CN103074285B

CN103074285B - 一株高盐异养硝化-好氧反硝化除磷的小短杆菌及其在废水处理中的应用

Info

Publication number: CN103074285B
Application number: CN201310032232.0A
Authority: CN
Inventors: 倪晋仁; 邓若男
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2013-01-28
Filing date: 2013-01-28
Publication date: 2014-05-21
Anticipated expiration: 2033-01-28
Also published as: CN103074285A

Abstract

本发明涉及一株高盐兼具异养硝化-好氧反硝化与除磷功能的小短杆菌（Brachybacterium）及其在废水处理中的应用。该菌株对高盐环境耐受能力强，在高盐条件生长良好，并且可以利用有机碳为唯一碳源，氨氮为唯一氮源进行新陈代谢，通过异养硝化-好氧反硝化作用把氨氮直接转为气体产物，实现脱氮；该菌株也能以硝酸盐氮为唯一氮源，通过好氧反硝化作用将硝酸盐氮转化为气体产物；还能在好氧条件下将无机磷摄入体内转化为自身组分进而去除污水中磷元素。将该菌株应用于高盐废水的处理，可实现单一好氧条件下氮磷的同步去除，有助于有效解决高盐条件下生物除碳除磷脱氮的的难题，应用前景广阔。

Description

一株高盐异养硝化-好氧反硝化除磷的小短杆菌及其在废水处理中的应用

技术领域

本发明涉及一株小短杆菌（Brachybacterium）及其在高盐废水处理中的应用。该菌株具有异养硝化-好氧反硝化的功能，可以在高盐条件下实现同步硝化反硝化脱氮的过程，同时完成污水中含磷污染物的去除。

背景技术

高盐废水是指总含盐量（以NaCl含量计）至少为1%的废水，这些废水除含有大量高浓度的有机物外，还含有大量的无机盐，如Cl^-、Na⁺、Ca²⁺、SO₄ ^2-等。随着海水直接利用以及高含盐工业废水的大量排放，对高盐废水处理提出了新的要求，高盐废水中的高浓度有机物或营养物，如COD、N、P等，对水体环境造成巨大压力，可能加剧江河湖泊富营养化的进程；高盐废水渗入土壤系统后也会造成土壤生物、植物因脱水而死亡，进而破坏土壤生态系统。

传统的生物脱氮是在微生物的作用下将污水中的有机氮和氨态氮转化为N₂的过程，包括硝化和反硝化两个反应过程。另一方面，生物除磷工艺则通过释/吸磷过程，最终通过将被细菌过量摄取的磷随剩余污泥排出系统而达到除磷目的。生物脱氮除磷机制的差异使得这两个过程本身就难以统一，产生矛盾的根本原因是不同功能的微生物所需要的最佳生长条件不同。硝化需要长泥龄的硝化细菌和好氧条件，反硝化需要短泥龄的反硝化菌和缺氧条件，释磷需要短泥龄的聚磷菌和厌氧条件，而吸磷则需要好氧条件。此外，反硝化菌和聚磷菌之间还存在着因生活污水中碳源不足而产生的竞争关系。生物脱氮除磷工艺的发展也主要是围绕着在同一污水处理系统中实现脱氮与除磷的矛盾展开的。但是，因高盐度对常规生物处理系统中微生物的正常代谢会产生不利的影响，主要包括：渗透压偏高，微生物细胞质壁分离，使生长受到阻碍甚至死亡；微生物代谢酶活性受阻；水体密度增加，影响污泥沉降效果等。因此，在高盐条件下除磷脱氮效率都会大大降低,生物脱氮与除磷过程中存在的问题也变得更加复杂，围绕高盐条件下脱氮除磷新工艺的探索也一直广受重视。

非高盐条件下的生物脱氮除磷研究近年来已有较大进展，出现了SHARON、CANON、OLAND和ANNAMOX等新型脱氮工艺，但这些工艺仍未摆脱好氧厌氧结合的两段式生物脱氮的限制；在生物除磷方面，发现了特殊的反硝化聚磷菌（DPB），可在缺氧/厌氧交替的环境下实现硝酸盐氮和磷的同步去除。随着研究的深入，研究者也发现了特殊的异养硝化-好氧反硝化细菌，这类细菌能够在好氧条件下实现氨氮和总氮的同步去除，解决了硝化和反硝化的矛盾。筛选并发现具有特殊脱氮除磷功能的微生物一直是生物脱氮除磷研究领域的热点和趋势。

筛选耐盐的高效菌种也是解决高盐条件下废水处理的有效途径和研究者关注的焦点。近些年来，有研究者通过培养驯化出耐高盐的菌种，以及从自然界高盐环境中分离出耐盐菌和嗜盐菌，并将其应用于高盐废水处理取得了较好的效果，如Woolard等从大盐湖的土壤中筛选的嗜盐菌在SBR反应器中能够有效处理高盐含酚废水。然而，国内外对高盐废水的报导大多数关注点在于有机物和氮素的去除，目前几乎没有对高盐条件下具有除磷能力菌种的报道，在高盐度条件下实现废水的同步脱氮除磷更是一项具有挑战性的课题。

本发明分离出一株小短杆菌（Brachybacterium），发现其具有耐高盐兼具异养硝化-好氧反硝化的能力；进一步发现这种细菌在单一好氧条件下兼有同步除磷的能力。利用这类具有特殊性质的细菌的生理特性和代谢机理，基于硝化过程可以是异养细菌的生理行为，而反硝化和除磷过程可以在好氧条件下进行，使得可以在高盐条件的同一好氧环境下完成脱氮除磷，能够较好的克服上述提到的传统生物处理中存在的矛盾问题。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种高盐兼具异养硝化-好氧反硝化和好氧摄磷能力的菌株及其在废水处理中的应用。

本发明提供的小短杆菌（Brachybacterium）菌株已于2012年3月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC），保藏号为CGMCC No.5947。

本发明所提供的菌株，具有以下表型特征：在25-35℃下，营养琼脂培养基上培养16-32h后，菌落表面光滑，浅黄色；通过革兰氏染色后在显微镜下呈阳性，菌体呈短杆状，大小为（0.6-1.2）μm×（1.5-6.0）μm，菌落较小，扁平。

该菌株的16S rRNA基因序列特征：其16S rRNA具有如序列表中序列1所示的核苷酸序列，序列长度为1409bp。

根据其形态特征和生理生化特征及其16S rRNA基因序列在Genbank中的检索结果，鉴定该菌株为小短杆菌（Brachybacterium）。根据该菌株耐盐性能实验结果，小短杆菌（Brachybacterium）耐盐范围（以NaCl计）为1-13%。

本发明所提供的小短杆菌（Brachybacterium）能够在高盐条件下，以有机物为电子受体，NH₄ ⁺为电子供体，将NH₄ ⁺氧化为NO₂ ^-或NO₃ ^-；能够在好氧的条件下，以有机物为电子供体，NO₂ ^-或NO₃ ^-为电子受体，将其还原为氮气；还能够在好氧条件下，将无机磷摄入体内转化为自身组分进而实现去除污水中磷元素的目的。

本发明所提供的小短杆菌（Brachybacterium）可用于同步脱氮除磷，在实际应用中，可将菌株置于高盐废水中实现氮磷同步去除的目的。

所述废水的碳氮比可为3.7-12，优选为9-12。

所述废水的温度可为20-40℃，优选为25-30℃。

所述废水的pH可为6.5-8.0，优选为6.5-7.5。

本发明的小短杆菌（Brachybacterium）及其应用与现有技术相比较有如下有益效果：

（1）本发明的小短杆菌（Brachybacterium）菌株对高盐的耐受力强，能够在高盐、好氧条件下实现好氧条件下氮磷的同步去除，解决了高盐对传统生物处理过程的限制以及传统废水处理中生物脱氮除磷需要采取厌氧释磷、缺氧反硝化、好氧硝化吸磷分段处理的瓶颈问题；

（2）硝化和反硝化偶联进行，反硝化过程中产生的碱度可以很好的弥补硝化过程中产生的酸度，整个过程无需加碱调节pH；相比自养硝化细菌，异养硝化细菌的生长速率快、细胞产率高，可以有效解决自养硝化细菌增值缓慢、系统水力停留时间长的问题；

（3）脱氮和除磷同步进行，解决了反硝化菌和聚磷菌对碳源的竞争问题；

（4）采用本发明，在传统活性污泥法的二级生化处理系统，可以完成碳氮磷的同步去除，无须构建新的反应器，最大限度的简化了工艺流程，节省了设备和投资的成本，因此，具有较好的经济效益和环保效益；

（5）本发明适用于高含盐废水的脱氮除磷处理，应用前景广阔，具有很好的社会效益。

以下结合具体实施方式对本发明进行详细描述。实施例仅为举例说明，本发明的范围并不以具体实施方法为限，而是由权利要求的范围加以限定。

附图说明

附图1小短杆菌（Brachybacterium）在盐度为3%时对氮素和磷酸盐的降解曲线

附图2小短杆菌（Brachybacterium）在不同盐度下对氨氮的降解曲线

附图3小短杆菌（Brachybacterium）在不同盐度下对磷酸盐的降解曲线

附图4小短杆菌（Brachybacterium）在不同pH条件下的脱氮曲线

附图5小短杆菌（Brachybacterium）在不同pH条件下的除磷曲线

附图6小短杆菌（Brachybacterium）在不同温度条件下的脱氮曲线

附图7小短杆菌（Brachybacterium）在不同温度条件下的除磷曲线

附图8小短杆菌（Brachybacterium）在不同C/N条件下的脱氮曲线

附图9小短杆菌（Brachybacterium）在不同C/N条件下的除磷曲线

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中，所述百分含量如无特殊说明，均为质量百分含量。

实施例中各种污染物的监测分析方法参考《水和废水监测分析方法》（第四版，中国环境科学出版社，2002）。温度和溶解氧通过便携式溶氧测定仪（YSI550A，USA）进行测定。污泥浓度（MLSS）和挥发性悬浮固体浓度（MLVSS）根据重量法测定。

实施例中使用的各种单位，统一采用国家标准。

实施实例1：小短杆菌（Brachybacterium）在盐度为3%时的同步脱氮除磷能力测定

将保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC），保藏号为CGMCC No.5947的小短杆菌（Brachybacterium）菌株（下同）接种于1L的LB培养基中，防止杂菌的侵入并保持菌体的生长活力，进行富集培养。将培养得到的菌液离心，用无菌水洗涤三次，制成光密度（OD₆₀₀）为1-2的菌悬液。

取10mL上述菌悬液加入两个含有90mL的盐度（以NaCl计）为3%的测试培养基（每升含0.94g葡萄糖，0.153g NH₄Cl，0.035g KH₂PO₄，0.1gMgSO₄·7H₂O，0.006g FeSO₄·7H₂O，pH7.0~7.5）的锥形瓶中，用9层纱布封口，30℃150rpm的摇床中振荡培养。未接种菌悬液的培养基进行同等条件下的实验作为空白对照。于0h、6h、12h、18h和24h取少量反应液，其中一部分直接用于测定菌体光密度，其余部分在8000rpm下离心5min，取上清液测定各种含氮化合物及磷酸盐的浓度。

实验结果见附图1。小短杆菌（Brachybacterium）菌株在高盐条件下生长良好，且对氨氮和磷酸盐有较强的降解能力。在24h内，菌株处于对数生长期，与此同时氨氮和磷酸盐的降解同步进行，24h时去除率达到最大值87.02和84.30%。此外，在整个降解过程中，硝氮和亚硝氮的浓度无明显积累，废水中大部分的氨氮通过异养硝化-好氧反硝化作用直接转化为气体产物。此外，24h内磷酸盐的浓度由最初的10mg/L下降至1.57mg/L，说明该菌株在高盐条件下具有异样硝化-好氧反硝化能力的同时兼有较强的除磷功能。

实施实例2：菌株在不同盐度条件下的脱氮除磷效果

以葡萄糖为碳源，氨氮为氮源，实施例中所述小短杆菌（Brachybacterium）菌株在不同盐度下对氨氮的去除能力测定。具体实施步骤如下：

将小短杆菌（Brachybacterium）菌株接种于盐度（以NaCl计）分别为1%、3%、5%、8%、10%和13%的100ml无机盐培养基（0.94g葡萄糖，0.153g NH₄Cl，0.035g KH₂PO₄，0.1gMgSO₄·7H₂O，0.006g FeSO₄·7H₂O，30g-150g NaCl，pH7.0~7.5）中，于30℃150rpm的摇床中进行预培养。待菌株生长至对数生长期后期时，取10ml菌液接入新鲜的盐度（以NaCl计）分别为1%、3%、5%、8%、10%和13%的90ml无机盐培养基中，于30℃150rpm的摇床中进行振荡培养。未接种菌悬液的培养基进行同等条件下的实验作为空白对照。于6h、12h、18h、24h、36h和48h取少量反应液，其中一部分直接用于测定菌体光密度，其余部分在8000rpm下离心10min，取上清液测定含氮化合物和磷酸盐的浓度。

如附图2所示，初始氮源浓度为40mg/L，当盐度分别为1%、3%、5%、8%、10%和13%时，48h后氨氮的浓度分别为18.09mg/L、4.90mg/L、4.53mg/L、8.71mg/L、7.39mg/L和36.93mg/L；在盐度为1%时，小短杆菌（Brachybacterium）菌株对氨氮的去除效果不是很理想，48h去除率仅为53.45%；当盐度为5%时，小短杆菌（Brachybacterium）菌株对氨氮的去除效果最好，其36h的去除率达到94.75%和88.69%；当盐度升高至10%，其对氨氮的去除率仍然在80%以上；当盐度达到13%时，菌株对氨氮的去除效果明显下降，去除率仅为5.50%，推测原因可能是此盐度下该菌株生长速率下降，对其降解能力产生较强的抑制作用。由此可知，小短杆菌（Brachybacterium）降解氨氮的最佳盐度为5%，并且在盐度为3%-10%的范围内对氨氮均有较好的去除效果。

结果如图3所示，该菌株在盐度（以NaCl计）分别为1%、3%、5%、8%、10%时，均可以有效去除磷酸盐；其中在盐度为1%时的除磷性能最好，去除速率也最快，24h内磷酸盐的去除率达到95.5%。由此可见，该菌株为对高盐有良好耐受能力的耐盐菌，其能够在高盐条件下有效实现生物除磷。

实施实例3：.菌株在不同pH条件下的脱氮除磷实验

将小短杆菌（Brachybacterium）菌株接种于100ml的盐度（以NaCl计）为3%无机盐培养基（同实施例2）中，于30℃150rpm的摇床中进行预培养。待菌株生长至对数生长期后期时，取10ml菌液接入新鲜的90ml无机盐培养基中,调节培养基pH分别为6.5-7.0、7.0-7.5和7.5-8.0的范围内，于30℃150rpm的摇床中进行振荡培养。未接种菌悬液的培养基进行同等条件下的实验作为空白对照。于6h、12h、18h、24h、36h和48h取少量反应液，其中一部分直接用于测定菌体光密度，其余部分在8000rpm下离心10min，取上清液测定各种含氮化合物和磷酸盐的浓度。

由图4、图5可见，小短杆菌（Brachybacterium）菌株在pH为6.5-7.0，脱氮除磷性能最好，24h对氨氮和磷酸盐的去除率分别达到87.02和84.30%。但随着pH的升高，菌株脱氮除磷率降低。当pH为7.5-8.0范围内，菌株对氨氮和磷酸盐的去除效果都不是很理想。由此可知，该菌株脱氮除磷效果最适的pH范围为6.5-7.0，pH值的升高会对其脱氮除磷效果产生抑制作用。

实施实例4：菌株在不同温度条件下的脱氮除磷实验

将小短杆菌（Brachybacterium）菌株接种于100ml的盐度（以NaCl计）为3%无机盐培养基（同实施例2）中，于30℃150rpm的摇床中进行预培养。待菌株生长至对数生长期后期时，取10ml菌液接入新鲜的100ml无机盐培养基中,调节摇床培养温度分别为20℃、30℃和40℃，150rpm振荡培养。未接种菌悬液的培养基进行同等条件下的实验作为空白对照。于6h、12h、18h、24h、36h和48h取少量反应液，其中一部分直接用于测定菌体光密度，其余部分在8000rpm下离心10min，取上清液测定各种含氮化合物和磷酸盐的浓度。

由图6、图7可见，当温度分别为20℃、30℃和40℃时，48h后氨氮的浓度分别为11.81mg/L、4.53mg/L和10.08mg/L，磷酸盐的浓度分别为2.67mg/L、0.45mg/L和2.49mg/L。温度为30℃时，菌株对氨氮和磷酸盐的去除率最高；48h内无硝酸盐氮的累积，只有微量的亚硝酸盐氮出现，其值均不超过0.04mg/L。说明小短杆菌（Brachybacterium）菌株对温度具有较宽的适应范围。

实施实例5：菌株在不同C/N条件下的脱氮除磷实验

将小短杆菌（Brachybacterium）菌株接种于100ml的盐度（以NaCl计）为3%无机盐培养基（同实施例2）中，于30℃150rpm的摇床中进行预培养。待菌株生长至对数生长期后期时，取10ml菌液接入新鲜的100ml无机盐培养基中,调节C/N分别为3.7、7.5和9.0，于30℃150rpm的摇床中进行振荡培养。未接种菌悬液的培养基进行同等条件下的实验作为空白对照。于6h、12h、18h、24h、36h和48h取少量反应液，其中一部分直接用于测定菌体光密度，其余部分在8000rpm下离心10min，取上清液测定各种含氮化合物和磷酸盐的浓度。

由图8、图9可见，当C/N分别为3.7、7.5和9时，48h后氨氮的浓度分别为12.97mg/L、13.04mg/L和4.53mg/L，磷酸盐的浓度分别为7.15mg/L、4.29mg/L和1.32mg/L；当C/N为9时，小短杆菌（Brachybacterium）对氨氮和磷酸盐的去除率明显高于其在C/N为3.7和9时的去除率。

实施实例6：菌株最佳除磷条件的确定

采用摇瓶实验的模式，依据正交实验原理，以pH值、摇床培养温度、接种量和碳氮比四个因素为影响因子，建立了4因素3水平共计9次正交试验以确定菌株小短杆菌（Brachybacterium）的最佳除磷条件。实验中选用的培养基除葡萄糖与氯化铵含量根据需要改变外，其余组分和浓度一律与实施例1相同。

正交实验设计及结果见表1所示。

表1正交实验设计及结果

由表1可知，四个因子对小短杆菌（Brachybacterium）除磷效果的影响强弱为：pH>碳氮比>接种量>温度；小短杆菌（Brachybacterium）的最佳除磷效果组合为A₂B₂C₃D₂，对应的最优条件为pH为6.5-7.0，温度为30℃，接种量为10%，碳氮比为9。

Claims

1.一种高盐兼具异养硝化-好氧反硝化和除磷功能的小短杆菌(Brachybacterium)菌株在废水处理中同步脱氮和除磷的应用，其特征在于：该小短杆菌菌株的保藏号为CGMCC No.5947,所述应用是指在高盐好氧环境下完成硝化、反硝化和除磷过程，进而实现氨氮、总氮及磷的同时去除，

其中，其所述的废水的盐度，以NaCl计，范围为1-13%；

所述的废水的碳氮比范围为3.7-12；

所述的废水的pH范围为6.5-8.0。