツム、シュードモナス・アルギノーサ、及びスフィンゴモナス・アサッカロリティカからなる群より選択される少なくとも１種が好ましい。
また、かかるインビトロバイオフィルムに含まれる菌種の組合せとしては、ブレブンディモナス・ベシクラリス、メチロバクテリウム・ブラチアツム、シュードモナス・アルギノーサ、スフィンゴモナス・アサッカロリティカ及びスタフィロコッカス・アウレウスからなる群より選択される少なくとも１種と、マイコバクテリウム・フォーチュイツムと、の組合せが好ましい。
この中でも、マイコバクテリウム・フォーチュイツム及びブレブンディモナス・ベシクラリスからなる群より選択される少なくとも１種と、メチロバクテリウム・ブラチアツム、シュードモナス・アルギノーサ及びスフィンゴモナス・アサッカロリティカからなる群より選択される少なくとも１種と、の組合せがより好ましい。
この中でも、マイコバクテリウム・フォーチュイツム及びブレブンディモナス・ベシクラリスからなる群より選択される少なくとも１種と、メチロバクテリウム・ブラチアツム、シュードモナス・アルギノーサ及びスフィンゴモナス・アサッカロリティカからなる群より選択される少なくとも１種と、の組合せがより好ましい。
［インビトロバイオフィルムの作製方法］
本発明のインビトロバイオフィルムは、例えば、微生物の培養液を用いて、支持体上で微生物を培養することにより作製される。
本発明のインビトロバイオフィルムは、例えば、微生物の培養液を用いて、支持体上で微生物を培養することにより作製される。
微生物としては、特に制限はなく、上記で例示したものが好適に用いられる。
本発明のインビトロバイオフィルムは、洗濯槽から発生する臭気を再現できることから、マイコバクテリウム属細菌、ブレブンディモナス属細菌、メチロバクテリウム属細菌、及びスフィンゴモナス属細菌からなる群より選択される１種以上を含む微生物群を培養して作製されたものが好ましい。この中でも、マイコバクテリウム属細菌及びブレブンディモナス属細菌からなる群より選択される１種以上を含む微生物群を培養して作製されたものがより好ましく、マイコバクテリウム属細菌を含む微生物群を培養して作製されたものがさらに好ましい。
本発明のインビトロバイオフィルムは、洗濯槽から発生する臭気を再現できることから、マイコバクテリウム属細菌、ブレブンディモナス属細菌、メチロバクテリウム属細菌、及びスフィンゴモナス属細菌からなる群より選択される１種以上を含む微生物群を培養して作製されたものが好ましい。この中でも、マイコバクテリウム属細菌及びブレブンディモナス属細菌からなる群より選択される１種以上を含む微生物群を培養して作製されたものがより好ましく、マイコバクテリウム属細菌を含む微生物群を培養して作製されたものがさらに好ましい。
また、本発明のインビトロバイオフィルムは、マイコバクテリウム属細菌、ブレブンディモナス属細菌、メチロバクテリウム属細菌、及びスフィンゴモナス属細菌からなる群より選択される１種以上の微生物と、シュードモナス属細菌と、の両方を含む微生物群を培養して作製されたものが好ましい。この中でも、マイコバクテリウム属細菌及びブレブンディモナス属細菌からなる群より選択される１種以上の微生物と、シュードモナス属細菌と、の両方を含む微生物群を培養して作製されたものがより好ましく、マイコバクテリウム属細菌とシュードモナス属細菌との両方を含む微生物群を培養して作製されたものが特に好ましい。
微生物の培養液を調製する際に用いる培地には、培地成分として、炭素源、窒素源、硫黄源が少なくとも含まれる。かかる培地としては、例えば、市販されている培地のほか、洗濯槽から採取された汚れを滅菌したものを栄養源として含ませたもの等が挙げられる。
かかる培地は、培地成分として、炭素源、窒素源、硫黄源、ミネラル源、ビタミン源を含むものが好ましい。
また、かかる培地は、菌を発育阻害する成分を含まないものが好ましい。菌を発育阻害する成分としては、アクリフラビン、胆汁塩、ブリリアントグリーン、クロラムフェニコール、ジクロラン、フクシン、塩化リチウム、ローズベンガル、セレナイト、アジ化ナトリウム、タージトール等が挙げられる。
好ましい培地としては、炭素もしくは窒素もしくは硫黄又はリンを含む有機化合物と、窒素もしくは硫黄又はリンを含む無機化合物と、カリウム化合物と、マグネシウム化合物と、カルシウム化合物と、ナトリウム化合物と、鉄分とを含み（但し、炭素、窒素及び硫黄からなる群より選択される少なくとも１種を含む）、アクリフラビン、胆汁塩、ブリリアントグリーン、クロラムフェニコール、ジクロラン、フクシン、塩化リチウム、ローズベンガル、セレナイト、アジ化ナトリウム又はタージトールを含まない培地である。
かかる培地は、培地成分として、炭素源、窒素源、硫黄源、ミネラル源、ビタミン源を含むものが好ましい。
また、かかる培地は、菌を発育阻害する成分を含まないものが好ましい。菌を発育阻害する成分としては、アクリフラビン、胆汁塩、ブリリアントグリーン、クロラムフェニコール、ジクロラン、フクシン、塩化リチウム、ローズベンガル、セレナイト、アジ化ナトリウム、タージトール等が挙げられる。
好ましい培地としては、炭素もしくは窒素もしくは硫黄又はリンを含む有機化合物と、窒素もしくは硫黄又はリンを含む無機化合物と、カリウム化合物と、マグネシウム化合物と、カルシウム化合物と、ナトリウム化合物と、鉄分とを含み（但し、炭素、窒素及び硫黄からなる群より選択される少なくとも１種を含む）、アクリフラビン、胆汁塩、ブリリアントグリーン、クロラムフェニコール、ジクロラン、フクシン、塩化リチウム、ローズベンガル、セレナイト、アジ化ナトリウム又はタージトールを含まない培地である。
また、培地には、液体培地を用いることが好ましい。
液体培地としては、水にペプトンと酵母エキスとが含まれているものが好ましい。かかる液体培地において、ペプトンの濃度は、水１Ｌに対して１〜２０ｇが好ましく、５〜１０ｇがより好ましい。酵母エキスの濃度は、水１Ｌに対して０．２〜４ｇが好ましく、１〜２ｇがより好ましい。
ペプトンと酵母エキスとの比率は、ペプトン／酵母エキスで表される質量比で０．２５〜５０が好ましく、２．５〜１０がより好ましい。
かかる液体培地は、ペプトン及び酵母エキスの他、任意成分を含むものでもよい。この任意成分としては、硫酸マグネシウム、リン酸カリウム、クエン酸ナトリウム等が挙げられる。硫酸マグネシウムを併用すると、バイオフィルム形成促進効果が得られる。
かかる液体培地の３０℃でのｐＨは、好ましくはｐＨ６〜８である。
液体培地としては、水にペプトンと酵母エキスとが含まれているものが好ましい。かかる液体培地において、ペプトンの濃度は、水１Ｌに対して１〜２０ｇが好ましく、５〜１０ｇがより好ましい。酵母エキスの濃度は、水１Ｌに対して０．２〜４ｇが好ましく、１〜２ｇがより好ましい。
ペプトンと酵母エキスとの比率は、ペプトン／酵母エキスで表される質量比で０．２５〜５０が好ましく、２．５〜１０がより好ましい。
かかる液体培地は、ペプトン及び酵母エキスの他、任意成分を含むものでもよい。この任意成分としては、硫酸マグネシウム、リン酸カリウム、クエン酸ナトリウム等が挙げられる。硫酸マグネシウムを併用すると、バイオフィルム形成促進効果が得られる。
かかる液体培地の３０℃でのｐＨは、好ましくはｐＨ６〜８である。
微生物の培養液中の微生物の濃度は、６００ｎｍの吸光度が光学密度（ＯＤ）で０．０１〜１が好ましい。
バイオフィルムが形成される支持体としては、例えば樹脂製チューブ、金属板など、硬表面を有するものが挙げられる。かかる支持体には、好ましくは合成樹脂体、金属体又はガラス体が用いられる。
支持体上で微生物を培養する際の温度条件は、２５〜３７℃が好ましく、２８〜３５℃がより好ましい。培養時間は、４８〜７２時間が好ましい。
支持体上で微生物を培養することで、支持体上にインビトロバイオフィルムが形成される。
上述した作製方法により、インビトロバイオフィルムが作製される。
上述した作製方法により、インビトロバイオフィルムが作製される。
以上説明したインビトロバイオフィルムは、洗濯槽から発生する臭気に含まれる成分である、一般式（１）で表される化合物、一般式（２）で表される化合物、及びピリジンからなる群より選択される１種以上を発生するものである。かかる本発明のインビトロバイオフィルムは、洗濯槽に形成されるバイオフィルムの評価モデルとして利用できる。
（洗浄剤の臭気除去効果の評価方法）
本発明の洗浄剤の臭気除去効果の評価方法は、上述した本発明のインビトロバイオフィルムを洗浄対象物とし、前記洗浄対象物を洗浄剤により洗浄する前と後で、前記インビトロバイオフィルムから発生する臭気成分の発生量を測定する方法である。
インビトロバイオフィルムから発生する臭気成分の発生量は、インビトロバイオフィルムから発生する臭気成分を捕集し、これを試料として高感度な機器により測定する方法のほか、気体検知管により測定できる。但し、ここで示される方法に限定されるものではない。
本発明の洗浄剤の臭気除去効果の評価方法は、上述した本発明のインビトロバイオフィルムを洗浄対象物とし、前記洗浄対象物を洗浄剤により洗浄する前と後で、前記インビトロバイオフィルムから発生する臭気成分の発生量を測定する方法である。
インビトロバイオフィルムから発生する臭気成分の発生量は、インビトロバイオフィルムから発生する臭気成分を捕集し、これを試料として高感度な機器により測定する方法のほか、気体検知管により測定できる。但し、ここで示される方法に限定されるものではない。
臭気成分を捕集する方法には、ポンプにより吸引することで捕集するアクティブサンプリング法、静置状態で捕集するパッシブサンプリング法などを用いることができる。例えば、ＤＨＳ（ダイナミックヘッドスペース）法、ＨＳ（ヘッドスペース）法、固相マイクロ抽出（ＳＰＭＥ）法等が挙げられ、ＴＥＮＡＸ捕集管、ＯＲＢＯチューブ、ＮｅｅｄｌＥｘ（濃縮用注射針）、Ｓｅｐ−Ｐａｋ（固相抽出製品）、Ｔｗｉｓｔｅｒ、ＴＤＵ等が用いられる。
中でも、臭気成分を捕集する方法としては、容器のヘッドスペースの臭気成分を固相マイクロ抽出（ＳＰＭＥ）法が、操作が簡便なことから好ましい。
中でも、臭気成分を捕集する方法としては、容器のヘッドスペースの臭気成分を固相マイクロ抽出（ＳＰＭＥ）法が、操作が簡便なことから好ましい。
高感度な機器により測定する方法には、例えば、ＧＣ−ＦＩＤ（ガスクロマトグラフィー−水素炎イオン検出器）、ＧＣ−ＭＳ（ガスクロマトグラフィー−質量分析計）、ＧＣ−ＡＥＤ（ガスクロマトグラフィー−原子発光検出器）、ＧＣ−ＳＣＤ（ガスクロマトグラフィー−化学発光硫黄検出器）、ＧＣ−ＮＰＤ（ガスクロマトグラフィー−窒素リン検出器）、ＧＣ−ＴＣＤ（ガスクロマトグラフィー−熱伝導度検出器）、ＧＣ−ＦＰＤ（ガスクロマトグラフィー−炎光光度検出器）、ＧＣ−ＮＣＤ（ガスクロマトグラフィー−化学発光窒素検出器）、ＧＣ−Ｏ（ガスクロマトグラフィー−オルファクトメーター）等を用いることができる。
本発明に係る評価方法では、インビトロバイオフィルムを洗浄剤により洗浄する前と後で、前記インビトロバイオフィルムから発生する臭気成分の発生量が測定される。
そして、前記のインビトロバイオフィルムから発生する臭気成分を指標とし、洗浄前後における、指標とされた臭気成分の発生量の差を比較することで、洗浄剤の臭気除去効果が評価される。
本発明に係る評価方法においては、指標とされる臭気成分が、前記一般式（１）で表される化合物、前記一般式（２）で表される化合物、及びピリジンからなる群より選択される１種以上であることが好ましい。これらの成分は、実際の洗濯槽から発生する臭気成分と同じである。
そして、前記のインビトロバイオフィルムから発生する臭気成分を指標とし、洗浄前後における、指標とされた臭気成分の発生量の差を比較することで、洗浄剤の臭気除去効果が評価される。
本発明に係る評価方法においては、指標とされる臭気成分が、前記一般式（１）で表される化合物、前記一般式（２）で表される化合物、及びピリジンからなる群より選択される１種以上であることが好ましい。これらの成分は、実際の洗濯槽から発生する臭気成分と同じである。
図１は、洗濯槽から発生する臭気についてのガスクロマトグラフィー−質量分析結果の一例を示す図である。横軸は保持時間（分）、縦軸は検出強度を示している。
図１では、ジメチルスルフィド、ジメチルジスルフィド（いずれも一般式（１）で表される化合物）、ピリジンの各ピークが認められる。
スルフィド化合物は、洗濯槽から発生する臭気成分として特に検出されやすいことから、指標とする臭気成分に好適である。
図１では、ジメチルスルフィド、ジメチルジスルフィド（いずれも一般式（１）で表される化合物）、ピリジンの各ピークが認められる。
スルフィド化合物は、洗濯槽から発生する臭気成分として特に検出されやすいことから、指標とする臭気成分に好適である。
洗浄剤としては、特に制限されず、例えば、衣料用洗浄剤、洗濯槽用洗浄剤、浴室用洗浄剤、台所用洗浄剤などが挙げられる。
以上説明した、洗浄剤の臭気除去効果の評価方法によれば、洗濯槽に形成されるバイオフィルムに対する洗浄剤の臭気除去効果を、インビトロバイオフィルムを用いて簡便に評価できる。
好ましくは、本発明に係る評価方法によれば、洗濯槽に実在する微生物を培養して作製されたインビトロバイオフィルムを用い、実際の洗濯槽から発生する臭気成分を指標として、洗浄剤の臭気除去効果を評価できる。
また、本発明に係る評価方法は、洗濯機の実機を使用することなく洗濯槽から発生する臭気を評価できるため、臭気除去に有効な成分の探索に活用できる。
好ましくは、本発明に係る評価方法によれば、洗濯槽に実在する微生物を培養して作製されたインビトロバイオフィルムを用い、実際の洗濯槽から発生する臭気成分を指標として、洗浄剤の臭気除去効果を評価できる。
また、本発明に係る評価方法は、洗濯機の実機を使用することなく洗濯槽から発生する臭気を評価できるため、臭気除去に有効な成分の探索に活用できる。
以下に実施例を用いて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。なお、「％」は特に断りがない限り「質量％」を示す。
＜洗濯槽から発生する臭気成分の測定＞
洗濯が繰り返し行われ、臭気が発生している洗濯機を用意した。
臭気が発生している洗濯機を解体し、洗濯槽に付着した汚れ（バイオフィルム等）をスパチュラで掻き取り、採取した。
そして、この汚れ２ｇとイオン交換水１ｍＬとを容量２０ｍＬのヘッドスペース用クリンプバイアル瓶に封入し、３７℃下で２４時間静置した。
この後、前記静置後のヘッドスペース用クリンプバイアル瓶におけるヘッドスペースの臭気成分を固相マイクロ抽出（ＳＰＭＥ）法により抽出した。すなわち、ヘッドスペースの臭気成分をＳＰＭＥファイバーに吸着させて検体とし、ガスクロマトグラフ質量分析計（ＧＣ−ＭＳ）測定に供した。ＳＰＭＥ条件、及び、ＧＣ−ＭＳ測定の条件は以下の通りである。
洗濯が繰り返し行われ、臭気が発生している洗濯機を用意した。
臭気が発生している洗濯機を解体し、洗濯槽に付着した汚れ（バイオフィルム等）をスパチュラで掻き取り、採取した。
そして、この汚れ２ｇとイオン交換水１ｍＬとを容量２０ｍＬのヘッドスペース用クリンプバイアル瓶に封入し、３７℃下で２４時間静置した。
この後、前記静置後のヘッドスペース用クリンプバイアル瓶におけるヘッドスペースの臭気成分を固相マイクロ抽出（ＳＰＭＥ）法により抽出した。すなわち、ヘッドスペースの臭気成分をＳＰＭＥファイバーに吸着させて検体とし、ガスクロマトグラフ質量分析計（ＧＣ−ＭＳ）測定に供した。ＳＰＭＥ条件、及び、ＧＣ−ＭＳ測定の条件は以下の通りである。
［ＳＰＭＥ条件］
ＳＰＭＥファイバーとして、ＤＶＢ／ＣＡＲ／ＰＤＭＳ（スペルコ・シグマアルドリッチ社製）を用いた。
平衡条件：３７℃で３０分間、吸着条件：３７℃で３０分間。
ＳＰＭＥファイバーとして、ＤＶＢ／ＣＡＲ／ＰＤＭＳ（スペルコ・シグマアルドリッチ社製）を用いた。
平衡条件：３７℃で３０分間、吸着条件：３７℃で３０分間。
［ＧＣ−ＭＳ測定の条件］
ＧＣ条件
機種：ＧＣＭＳ−ＱＰ２０１０（株式会社島津製作所製）。
使用カラム：ＩｎｅｒｔＣａｐ ｆｏｒ Ａｍｉｎｅｓ（ジーエルサイエンス株式会社製）、長さ６０ｍ、内径０．３２ｍｍ。
昇温条件：６０℃で５分間ホールドの後、２０℃／分で昇温し、２５０℃で１０分間ホールド。
ＭＳ条件
スキャンモード：ｍ／ｚ＝２９〜３００。
電子イオン化（ＥＩ）：７０ｅＶ。
ＧＣ条件
機種：ＧＣＭＳ−ＱＰ２０１０（株式会社島津製作所製）。
使用カラム：ＩｎｅｒｔＣａｐ ｆｏｒ Ａｍｉｎｅｓ（ジーエルサイエンス株式会社製）、長さ６０ｍ、内径０．３２ｍｍ。
昇温条件：６０℃で５分間ホールドの後、２０℃／分で昇温し、２５０℃で１０分間ホールド。
ＭＳ条件
スキャンモード：ｍ／ｚ＝２９〜３００。
電子イオン化（ＥＩ）：７０ｅＶ。
そして、それぞれ既知濃度の標準物質の面積値から、臭気成分の測定を行った。
ＧＣ−ＭＳ測定により得られたピークの保持時間及びマススペクトルから、臭気成分を以下のように同定した。
保持時間 ５．６分のピーク、ｍ／ｚ＝４７ メチルメルカプタン。
保持時間 ８．１分のピーク、ｍ／ｚ＝６２ ジメチルスルフィド。
保持時間１２．６分のピーク、ｍ／ｚ＝７９ ピリジン。
保持時間１２．８分のピーク、ｍ／ｚ＝９４ ジメチルジスルフィド。
すなわち、汚れた洗濯槽から発生する臭気は、メチルメルカプタン、ジメチルスルフィド、ピリジン、ジメチルジスルフィドを含んでいることが確認された。
ＧＣ−ＭＳ測定により得られたピークの保持時間及びマススペクトルから、臭気成分を以下のように同定した。
保持時間 ５．６分のピーク、ｍ／ｚ＝４７ メチルメルカプタン。
保持時間 ８．１分のピーク、ｍ／ｚ＝６２ ジメチルスルフィド。
保持時間１２．６分のピーク、ｍ／ｚ＝７９ ピリジン。
保持時間１２．８分のピーク、ｍ／ｚ＝９４ ジメチルジスルフィド。
すなわち、汚れた洗濯槽から発生する臭気は、メチルメルカプタン、ジメチルスルフィド、ピリジン、ジメチルジスルフィドを含んでいることが確認された。
＜インビトロバイオフィルムの作製＞
以下に列挙する微生物を微生物供託機関より入手し、バイオフィルムの作製を行った。
マイコバクテリウム・フォーチュイツム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）ＮＢＲＣ １３１５９、
ブレブンディモナス・ベシクラリス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｖｅｓｉｃｕｌａｒｉｓ）ＮＢＲＣ １２１６５、
スフィンゴモナス・アサッカロリティカ（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ａｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃａ）ＮＢＲＣ １５４９９、
メチロバクテリウム・ブラシアツム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）ＮＢＲＣ １０３６２９、
シュードモナス・アルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＮＢＲＣ １３２７５。
以下に列挙する微生物を微生物供託機関より入手し、バイオフィルムの作製を行った。
マイコバクテリウム・フォーチュイツム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）ＮＢＲＣ １３１５９、
ブレブンディモナス・ベシクラリス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｖｅｓｉｃｕｌａｒｉｓ）ＮＢＲＣ １２１６５、
スフィンゴモナス・アサッカロリティカ（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ａｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃａ）ＮＢＲＣ １５４９９、
メチロバクテリウム・ブラシアツム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）ＮＢＲＣ １０３６２９、
シュードモナス・アルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＮＢＲＣ １３２７５。
入手したそれぞれの菌株を、Ｒ２Ａ寒天培地（日本製薬株式会社製）に加え、３０℃で４８−７２時間の条件で前培養を行った。
次いで、コロニー形成したものから極少量の菌塊を採取し、該菌塊を、滅菌済みの白金耳を用いて新たに調製した液体培地に加え、１００ｒｐｍ及び３０℃で４８時間の条件で振とう培養を行った。
前記液体培地としてＲ２Ａ培地（日本製薬株式会社製；イオン交換水１Ｌに対し、ペプトン０．５ｇと、酵母エキス０．５ｇと、硫酸マグネシウム７水塩０．０５ｇと、リン酸１水素カリウム０．３ｇとを含有し、３０℃でのｐＨ７．０〜７．４である培地）を用いた。
次いで、前記の振とう培養後の菌液を、新たな前記液体培地に加え、菌の濃度を６００ｎｍの吸光度で１．０（ＯＤ＝１．０）に調整した培養液を得た。
次いで、コロニー形成したものから極少量の菌塊を採取し、該菌塊を、滅菌済みの白金耳を用いて新たに調製した液体培地に加え、１００ｒｐｍ及び３０℃で４８時間の条件で振とう培養を行った。
前記液体培地としてＲ２Ａ培地（日本製薬株式会社製；イオン交換水１Ｌに対し、ペプトン０．５ｇと、酵母エキス０．５ｇと、硫酸マグネシウム７水塩０．０５ｇと、リン酸１水素カリウム０．３ｇとを含有し、３０℃でのｐＨ７．０〜７．４である培地）を用いた。
次いで、前記の振とう培養後の菌液を、新たな前記液体培地に加え、菌の濃度を６００ｎｍの吸光度で１．０（ＯＤ＝１．０）に調整した培養液を得た。
（実施例１〜５）
表２に示すように、上記で得られた各微生物の培養液を、単独で用いた菌液、又は混合した菌液をそれぞれ調製した。
調製された菌液１ｍＬを、容量２ｍＬのポリプロピレン製エッペンドルフチューブに分注し、３０℃で４８時間の条件で培養を行うことにより、チューブ内壁にバイオフィルムを形成させた。
培養後、菌液を除去し、外観上乾燥するまで室温下で静置した。その後、蒸留水２ｍＬでリンス２回を行い、各例のインビトロバイオフィルムをそれぞれ得た。
表２に示すように、上記で得られた各微生物の培養液を、単独で用いた菌液、又は混合した菌液をそれぞれ調製した。
調製された菌液１ｍＬを、容量２ｍＬのポリプロピレン製エッペンドルフチューブに分注し、３０℃で４８時間の条件で培養を行うことにより、チューブ内壁にバイオフィルムを形成させた。
培養後、菌液を除去し、外観上乾燥するまで室温下で静置した。その後、蒸留水２ｍＬでリンス２回を行い、各例のインビトロバイオフィルムをそれぞれ得た。
＜洗浄剤の臭気除去効果の評価＞
上記で得られた各例のインビトロバイオフィルム（洗浄前）から発生する臭気成分の測定をそれぞれ行った。
次いで、各例のインビトロバイオフィルムを洗浄対象物とし、該洗浄対象物を、処理剤によりそれぞれ洗浄した。
次いで、洗浄後のインビトロバイオフィルムから発生する臭気成分の測定を行った。
上記で得られた各例のインビトロバイオフィルム（洗浄前）から発生する臭気成分の測定をそれぞれ行った。
次いで、各例のインビトロバイオフィルムを洗浄対象物とし、該洗浄対象物を、処理剤によりそれぞれ洗浄した。
次いで、洗浄後のインビトロバイオフィルムから発生する臭気成分の測定を行った。
尚、処理剤には、洗浄剤又は水を用いた。
洗浄剤として、表１に示した組成物０．１ｇを水３００ｇに添加して撹拌したものを用いた。表１に示した組成物に配合されている成分には、以下に示すものを用いた。
洗浄剤として、表１に示した組成物０．１ｇを水３００ｇに添加して撹拌したものを用いた。表１に示した組成物に配合されている成分には、以下に示すものを用いた。
ＭＥＥ：ヤシ脂肪酸メチル（質量比でラウリン酸メチル／ミリスチン酸メチル＝８／２の混合物）に、アルコキシル化触媒を用いて、１５モル相当のエチレンオキシドを付加したもの。
ＡＥ：アルコールエトキシレート、次の化学式「Ｒａ−Ｏ−（ＥＯ）ｂ−Ｈ」で表される化合物。式中のＲａ＝炭素数１２，１４のアルキル基、ｂ＝１５。
ＬＡＳ：直鎖アルキル（炭素数１０〜１４）ベンゼンスルホン酸Ｎａ、商品名「ライポンＬＨ−２００」（ライオン株式会社製；ＬＡＳ−Ｈ、純分９６質量％、平均分子量３２２）を、ｐＨ調整剤である水酸化ナトリウムにより中和し、ナトリウム塩としたもの。
エタノール：商品名「特定アルコール９５度合成」、日本アルコール販売株式会社製。
ｐ−トルエンスルホン酸：商品名「ＰＴＳ酸」、協和発酵キリン株式会社製。
プロテアーゼ：Ｃｏｒｏｎａｓｅ ４８Ｌ（ノボザイムズ社製）。
ｐＨ調整剤：水酸化ナトリウム（鶴見曹達株式会社製）又は塩酸（純正化学株式会社製）。組成物のｐＨを７．０に調整するために適量（０．１〜３質量％）を添加した。
水：精製水。配合した量は残部（液体洗浄剤の総量を１００質量％とするための量）。
ＡＥ：アルコールエトキシレート、次の化学式「Ｒａ−Ｏ−（ＥＯ）ｂ−Ｈ」で表される化合物。式中のＲａ＝炭素数１２，１４のアルキル基、ｂ＝１５。
ＬＡＳ：直鎖アルキル（炭素数１０〜１４）ベンゼンスルホン酸Ｎａ、商品名「ライポンＬＨ−２００」（ライオン株式会社製；ＬＡＳ−Ｈ、純分９６質量％、平均分子量３２２）を、ｐＨ調整剤である水酸化ナトリウムにより中和し、ナトリウム塩としたもの。
エタノール：商品名「特定アルコール９５度合成」、日本アルコール販売株式会社製。
ｐ−トルエンスルホン酸：商品名「ＰＴＳ酸」、協和発酵キリン株式会社製。
プロテアーゼ：Ｃｏｒｏｎａｓｅ ４８Ｌ（ノボザイムズ社製）。
ｐＨ調整剤：水酸化ナトリウム（鶴見曹達株式会社製）又は塩酸（純正化学株式会社製）。組成物のｐＨを７．０に調整するために適量（０．１〜３質量％）を添加した。
水：精製水。配合した量は残部（液体洗浄剤の総量を１００質量％とするための量）。
インビトロバイオフィルムの洗浄、臭気成分の測定は、それぞれ以下に示すようにして行った。
［インビトロバイオフィルムの洗浄］
コントロール品の調製：
インビトロバイオフィルムが形成したポリプロピレン製エッペンドルフチューブに、蒸留水２ｍＬを加え、室温下で３０分間静置した。その後、加えた蒸留水を前記エッペンドルフチューブから除去し、蒸留水２ｍＬでリンス２回を行い、これをコントロール品とした。
コントロール品の調製：
インビトロバイオフィルムが形成したポリプロピレン製エッペンドルフチューブに、蒸留水２ｍＬを加え、室温下で３０分間静置した。その後、加えた蒸留水を前記エッペンドルフチューブから除去し、蒸留水２ｍＬでリンス２回を行い、これをコントロール品とした。
試験品の調製：
インビトロバイオフィルムが形成したポリプロピレン製エッペンドルフチューブに、処理剤２ｍＬを加え、室温下で３０分間静置した。その後、加えた処理剤を前記エッペンドルフチューブから除去し、蒸留水２ｍＬでリンス２回を行い、これを試験品とした。
インビトロバイオフィルムが形成したポリプロピレン製エッペンドルフチューブに、処理剤２ｍＬを加え、室温下で３０分間静置した。その後、加えた処理剤を前記エッペンドルフチューブから除去し、蒸留水２ｍＬでリンス２回を行い、これを試験品とした。
ブランク品の調製：
菌液を加えず、前記液体培地２ｍＬのみを、容量２ｍＬのエッペンドルフチューブに分注し、３０℃で４８時間の条件で培養を行った後、蒸留水２ｍＬでリンス２回を行い、これをブランク品とした。
菌液を加えず、前記液体培地２ｍＬのみを、容量２ｍＬのエッペンドルフチューブに分注し、３０℃で４８時間の条件で培養を行った後、蒸留水２ｍＬでリンス２回を行い、これをブランク品とした。
［インビトロバイオフィルムから発生する臭気成分の測定］
インビトロバイオフィルムが形成したポリプロピレン製エッペンドルフチューブを、イオン交換水１ｍＬと０．５ｇのＮａＣｌとが加えられた容量２０ｍＬのヘッドスペース用クリンプバイアル瓶に封入し、３７℃下で２４時間静置した。
この後、前記静置後のスクリューバイアル瓶におけるヘッドスペースの臭気成分をＳＰＭＥファイバーに吸着させて検体とし、ＧＣ−ＭＳ測定に供した。ＳＰＭＥ条件、及び、ＧＣ−ＭＳ測定の条件は上記と同様である。
そして、各標準物質の溶出時間と質量情報から、臭気成分を定性し、指標とする臭気成分の発生量を求めた。
インビトロバイオフィルムが形成したポリプロピレン製エッペンドルフチューブを、イオン交換水１ｍＬと０．５ｇのＮａＣｌとが加えられた容量２０ｍＬのヘッドスペース用クリンプバイアル瓶に封入し、３７℃下で２４時間静置した。
この後、前記静置後のスクリューバイアル瓶におけるヘッドスペースの臭気成分をＳＰＭＥファイバーに吸着させて検体とし、ＧＣ−ＭＳ測定に供した。ＳＰＭＥ条件、及び、ＧＣ−ＭＳ測定の条件は上記と同様である。
そして、各標準物質の溶出時間と質量情報から、臭気成分を定性し、指標とする臭気成分の発生量を求めた。
［臭気洗浄率の算出］
上記のインビトロバイオフィルムから発生する臭気成分の測定を３回行い、各臭気成分の発生量の平均値を求めた。
各臭気成分について、前記の平均値を用い、処理剤によるインビトロバイオフィルムの臭気洗浄率を下式より算出した。
上記のインビトロバイオフィルムから発生する臭気成分の測定を３回行い、各臭気成分の発生量の平均値を求めた。
各臭気成分について、前記の平均値を用い、処理剤によるインビトロバイオフィルムの臭気洗浄率を下式より算出した。
処理剤によるインビトロバイオフィルムの臭気洗浄率（％）
＝（コントロール品での濃度−試験品での濃度）／（コントロール品での濃度−ブランク品での濃度）×１００
＝（コントロール品での濃度−試験品での濃度）／（コントロール品での濃度−ブランク品での濃度）×１００
各例のインビトロバイオフィルムに対する、処理剤の臭気除去効果を、以下に示す評価基準に従って評価した。その結果を表２に示した。
評価基準
◎：臭気洗浄率が７０％以上。
○：臭気洗浄率が５０％以上７０％未満。
△：臭気洗浄率が３０％以上５０％未満。
×：臭気洗浄率が３０％未満。
評価基準
◎：臭気洗浄率が７０％以上。
○：臭気洗浄率が５０％以上７０％未満。
△：臭気洗浄率が３０％以上５０％未満。
×：臭気洗浄率が３０％未満。
表２に示す結果から、実施例１〜５のインビトロバイオフィルムから、汚れた洗濯槽から発生する臭気成分と同一の成分が発生していること、が確認できる。
これより、本発明を適用したインビトロバイオフィルムによれば、洗濯槽に形成されるバイオフィルムの評価モデルを提供できる、と言える。
また、本発明に係る評価方法を適用することにより、洗濯槽に形成されるバイオフィルムに対する洗浄剤の臭気除去効果を、インビトロバイオフィルムを用いて簡便に評価できること、が確認された。
これより、本発明を適用したインビトロバイオフィルムによれば、洗濯槽に形成されるバイオフィルムの評価モデルを提供できる、と言える。
また、本発明に係る評価方法を適用することにより、洗濯槽に形成されるバイオフィルムに対する洗浄剤の臭気除去効果を、インビトロバイオフィルムを用いて簡便に評価できること、が確認された。
Claims (10)
- 下記一般式（１）で表される化合物、下記一般式（２）で表される化合物、及びピリジンからなる群より選択される１種以上を発生する、インビトロバイオフィルム。
- マイコバクテリウム属細菌、ブレブンディモナス属細菌、メチロバクテリウム属細菌、及びスフィンゴモナス属細菌からなる群より選択される１種以上の微生物を含む、請求項１に記載のインビトロバイオフィルム。
- マイコバクテリウム属細菌及びブレブンディモナス属細菌からなる群より選択される１種以上の微生物を含む、請求項２に記載のインビトロバイオフィルム。
- さらに、シュードモナス属細菌を含む、請求項２又は請求項３に記載のインビトロバイオフィルム。
- マイコバクテリウム属細菌、ブレブンディモナス属細菌、メチロバクテリウム属細菌、及びスフィンゴモナス属細菌からなる群より選択される１種以上を含む微生物群を培養して作製された、請求項１に記載のインビトロバイオフィルム。
- マイコバクテリウム属細菌及びブレブンディモナス属細菌からなる群より選択される１種以上を含む微生物群を培養して作製された、請求項５に記載のインビトロバイオフィルム。
- 前記微生物群は、さらに、シュードモナス属細菌を含む、請求項５又は請求項６に記載のインビトロバイオフィルム。
- 合成樹脂体、金属体又はガラス体の表面に作製された、請求項１〜７のいずれか一項に記載のインビトロバイオフィルム。
- 請求項１〜８のいずれか一項に記載のインビトロバイオフィルムを洗浄対象物とし、
前記洗浄対象物を洗浄剤により洗浄する前と後で、前記インビトロバイオフィルムから発生する臭気成分の発生量を測定する、洗浄剤の臭気除去効果の評価方法。 - 前記のインビトロバイオフィルムから発生する臭気成分が、前記一般式（１）で表される化合物、前記一般式（２）で表される化合物、及びピリジンからなる群より選択される１種以上である、請求項９に記載の洗浄剤の臭気除去効果の評価方法。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20150105637A (ko) * | 2012-12-21 | 2015-09-17 | 현대자동차주식회사 | 무취 미생물을 포함하는 냄새 방지용 조성물 |
| CN111423999A (zh) * | 2020-04-15 | 2020-07-17 | 深圳合民生物科技有限公司 | 宠物及其生活环境用抑菌去味微生物制剂及其制备方法和应用 |
| JP2021048779A (ja) * | 2019-09-24 | 2021-04-01 | 小林製薬株式会社 | 黒ずみ形成方法 |
| CN114990005A (zh) * | 2022-04-25 | 2022-09-02 | 中国科学院生态环境研究中心 | 降解菲的复合菌群及其制备方法和应用 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003119663A (ja) * | 2001-10-12 | 2003-04-23 | Lion Corp | 洗濯方法及び洗剤組成物 |
| JP2004231671A (ja) * | 2002-12-03 | 2004-08-19 | Lion Corp | 洗浄剤組成物及び除菌・洗浄力評価方法 |
-
2015
- 2015-03-06 JP JP2015045157A patent/JP2016163551A/ja active Pending
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|---|
| 2015年度日本農芸化学会大会講演要旨集, vol. 平成27年3月5日，3A37p12, JPN6018033431, ISSN: 0003988100 * |
| 2015年度日本農芸化学会大会講演要旨集, vol. 平成27年3月5日，3A37p13, JPN6018033433, ISSN: 0003988101 * |
| CURRENT MICROBIOLOGY, 2000, VOL.41, PP.206-209, JPN6018033434, ISSN: 0003988102 * |
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| US10716872B2 (en) | 2012-12-21 | 2020-07-21 | Hyundai Motor Company | Composition for preventing odors containing odorless microorganism |
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| JP7370203B2 (ja) | 2019-09-24 | 2023-10-27 | 小林製薬株式会社 | 黒ずみ形成方法 |
| CN111423999A (zh) * | 2020-04-15 | 2020-07-17 | 深圳合民生物科技有限公司 | 宠物及其生活环境用抑菌去味微生物制剂及其制备方法和应用 |
| CN114990005A (zh) * | 2022-04-25 | 2022-09-02 | 中国科学院生态环境研究中心 | 降解菲的复合菌群及其制备方法和应用 |
| CN114990005B (zh) * | 2022-04-25 | 2023-09-26 | 中国科学院生态环境研究中心 | 降解菲的复合菌群及其制备方法和应用 |
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