CN111100818B

CN111100818B - 高地芽孢杆菌swy137及其应用

Info

Publication number: CN111100818B
Application number: CN202010039717.2A
Authority: CN
Inventors: 郭岩彬; 张云鸽; 王秀艳; 邢明振; 侯秀亭
Original assignee: Xinjiang Genliduo Biotechnology Co ltd
Current assignee: Xinjiang Genliduo Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-01-10
Filing date: 2020-01-10
Publication date: 2023-05-12
Anticipated expiration: 2040-01-10
Also published as: CN111100818A

Abstract

本发明公开了高地芽孢杆菌SWY137及其应用。菌株SWY137保藏号为CCTCC NO：M 2019842，为耐盐高地芽孢杆菌，该菌在13％的NaCl高盐溶液中生长良好，能够溶解难溶性有机磷和无机磷，还可以产生纤维素酶、蛋白酶、生长素等多种促生物质。以玉米为例，菌株SWY137对植物的促生效果明显，可以使玉米苗茎高增加27.67％，根长增加32.23％，茎鲜重增加51.33％，根鲜重增加60.67％，茎干重增加33.33％，根干重增加34.88％，且其促生增产效果不受施用化肥的影响，对我国农业生产节约磷肥资源，粮食持续增产和保护农田生态环境具有重要意义。

Description

高地芽孢杆菌SWY137及其应用

技术领域

本发明涉及农业微生物学，具体地说，涉及一株高地芽孢杆菌SWY137及其应用。

背景技术

盐碱化属于土地荒漠化的一种，致使土壤肥力下降，植物根系吸水困难，严重影响畜牧业和农业的发展。目前，全世界有过亿公顷的土地存在盐碱化的问题，每年给世界的粮食生产造成严重的损失，并严重影响到地区的生态平衡。在我国，盐碱土的分布范围广、面积大、类型多，日渐成为限制我国农业发展的主要因素。近几十年的研究显示，利用生物措施改良盐碱地成为目前备受关注的措施之一。

根际促生菌是指在一定条件下有利于植物生长的自由生活在土壤、根际、根表的细菌。这些细菌能够固氮、溶磷、解钾，并产生植物激素，如生长素、赤霉素、细胞分裂素，此外，它们还可以抑制病原微生物的生长，诱导植物抗性，提高作物抗逆性。

已有的研究表明，高地芽孢杆菌是一种很好的生防菌，包括能有效防治番茄根结线虫危害，对星油藤根茎腐病具有很好的防治效果，也有研究表明高地芽孢杆菌具有修复底泥污染的作用。但未见其在植物促生、溶解土壤难溶磷、促进植物磷吸收的研究报道，特别是在高盐条件下促进植物的生长、提高作物抗逆性，在盐碱地修复的研究报道。

发明内容

本发明的目的是提供一株高地芽孢杆菌SWY137及其应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供从河北邢台威县根力多生物科技股份有限公司试验示范基地采集的土壤中分离出一株耐盐的高地芽孢杆菌SWY137(Bacillusaltitudinis SWY137)，菌株SWY137是一种高效溶磷促生菌，能够在13％的NaCl高盐溶液中很好地生长，且在含15％NaCl的固体平板上可以很好地生长。该菌现已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号CCTCC NO：M 2019842，保藏日期2019年10月21日。

第二方面，本发明提供含有所述高地芽孢杆菌SWY137的菌剂。

第三方面，本发明提供由所述高地芽孢杆菌SWY137分泌产生的促生物质，如生长素(IAA)等。

第四方面，本发明提供由所述高地芽孢杆菌SWY137分泌产生的酶，所述酶包括但不限于纤维素酶、蛋白酶。

第五方面，本发明提供由所述高地芽孢杆菌SWY137或其菌剂制备的农用肥料、磷素活化剂或植物促生长剂。

第六方面，本发明提供所述高地芽孢杆菌SWY137或其菌剂的以下任一应用：

1)用于促进植物生长发育以及提高作物产量；

2)用于提高植物抗逆性；

3)用于溶磷；

4)用于制备农用肥料；

5)用于制备磷素活化剂；

6)用于制备植物促生长剂。

本发明中所述植物包括但不限于玉米、小麦、大豆、黄瓜。

所述提高植物抗逆性是指提高植物体抗病、抗旱、抗盐胁迫等抗逆性。

第七方面，本发明提供所述高地芽孢杆菌SWY137或其菌剂在高盐条件下溶解难溶磷中的应用。

前述的应用，所述高盐条件是指NaCl的浓度为13％～15％。

前述的应用，所述难溶磷为难溶性有机磷和无机磷，如植酸钙、卵磷脂、磷酸钙等。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明提供的耐盐高地芽孢杆菌SWY137，该菌在13％的NaCl高盐溶液中生长良好，能够溶解难溶性有机磷和无机磷，还可以产生纤维素酶、蛋白酶、生长素等多种促生物质。以玉米(郑单958)为例，菌株SWY137对植物的促生效果明显，可以使玉米苗茎高增加27.67％，根长增加32.23％，茎鲜重增加51.33％，根鲜重增加60.67％，茎干重增加33.33％，根干重增加34.88％。菌株SWY137应用在农作物种植中不仅能提高农作物产量，还能提高植物体抗病、抗旱等抗逆性，对我国粮食持续增产和保护农田生态环境具有重要意义。

附图说明

图1为本发明实施例2中菌株SWY137耐盐性测定结果。

图2为本发明实施例3中菌株SWY137的溶磷能力测定结果。

图3为本发明实施例4中菌株SWY137产蛋白酶的能力测定结果。

图4为本发明实施例5中菌株SWY137产纤维素酶能力的测定结果。

图5为本发明实施例8中菌株SWY137的植物促生效果。

图6为本发明实施例9中菌株SWY137提高植物抗逆效果。

图7为本发明实施例2中菌株SWY137在不同盐浓度下的生长情况。

图8为本发明实施例10中菌株SWY137在肥料上的衰减情况。

图9为本发明实施例1中菌株SWY137的16S rRNA基因的分子进化树。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1菌株SWY137的分离及鉴定

从河北邢台威县根力多生物科技股份有限公司试验示范基地采集土壤，取10g土样加入装有100ml无菌生理盐水的三角瓶中，静止20min后，28℃，200rpm摇床震荡30min，取1ml样本加入9ml无菌生理盐水中，再依次稀释10²，10³，10⁴倍，分别取以上土壤悬浮液100μl在高盐LB培养基(酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 50g/L，琼脂15g/L)平板上均匀涂板，28℃培养箱内培养48h，用无菌牙签挑取细菌单菌落划线纯化后，保存备用。

综合菌株SWY137的生理生化特性、分子生物学检测结果，将其鉴定为高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)。具体鉴定结果如下：

1、分子生物学鉴定

首先对菌株SWY137进行分子生物学的鉴定，使用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGAACGCT-3′和1492R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3′扩增其16S rRNA基因序列，并进行测序，测序结果如SEQ ID NO：1所示。

PCR反应体系为：2×Taq Mix 12.5μl，引物27F、1492R各1μl，DNA模板1μl，ddH₂O9.5μl。PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸5min。其中，Taq Mix购自TaKaRa公司。

PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，用OMEGA公司的纯化试剂盒GelExtraction Kit纯化回收后连接TaKaRa公司的T载体pMD18-T。用ABI 3730DNA测序仪进行测序，基因序列已提交至GenBank，收录号：MN559036。将序列用GEGA5进行分子进化树分析(图9)，根据进化树初步将SWY137判定为高地芽孢杆菌。

2、生理生化特性鉴定

在分子生物学检测的基础上，对菌株进行生理生化鉴定，首先对其进行革兰氏染色，结果显示菌株为革兰氏阳性；将菌活化后接种到pH5.0的培养基中，28℃培养48h，菌株SWY137可以生长；将菌活化后接种到培养基中，分别置于8℃、45℃下培养48h，可见有菌生长，表明菌株SWY137可在8℃-45℃条件下生长；将菌活化后接入淀粉的固体培养上，28℃培养48h后，用碘液染色，有无色透明圈出现，淀粉水解试验表明菌株SWY137为阳性；将菌株接种于明胶培养中，20℃培养7天，培养基出现融化现象，表明菌株SWY137明胶水解阳性；将菌活化后接种于硝酸盐液体培养基中，30℃培养1、3、5天，在白色磁盘小孔中倒入少许培养液，然后向其中分别滴1滴试剂A(对氨基苯磺酸0.5g溶于10％醋酸150mL)和试剂B(α-萘乙酸0.1g，溶于蒸馏水20mL和10％醋酸150mL)，观察培养液是否变为粉红色，试验结果显示菌株SWY137硝酸盐还原阴性；乙酰甲基甲醇(VP试验)，培养基、接种和菌种培养同甲基红试验。做VP试验时，取培养液(约2ml)与等量的40％NaOH混合，加少量肌酸，充分振荡2-5min后，如培养基出现红色，即为VP阳性。试验结果显示菌株SWY137为VP阴性。用枪头挑取单菌落放在载玻片上，加一滴3％H₂O₂溶液于菌落上，有气泡出现，表明菌株SWY137接触酶阳性；将菌株接种于脱脂牛奶平板培养基，室温培养1、3、5天观察，出现透明圈的为阳性，否则为阴性。酪蛋白水解试验显示菌株SWY137为阴性；在干净培养皿里放一张滤纸，滴加1％二甲基对苯撑二胺水溶液，仅使滤纸湿润。用白金丝接种环挑取一环菌苔，涂抹在湿润的滤纸上。在10sec内涂抹的菌苔出现红色，表明菌株SWY137氧化酶阳性；将活化后的菌株SYY15接种于西蒙斯氏柠檬酸盐试管斜面培养基，30℃培养3-7天，培养基变蓝者为阳性，否则为阴性。柠檬酸盐利用试验结果显示菌株SWY137为阴性。产生吲哚试验：将活化后的菌种接种于1％胰胨水液体培养基，取室温培养1、2、4、7的培养液，沿管壁缓缓加入3-5毫米高的对二甲基氨基苯甲醛试剂(对二甲基氨基苯甲醛溶液8g，95％酒精760ml，浓盐酸160ml)于培养液表面，在液层界面发生红色，即为阳性反应。产生吲哚试验结果显示菌株SWY137为阴性。菌株SWY137的生理生化检测结果如表1所示。根据进化树和生理生化结果可以将SWY137判定为高地芽孢杆菌。

表1菌株SWY137的生理生化检测结果

实施例2菌株SWY137耐盐性测定

首先将菌株在LB液体培养基上进行活化，将活化后的菌株按照1％的接种量接种到含5％、9％、13％、15％、17％的NaCl(w/v)的LB液体培养基中，28℃摇培48h，测定其OD600值。同时接种正常的LB培养基作为对照(CK)。结果表明，菌株SWY137在13％以下盐浓度的培养基中生长未受到明显抑制，在15％的NaCl溶液中才出现显著抑制(图7)。表明菌株SWY137可以很好地在含盐量13％的环境中生长(图1)。

实施例3菌株SWY137的溶磷能力测定

首先将菌株SWY137在LB培养基上活化。将活化后的菌株接种到NY/T 1847-2010微生物肥料生产菌株质量评价通用技术要求中附录A所示的溶磷培养基中(葡萄糖10.00g，(NH₄)₂SO₄ 0.50g，MnSO₄·7H₂O 0.3g，NaCl 0.3g，KCl 0.30g，FeSO₄·4H₂O 0.036g，MnSO₄·4H₂O 0.03g，植酸钙2g，蒸馏水1000mL，pH 7.0。固体培养基：按比例添加1.5％的琼脂粉)。检测是否具有溶磷功能，经检测，菌株SWY137具有溶解有机磷(植酸钙)的能力，溶解有机磷的溶解圈直径达到1.80cm(图2)。

在确定了菌株SWY137具有溶磷功能之后，再定量测定菌株的溶磷能力大小，将菌株在LB液体培养基上活化后，分别接种到液体的溶磷培养基和高盐溶磷培养基(溶磷培养基中氯化钠浓度为13％)中，28℃摇培7天，用钼锑抗比色法分别测定发酵上清液中的有效磷含量，取100μl上清液，放入50ml容量瓶中，用水稀释至约30ml，加入二硝基酚指示剂2滴，滴加4mol/L NaOH直至溶液刚转为黄色，再加入1mol/L H₂SO₄ 1滴，使溶液的黄色刚刚退去。加入5.00ml钼锑抗显色剂，用水定容，充分摇匀。在室温高于15℃处放置30min后，取200μl加至96孔板，用酶标仪在882nm波长处测量吸光度。

结果显示，本发明菌株在溶磷培养基和高盐溶磷培养基中溶解有机磷(植酸钙)的能力分别为达到110.68mg/L和105.23mg/L。在确定了菌株具有溶解有机磷的能力后，直接定量测定菌株溶解无机磷的能力，将培养基中的植酸钙改为磷酸钙，经测定，本发明菌株溶解无机磷的能力达到了70.25mg/L。

实施例4菌株SWY137产蛋白酶的能力测定

首先将菌株SWY137在LB培养基上活化，将活化后的菌株接种到蛋白酶检测用培养基上(胰蛋白胨5.00g，酵母提取物3.00g，葡萄糖1.00g，琼脂15.00g，蒸馏水1000mL，pH7.0，121℃高压灭菌30min。将灭菌的检测培养基冷却至约50℃时，将脱脂牛奶按10％的比例加入培养基混匀后倒入培养皿，待其冷却后备用)，28℃培养48h，观察有无溶解圈出现，结果显示菌株SWY137具有很好的溶解蛋白的能力，高产蛋白酶，其溶解圈直径达到3.32cm(图3)。利用菌株SWY137高产蛋白酶的特性，可将提取的蛋白酶应用于食品工业或者洗涤工业等蛋白酶领域，同时也可以用于农业上微生物肥料中对病原菌细胞膜降解以控制病害，以及堆肥中农业废弃物中蛋白质的降解。

实施例5菌株SWY137产纤维素酶能力的测定

首先将菌株SWY137在LB培养基上进行活化，将活化后的菌株接种到纤维素检测用培养基上(MgSO₄·7H₂O 0.25g，K₂HPO₄ 0.50g，羧甲基纤维素1.88g，琼脂15.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.0，121℃高压灭菌30min)。28℃培养7天，7天后，每个平板中加入5mL0.2mg/mL刚果红染液，染色1h，弃去刚果红染液后，加入1M NaCl洗涤1h，弃去洗涤液，观察菌落周围水解圈的产生，出现水解圈表明纤维素酶的产生。结果显示菌株SWY137具有很好的溶解纤维素的能力，其溶解圈直径达到5.85cm(图4)。菌株SWY137高产纤维素，可以降解病原真菌细胞壁，控制病害，也可以用于堆肥中纤维素的分解。

实施例6菌株SWY137产IAA能力的测定

首先将菌株在LB液体培养基上进行活化，将活化后的菌株按照1％的量接种于DF培养基中(蛋白胨5.00g，酵母提取物1.50g，牛肉膏1.50g，NaCl 5.00g，色氨酸0.50g，蒸馏水1000mL，pH 7.0，121℃高压蒸汽灭菌30min)。28℃摇培7天，7天后，将发酵液取出，12000rpm离心5min，用Salkowkin比色法测定发酵液中IAA的含量。结果显示菌株SWY137产IAA的量为16.20mg/L。通过HPLC进一步分析确认菌株合成的为IAA，菌株培养7天后，12000rpm离心5min，取上清30mL，用两倍体积乙酸乙酯在恒温振荡器中充分萃取3次，合并萃取液用乙酸乙酯减压蒸馏器蒸馏，然后用5mL甲醇溶解、定容，经过0.22um滤膜过滤。参考文献(连翠飞，蒋继志，李社增，鹿秀云，晁春燕，马平.利用高效液相色谱筛选产植物激素细菌[J].华北农学报，2006(02)：66-69；高桂枝，徐爱军，虞梅，苑姗姗.高效液相色谱切变波长法测定艾蒿中内源激素[J].现代农业科技，2007(03)：9-11)中的方法进行样品检测。检测仪器：waters2998高效液相色谱，色谱柱：Agilert Zorbax SB-C₁₈250mm×4.6mm，5um。流动相，甲醇∶乙腈∶0.6％冰乙酸水溶液(体积比50∶5∶45)。进样量：20μl。流速0.8mL/min。柱温：室温。检测波长：255nm。检测结果产IAA的量为16.50mg/L，略高于比色法检测结果。

实施例7菌剂制备

1、菌种活化

首先将菌株SWY137在LB培养基上进行活化，将活化后的菌株接种于LB液体培养基中，28℃培养12h。

2、种子液的培养

种子培养基组成为：蛋白胨15g/L，酵母膏8g/L，葡萄糖12g/L，NaCl 10g/L，pH值为7.2。将活化好的菌株按1.2％的接种量接种于种子液体培养基中，28℃摇床震荡培养，转速为200rpm，培养时间为12h。

3、发酵罐发酵

发酵培养基组成为：黄豆粉28g/L，马铃薯淀粉14g/L，酵母浸粉2.5g/L，蛋白胨3.0g/L，蔗糖5g/L，KH₂PO₄ 0.6g/L，MgSO₄·7H₂O 0.08g/L，MnSO₄·7H₂O 0.02g/L，(NH₄)₂SO₄5g/L，聚醚消泡剂1.2g/L，pH值为7.2。将培养好的种子液OD₆₀₀达到5.00时，按5％的接种量接入发酵罐中，37℃，搅拌速度为150rpm，调节通风量保证溶氧在50％以上、罐压0.05MPa。发酵24h菌量可以达到10¹⁰cfu/ml，待芽孢量达到95％以上时停止发酵，降温放罐，经过培养基配方优化，得到高地芽孢杆菌SWY137的10¹⁰cfu/mL菌液，IAA的含量由16.50mg/L提高到32.25mg/L，可根据需求制成固体或者液体菌剂。

实施例8菌株SWY137的植物促生试验

选取饱满、健康玉米(郑单958)种子消毒、清洗、浸泡后放入28℃生化培养箱培养催芽24h左右。将供试菌株从平板挑取单菌落于LB液体培养基中进行活化，将活化后的菌液按1％的接菌量接种于DF培养基中，28℃，150rpm摇培72h并将菌液稀释到10⁵cfu/mL。参照CN201010511686.2中说明书实施例7的方法进行检测，测定玉米幼苗茎高、根长、茎鲜重、根鲜重、茎干重、根干重。

结果显示菌株SWY137具有很好地促生效果(图5)。可以使玉米苗茎高增加27.67％，根长增加32.23％，茎鲜重增加51.33％，根鲜重增加60.67％，茎干重增加33.33％，根干重增加34.88％(表2)。

表2菌株SWY137对玉米的促生效果

实施例9菌株SWY137促进植物抗逆试验

催芽后将黄瓜(津研七号)种子种植在无盐胁迫和盐胁迫(NaCl浓度为0.15％)的营养基质中，包括以下三种处理。CK0处理：无盐碱胁迫、不接种试验菌株，CK1处理：盐胁迫、不接种试验菌株；菌株处理：盐胁迫、接种菌株SWY147，接种浓度为1×10⁸cfu/mL，接种量为每株20μL。每个处理设置3个重复，所有处理均放置于光照培养箱(25℃，16h光照，18℃，8h黑暗；光照强度20000lx)中培养，培养一个月后观察黄瓜的长势，测定黄瓜植株鲜重和干重。

结果显示菌株SWY137能够提高植物抗逆效果(图6)。相比盐胁迫不加菌株处理，添加菌株SWY147使黄瓜植株鲜重增加45.50％，植株干重增加55.60％(表3)。

表3菌株SWY137促进黄瓜抗逆结果

处理	湿重/g	干重/g
			无盐胁迫	3.3±0.51a	0.27±0.018a
盐胁迫	2.53±0.4b	0.18±0.016b
			盐胁迫+SWY137	3.68±0.57a	0.28±0.017a
增加率	45.50％	55.60％

实施例10菌株SWY137与化肥复配实验

SWY137具有耐高渗透压的特性，可以很好地与化肥结合，降低因高渗透压造成的菌量衰减，将SWY137的菌液稀释到10¹⁰cfu/ml，按0.6％的比例均匀地添加到氮磷钾为15-10-17(即N、P₂O₅、K₂O质量比15∶10∶17)、有机质含量为15％的肥料表面，定时测定其有效活菌数，结果表明在30天内菌剂的衰减速率不明显(图8)。表明菌株SWY137对于高氮磷钾浓度的复合微生物肥料具有很好的应用前景，对于开发含菌有机无机复合肥、含菌水溶肥等具有重要的意义。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 新疆根力多生物科技有限公司

<120> 高地芽孢杆菌SWY137及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 836

<212> DNA

<213> 高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)

<400> 1

tatacatgca gtcgagcgga cagaagggag cttgctcccg gatgttagcg gcggacgggt 60

gagtaacacg tgggtaacct gcctgtaaga ctgggataac tccgggaaac cggagctaat 120

accggatagt tccttgaacc gcatggttca aggatgaaag acggtttcgg ctgtcactta 180

cagatggacc cgcggcgcat tagctagttg gtgaggtaac ggctcaccaa ggcgacgatg 240

cgtagccgac ctgagagggt gatcggccac actgggactg agacacggcc cagactccta 300

cgggaggcag cagtagggaa tcttccgcaa tggacgaaag tctgacggag caacgccgcg 360

tgagtgatga aggttttcgg atcgtaaagc tctgttgtta gggaagaaca agtgcaagag 420

taactgcttg caccttgacg gtacctaacc agaaagccac ggctaactac gtgccagcag 480

ccgcggtaat acgtaggtgg caagcgttgt ccggaattat tgggcgtaaa gggctcgcag 540

gcggtttctt aagtctgatg tgaaagcccc cggctcaacc ggggagggtc attggaaact 600

gggaaacttg agtgcagaag aggagagtgg aattccacgt gtagcggtga aatgcgtaga 660

gatgtggagg aacaccagtg gcgaaggcga ctctctggtc tgtaactgac gctgaggagc 720

gaaagcgtgg ggagcgaaca ggattagata ccctggtagt ccacgccgta aacgatgagt 780

gctaagtgtt agggggtttc cgccccttag tgctgcagct aacgcattaa gcactc 836

Claims

1.高地芽孢杆菌（Bacillus altitudinis）SWY137，保藏编号为CCTCC NO：M 2019842。

2.含有权利要求1所述高地芽孢杆菌SWY137的菌剂。

3.权利要求1所述高地芽孢杆菌SWY137或权利要求2所述菌剂的以下任一应用：

1）用于促进植物生长发育以及提高作物产量；

2）用于提高植物耐盐性；

3）用于除磷；

4）用于制备农用肥料；

5）用于制备磷素活化剂；

6）用于制备植物促生长剂。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述植物为玉米、小麦、大豆、黄瓜。

5.权利要求1所述高地芽孢杆菌SWY137或权利要求2所述菌剂在高盐条件下溶解难溶磷中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述高盐条件是指NaCl的浓度为13%~15%。

7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述难溶磷为难溶性有机磷。