CN115011530B - 一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂及其制备方法及其应用 - Google Patents

一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂及其制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂及其制备方法及其应用，它属于生防菌应用技术领域。本发明要解决的技术问题为发明一种多功能菌剂。本发明方法为发酵贝莱斯芽胞杆菌菌剂，配置富硒营养液，将配置的富硒营养液稀释，得到稀释的富硒营养液，待用；按照一定的质量比将得到的发酵贝莱斯芽胞杆菌菌剂和得到的稀释的富硒营养液混合均匀后，得到一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂。本发明进行了培养基组分优化和摇床发酵条件优化优化后的菌量是优化前的3.28倍，对灰霉病的抑菌率也显著增加。在此基础上与富硒营养液复配进行了生防促生试验，具有良好的预防效果。

Description

一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂及其制备方 法及其应用
技术领域
本发明属于生防菌应用技术领域；具体涉及一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂及其制备方法及其应用。
背景技术
番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)原产于南美洲引入我国后，营养丰富，可食用、也可药用而广受喜爱，是我国一大重要经济作物。自2013年以来我国番茄的年产量均在5000万吨以上，并逐年增长，成为种植面积最大和产量最高的国家。
番茄灰霉病是温室大棚番茄栽培中发生最普遍、危害最严重、防治最困难的病害之一。大量地块都由于灰霉病防治不利造成果实被害导致减产严重经济损失直线上升。其病原物为灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)，是一种低温高湿型真菌病害，在气温20℃、空气湿度90％以上，病害扩撒传播速度最快，这也是温室大棚在早春晚秋时灰霉病频发的原因。发病多是田间病菌越冬后通过雨水传播、播种的种植带病毒、未及时通风排湿等。番茄的开花结果期是灰霉病发病的盛期，多从开败花的柱头发病[5]，，造成花器腐烂；果实多从残留在果实蒂部或肩部的花瓣发病进而迅速扩展到整个果实长出大量灰色的霉层；叶片从叶尖呈“V”形从外向里逐步扩展，湿度大时也会出现霉层；霉层接触茎蔓便可造成传染。自18世纪欧洲对番茄灰霉病便有记载，上世纪传入中国，90年代逐渐泛滥严重。从1998年辽宁省农科院植保所开始对番茄灰霉病予以重视，开始研究其致病机制和防治农药配比；2004年何美仙称利用拮抗菌木霉菌、酵母菌等可以有效防治番茄灰霉病，与之前的单纯农药预防有很大的突破；曹绍玉汇总了各种利用植物提取液等来对番茄各种常见病害进行防治的方法，如许华等人利用三裂叶蟛蜞菊、薇甘菊、凤眼莲三种外来入侵植物的提取液对番茄灰霉病病原菌有很好的抑制效果。利用微生物防治，环保绿色无残留农药效果是显而易见的，深受全球的追捧。
生物防治符合我国农作物病虫害绿色健康防治的要求，就是利用细菌、真菌、昆虫等对防治病原菌或病虫害的拮抗作用来进行预防和治理。
发明内容
本发明目的是提供了一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂及其制备方法及其应用。
本发明通过以下技术方案实现：
一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂的制备方法，包括如下步骤：
步骤1、发酵贝莱斯芽胞杆菌菌剂，待用；
步骤2、配置富硒营养液，待用；
步骤3、将步骤2配置的富硒营养液稀释，得到稀释的富硒营养液，待用；
步骤4、按照一定的质量比将步骤1得到的发酵贝莱斯芽胞杆菌菌剂和步骤3得到的稀释的富硒营养液混合均匀后，得到一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂。
本发明所述的一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂的制备方法，步骤1发酵贝莱斯芽胞杆菌菌剂具体方法包括如下步骤：
步骤1.1、将贝莱斯芽胞杆菌接种在具有LB液体培养基的三角瓶中，35℃，180r/min摇床中振荡培养48h，得到种子液，待用；
步骤1.2、将步骤1得到的种子液在YSP培养基中培养，培养温度30℃，接种量4％，装液量为250ml三角瓶中装液125ml，转速180r/min，摇床中振荡培养48h，得到发酵贝莱斯芽胞杆菌菌剂。
本发明所述的一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂的制备方法，步骤2中的YSP培养基包括蛋白胨2.0g/L，酵母膏1.0g/L，葡萄糖4.0g/L。
本发明所述的一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂的制备方法，步骤2富硒营养液的配置方法包括如下步骤：
步骤2.1、按照重量分数分别称量1-5份的蛋氨酸硒，2-3份的磷酸二氢钾，2-3份的磷酸二氢钠，1-2份的叶酸，3-10份的蚯蚓粘液，80-100份的无菌水，待用；
步骤2.2、将步骤2.1称量好的蛋氨酸硒、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、叶酸、蚯蚓粘液加入无菌水中，搅拌均匀后，室温下静止1-2小时后，得到富硒营养液。
本发明所述的一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂的制备方法，步骤3配置的富硒营养液加入10-20倍的无菌水，搅拌均匀后，室温下静止1-2小时后，得到稀释的富硒营养液。
本发明所述的一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂的制备方法，步骤4中发酵贝莱斯芽胞杆菌菌剂和稀释的富硒营养液的质量比为1-4:1-4。
本发明所述的一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂的制备方法制备的一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂，所述贝莱斯芽胞杆菌(Bacillusvelezensis)为WZ-37，WZ-37已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15766。
本发明所述的一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂的制备方法制备的一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂，所述发酵贝莱斯芽胞杆菌菌剂和稀释的富硒营养液的质量比为3:2。
本发明所述的一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂的制备方法制备的一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂，所述发酵贝莱斯芽胞杆菌菌剂和稀释的富硒营养液的质量比为2:3。
本发明所述的一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂的制备方法制备的一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂的应用，用于番茄灰霉病的防效和番茄的促生长。
本发明的有益效果为：
本发明所述的一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂的制备方法，发酵条件优化后菌量可达3.81×109cfu/ml，优化的配方为：YSP培养基(蛋白胨2.0g/L，酵母膏1.0g/L，葡萄糖4.0g/L)培养温度30℃，接种量4％，装液量125ml/250ml，转速180r/min。
本发明所述的一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂的制备方法，单一及复配液对番茄灰霉病防效最好的组合是WZ-37与富硒营养液为3∶2时。
本发明所述的一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂的制备方法，单一及复配液对番茄种子发芽率及幼苗生长最优的组合是WZ-37与富硒营养液为2∶3处理组。
本发明所述的一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂的制备方法，提高番茄幼苗的光合作用综合最佳的组合是WZ-37与富硒营养液为3∶2处理组。
本发明所述的一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂的制备方法，富硒营养液稀释20倍促进番茄幼苗株高茎粗及全株鲜重效果最显著。
本发明所述的一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂的制备方法，使番茄果实富硒效果最好的组合是WZ-37与富硒营养液为2∶3处理组。
本发明所述的一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂的制备方法，对灰霉病的抑菌率也显著增加。在此基础上与富硒营养液复配进行了生防促生试验，具有良好的预防效果。
附图说明
图1为本发明所述的一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂中贝莱斯芽胞杆菌菌量与吸光值的相关性关系图；
图2为本发明所述的一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂中贝莱斯芽胞杆菌生长曲线；
图3为本发明所述的一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂中不同培养基下WZ-37的OD值；
图4为本发明所述的一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂中不同培养基下对灰霉病的抑菌率；
图5为本发明所述的一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂中发酵贝莱斯芽胞杆菌菌剂装液量和OD值关系图；
图6为本发明所述的一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂中发酵贝莱斯芽胞杆菌菌剂接种量和OD值关系图；
图7为本发明所述的一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂中YSP培养基的碳源对比图；
图8为本发明所述的一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂中YSP培养基的氮源对比图；
图9为本发明所述的一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂中WZ-37的发酵优化前后OD值比较图；
图10为本发明所述的一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂中WZ-37的发酵优化前后菌数比较图；
图11为单一及本发明所述的一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂对番茄灰霉病室内叶片离体防效对比照片；
图12为单一及本发明所述的一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂对番茄幼苗形态影响的照片；
图13为单一及本发明所述的一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂的不同处理组POD酶活性变化；
图14为单一及本发明所述的一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂不同处理组SOD酶活性变化；
图15为单一及本发明所述的一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂不同处理组的番茄幼苗叶绿素荧光参数；
图16为单一及本发明所述的一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂不同处理组的相对电子传递速率对比图。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作详细说明，本具体实施方式在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的具体实施方式。
具体实施方式一：
一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂的制备方法，包括如下步骤：
步骤1、发酵贝莱斯芽胞杆菌菌剂，待用；
步骤2、配置富硒营养液，待用；
步骤3、将步骤2配置的富硒营养液稀释，得到稀释的富硒营养液，待用；
步骤4、按照一定的质量比将步骤1得到的发酵贝莱斯芽胞杆菌菌剂和步骤3得到的稀释的富硒营养液混合均匀后，得到一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂。
本实施方式所述的一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂的制备方法，步骤1发酵贝莱斯芽胞杆菌菌剂具体方法包括如下步骤：
步骤1.1、将贝莱斯芽胞杆菌接种在具有LB液体培养基的三角瓶中，35℃，180r/min摇床中振荡培养48h，得到种子液，待用；
步骤1.2、将步骤1得到的种子液在YSP培养基中培养，培养温度30℃，接种量4％，装液量为250ml三角瓶中装液125ml，转速180r/min，摇床中振荡培养48h，得到发酵贝莱斯芽胞杆菌菌剂。
本实施方式所述的一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂的制备方法，步骤2中的YSP培养基包括蛋白胨2.0g/L，酵母膏1.0g/L，葡萄糖4.0g/L。
本实施方式所述的一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂的制备方法，步骤2富硒营养液的配置方法包括如下步骤：
步骤2.1、按照重量分数分别称量1-5份的蛋氨酸硒，2-3份的磷酸二氢钾，2-3份的磷酸二氢钠，1-2份的叶酸，3-10份的蚯蚓粘液，80-100份的无菌水，待用；
步骤2.2、将步骤2.1称量好的蛋氨酸硒、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、叶酸、蚯蚓粘液加入无菌水中，搅拌均匀后，室温下静止1-2小时后，得到富硒营养液。
本实施方式所述的一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂的制备方法，步骤3配置的富硒营养液加入10-20倍的无菌水，搅拌均匀后，室温下静止1-2小时后，得到稀释的富硒营养液。
本实施方式所述的一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂的制备方法，步骤4中发酵贝莱斯芽胞杆菌菌剂和稀释的富硒营养液的质量比为1-4:1-4。
本实施方式所述的一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂的制备方法制备的一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂，所述贝莱斯芽胞杆菌(Bacillusvelezensis)为WZ-37，WZ-37已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15766。
本实施方式所述的一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂的制备方法，制备过程及实验数据和结论如下说明：
图1为贝莱斯芽胞杆菌菌量与吸光值的相关性关系图，在WZ-37液体发酵过程中随着时间增加，菌量逐渐增加，摇瓶内液体逐渐由清澈透亮变得浑浊；所以，可以通过吸光值来反映WZ-37的菌量。由图1可知，WZ-37菌量数与吸光值成正相关关系，因此接下来的试验用OD值来侧面反映菌数，并以此为指标。
图2为贝莱斯芽胞杆菌生长曲线，WZ-37生长曲线整体大致呈现“S型”，0h-12h，由于WZ-37刚处于新环境需要适应且生长基数小，因此增长缓慢；12h-24h，经过一段时间的适应与增加，WZ-37处于有一定菌数基础且适应的状态，增长速度到最快呈对数增加；24h-36h经过长时间的发酵次级代谢产物达到顶峰对WZ-37产生一定的负面影响且此时营养物质等不足以供给，增长速度逐步缓慢；36h后处于生长后期菌量最大，48h达到菌量最大值此时测定菌量最佳。
图3为不同培养基下WZ-37的OD值，LB、CM、羧甲基纤维素培养基、水豆豉培养基、酵母蛋白胨培养基(YSP)、NA6种液体培养基经过48小时发酵后，测定600nm处的OD值如图3所示：其中最优培养基为YSP，OD值为2.4，其次为NA培养基OD值为1.8，第三位是LB，CM细菌基础培养基排第四位，最差的是羧甲基纤维素和水豆豉培养基。
图4为不同培养基下对灰霉病的抑菌率，抑菌率LB最高达到86.21％，其次是YSP培养基为85.06％，NA、CM居于中间水平，分别为50.57％和41.38％，羧甲基纤维素培养基为32.18％，水豆豉培养基最差为27.59％。LB培养基抑菌率最大85.06％，OD值排第三位；YSP培养基抑菌率仅次于LB，但OD值最大，并且结合经济价值，YSP培养基经济价值优于LB培养基，因此确定YSP培养基为最优培养基。
从图5和图6可知，WZ-37发酵条件优化方法如下：装液量、接种量、时间是影响发酵的最重要的三个因素，经过单因素试验缩小梯度范围，装液量50ml-125ml，随着装液量增多，OD值增大，在装液量为125ml时，OD600达到最大为1.53，后期逐渐下降，因此选择100ml、125ml和150ml三个水平梯度；接种量在4％之前随着接种量增加OD值增大，在接种量为4％时达到最大OD值1.506，再增加接种量OD值反而下降，因此选择3％、4％和5％三个水平，综合WZ-37生长曲线结果，筛选出36h、42h、48h三个水平梯度。三因素三水平正交试验，即三因素对WZ-37的影响程度：时间＞接种量＞装液量；分析比较K值可知最佳组合为发酵时间48小时，接种量为5％，装液量为125ml时，为WZ-37发酵效果最佳，在此搭配下吸光值最大，菌量达到在最大，对灰霉菌的抑菌效果最好。
从图7和图8可知，除麸皮作为碳源时WZ-37菌量最低，其余五种碳源相差不大，其中最优的是葡萄糖1.87，其次是马铃薯淀粉，乳糖和甘露醇相等，最差的是麸皮，综合选择葡萄糖最佳；当硝酸铵、尿素和硫酸铵三种无机氮用作氮源时，WZ-37不会生长，因此不能用无机氮当做氮源，牛肉膏做氮源时WZ-37君临最大，酵母粉次之，蛋白胨和花生饼粉效果相差不大，考虑到经济方面的价值，牛肉膏成本较高，因此选择酵母粉为最佳氮源。
从图9和图10可知，贝莱斯芽胞杆菌发酵后OD值有明显提高，优化后OD值为2.73是优化前1.75的1.倍，根据菌量与OD值的线性相关关系y＝26.861x-35.216，R2＝0.984；计算出优化后菌量3.81×109cfu/ml，优化前1.18×109cfu/ml，是优化前的3.28倍。
富硒营养液的稀释：无菌水对照组的种子发芽率是83％，1∶20组为91％的发芽率，其余三组1∶30、1∶40和1∶50发芽率都低于85％，后续试验富硒营养液都是用到1∶20的稀释后的。
表1发酵贝莱斯芽胞杆菌菌剂和稀释的富硒营养液不同配比对番茄灰霉病的抑制效果
Figure BDA0003758147370000071
从表1可知，菌液与富硒营养液的配比为3∶2时，对灰霉病的抑制效果最好，抑菌距离达到9.87mm，抑菌率高达78.96％，显著高于其他各个配比。并且处理组2∶3的抑菌距离和抑菌效果也是相对较高，特别是抑菌率与处理组3∶2的差异不显著，但整体效果最好的是3∶2处理组。
从图11和表2可知，无菌水对照组番茄叶片有明显的褪绿和灰霉病斑，单一WZ-37、单一富硒营养液以及复配液3∶2无明显褪绿；据表4可见，复配液3∶2处理组发病率22.22％，病情指数2.47％，防治效果92.86％，对灰霉病的防治效果明显优于单一菌液、单一富硒营养液以及其他各组复配组，符合3.7中筛选出的结果，验证成功，因此离体果实防效选择3∶2比例进行。
表2单一及复配液对番茄灰霉病室内离体叶片防效
Figure BDA0003758147370000081
表3单一及复配液对番茄灰霉病室内离体果实防效
Figure BDA0003758147370000082
从表3可知，复配比为3∶2时，发病率最低为26.67％，病情指数最低为5.93％，防效最佳为87.68％，显著优于其他各组单一及复配液因此选择菌液与富硒营养液为3∶2的最佳，对番茄果实灰霉病的防治效果最好，复配液2∶3的防效仅次于3∶2组，对灰霉病也有较好的防治效果。
表4单一及最佳复配液对番茄植株灰霉病的预防作用
Figure BDA0003758147370000083
Figure BDA0003758147370000091
由表4可知，农药40％嘧霉胺对灰霉病的防治效果最高达到97.16％，病情指数最低为2.52，发病率最低为22.67％；除此之外，复配液3∶2的防效最高为87.71％，发病率低于清水组56％，病情指数比清水组低49.79％，防治效果优于单一菌液WZ-37。(图第一行依次为WZ-37、富硒营养液、清水；第二行为2∶3、嘧霉胺、3∶2)。
表5不同处理组对番茄种子萌发率的影响
Figure BDA0003758147370000092
由表5可知，通过5天的连续观察和记录，处理组3∶2和2∶3第6天的发芽率显著高于其他各处理组，分别高出对照组15.34％和14.67％，促进种子萌发效果显著。单一富硒营养液处理组促进效果不显著，其他复配组萌发率在79.33％-82.67％之间，差异不显著。综合上述，促种子发芽率效果：复配液＞单一菌液＞单一富硒营养液＞CK。
表6不同处理组番茄幼苗形态差异比较
Figure BDA0003758147370000093
从表6和图12可知，不同处理组对番茄幼庙株高影响差异不显著，2∶3处理组茎粗明显优于其他单一处理组及对照组，全株鲜重3∶2处理组最大高于对照组1.98g，2∶3处理组稍次但也优于其他单一处理组，单一菌液与单一富硒营养液二者差异不显著，菌液稍优于富硒营养液。
表7不同处理组番茄幼苗根系数据
Figure BDA0003758147370000101
从表7可知，各处理组根长差异显著性不大；表面积2∶3处理组最大达到861.1，是对照组的7.36倍；节点数和根尖数都是2∶3的最大，明显优于其他各处理组，差异显著。
表8各酶活性含量
Figure BDA0003758147370000102
从表8可知，SOD和POD活性含量均是2∶3处理组最多3∶2处理组稍次，MDA活性含量为3∶2最高，2∶3稍次，两个处理组差异性不显著，WZ-37三种酶活性含量均显著高于富硒营养液；综合，不同处理组对酶活性含量的影响3∶2≥2∶3＞WZ-37＞富硒营养液＞CK。
从图13可知，各处理组POD活性均呈先升高后下降的趋势，其中处理组2∶3在第7天POD活性达到最高1179U·g-1，其余4组最高点都在第5天达到，2∶3与3∶2的最高点相近，其余三组差异不显著都在800U·g-1之间，第11天的酶活性处理组2∶3显著高于对照组，其他处理组与对照组差异不显著，说明对POD的活性有一定的促进。
从图14可知，各处理组随着时间的变化，SOD活性呈先平稳上升，再缓慢下降的趋势，其中3∶2在第7天达到最高点为205.3U/g是对照组的1.29倍，富硒营养液有两个拐点分别为第5、7天，其余处理组均在第5天达到最高点；第11天，酶活性高低依次为3∶2＞WZ-37＞2∶3＞富硒营养液＞对照组。
表9不同处理组的叶绿素含量
Figure BDA0003758147370000111
从表9可知，各处理组对叶绿素a、叶绿素b和总含量的影响先后顺序都是3∶2＞2∶3＞WZ-37＞富硒营养液＞CK，叶绿素a、叶绿素b、总量三者最高的均是3∶2处理组，与对照组相比差异显著性明显。
从图15可知，3∶2和2∶3处理组最大光合效率显著优于其他各组，且3∶2＞2∶3；单一WZ-37大于单一富硒营养液；单一富硒营养液和对照组二者的差异不显著，但仍大于对照组。不同处理对番茄幼苗qN的影响：不同处理组对非光化学猝灭较对照组相比均有不同程度增加，其中3∶2最佳，2∶3稍次，WZ-37和富硒营养液相差不大，差异不显著。不同处理对番茄幼苗qP的影响：光化学猝灭在各处理组的大小依次为：3∶2、2∶3、WZ-37、富硒营养液、对照组。不同处理对番茄幼苗Y(NPQ)的影响：经复配处理的光诱导猝灭的量子产量显著优于单一组，单一组显著优于对照组。不同处理对番茄幼苗Y(NO)的影响：除对照组外，其余4组的非光诱导的量子产量差异显著性不明显，均在0.37-0.40左右，但各组均大于处理组0.33。
从图16能够看出，相对电子传递速率处理组3∶2高达45.2％，处理组2∶3为42.9％，均显著优于对照组和单一菌液组，单一菌液与单一富硒营养液二者差异不显著，但均比对照组高。
表10不同处理组硒元素含量
Figure BDA0003758147370000112
从表10能够看出，富硒营养液较单一菌液、复配液、对照组硒元素含量显著高，是对照组的5.49倍；两个比例的复配组效果相差不大，低于单一富硒营养液可能是菌液稀释了富硒营养液的浓度，WZ-37稍大于对照组差异不显著。
具体实施方式二：
一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂的制备方法，包括如下步骤：
步骤1、发酵贝莱斯芽胞杆菌菌剂，待用；
步骤2、配置富硒营养液，待用；
步骤3、将步骤2配置的富硒营养液稀释，得到稀释的富硒营养液，待用；
步骤4、按照一定的质量比将步骤1得到的发酵贝莱斯芽胞杆菌菌剂和步骤3得到的稀释的富硒营养液混合均匀后，得到一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂。
具体实施方式三：
根据具体实施方式二所述的一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂的制备方法，步骤1发酵贝莱斯芽胞杆菌菌剂具体方法包括如下步骤：
步骤1.1、将贝莱斯芽胞杆菌接种在具有LB液体培养基的三角瓶中，35℃，180r/min摇床中振荡培养48h，得到种子液，待用；
步骤1.2、将步骤1得到的种子液在YSP培养基中培养，培养温度30℃，接种量4％，装液量为250ml三角瓶中装液125ml，转速180r/min，摇床中振荡培养48h，得到发酵贝莱斯芽胞杆菌菌剂。
具体实施方式四：
根据具体实施方式二所述的一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂的制备方法，步骤2中的YSP培养基包括蛋白胨2.0g/L，酵母膏1.0g/L，葡萄糖4.0g/L。
具体实施方式五：
根据具体实施方式二所述的一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂的制备方法，步骤2富硒营养液的配置方法包括如下步骤：
步骤2.1、按照重量分数分别称量1-5份的蛋氨酸硒，2-3份的磷酸二氢钾，2-3份的磷酸二氢钠，1-2份的叶酸，3-10份的蚯蚓粘液，80-100份的无菌水，待用；
步骤2.2、将步骤2.1称量好的蛋氨酸硒、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、叶酸、蚯蚓粘液加入无菌水中，搅拌均匀后，室温下静止1-2小时后，得到富硒营养液。
具体实施方式六：
根据具体实施方式二所述的一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂的制备方法，步骤3配置的富硒营养液加入10-20倍的无菌水，搅拌均匀后，室温下静止1-2小时后，得到稀释的富硒营养液。
具体实施方式七：
根据具体实施方式二所述的一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂的制备方法，步骤4中发酵贝莱斯芽胞杆菌菌剂和稀释的富硒营养液的质量比为1-4:1-4。
具体实施方式八：
根据具体实施方式二至七之一所述的一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂的制备方法制备的一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂，所述贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)为WZ-37，WZ-37已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15766。
具体实施方式九：
根据具体实施方式二至七之一所述的一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂的制备方法制备的一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂，所述发酵贝莱斯芽胞杆菌菌剂和稀释的富硒营养液的质量比为3:2。
具体实施方式十：
根据具体实施方式二至七之一所述的一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂的制备方法制备的一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂，所述发酵贝莱斯芽胞杆菌菌剂和稀释的富硒营养液的质量比为2:3。
具体实施方式十一：
根据具体实施方式二至七之一所述的一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂的制备方法制备的一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂的应用，用于番茄灰霉病的防效和番茄的促生长。

Claims (9)

1.一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)菌剂的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤1、发酵贝莱斯芽胞杆菌菌剂，待用；
所述贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)为WZ-37，WZ-37已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15766；
步骤2、配置富硒营养液，待用；
步骤2富硒营养液的配置方法包括如下步骤：
步骤2.1、按照重量分数分别称量1-5份的蛋氨酸硒，2-3份的磷酸二氢钾，2-3份的磷酸二氢钠，1-2份的叶酸，3-10份的蚯蚓粘液，80-100份的无菌水，待用；
步骤2.2、将步骤2.1称量好的蛋氨酸硒、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、叶酸、蚯蚓粘液加入无菌水中，搅拌均匀后，室温下静止1-2小时后，得到富硒营养液；
步骤3、将步骤2配置的富硒营养液稀释，得到稀释的富硒营养液，待用；
步骤4、按照一定的质量比将步骤1得到的发酵贝莱斯芽胞杆菌菌剂和步骤3得到的稀释的富硒营养液混合均匀后，得到一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂。
2.根据权利要求1所述的一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂的制备方法，其特征在于：步骤1发酵贝莱斯芽胞杆菌菌剂具体方法包括如下步骤：
步骤1.1、将贝莱斯芽胞杆菌接种在具有LB液体培养基的三角瓶中，35℃，180r/min摇床中振荡培养48h，得到种子液，待用；
步骤1.2、将步骤1得到的种子液在YSP培养基中培养，培养温度30℃，接种量4%，装液量为250ml三角瓶中装液125ml，转速180r/min，摇床中振荡培养48h，得到发酵贝莱斯芽胞杆菌菌剂。
3.根据权利要求1或2所述的一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂的制备方法，其特征在于：步骤2中的YSP培养基包括蛋白胨2.0 g/L，酵母膏1.0 g/L，葡萄糖4.0g/L。
4.根据权利要求3所述的一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂的制备方法，其特征在于：步骤3配置的富硒营养液加入10-20倍的无菌水，搅拌均匀后，室温下静止1-2小时后，得到稀释的富硒营养液。
5.根据权利要求4所述的一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂的制备方法，其特征在于：步骤4中发酵贝莱斯芽胞杆菌菌剂和稀释的富硒营养液的质量比为1-4:1-4。
6.一种权利要求1-5之一所述的一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂的制备方法制备的菌剂，其特征在于：所述贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)为WZ-37，WZ-37已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.15766。
7.根据权利要求6所述的一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂的制备方法制备的菌剂，其特征在于：所述发酵贝莱斯芽胞杆菌菌剂和稀释的富硒营养液的质量比为3:2。
8.根据权利要求6所述的一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂的制备方法制备的菌剂，其特征在于：所述发酵贝莱斯芽胞杆菌菌剂和稀释的富硒营养液的质量比为2:3。
9.一种权利要求6-8之一所述的一种用于番茄的多功能复合贝莱斯芽胞杆菌菌剂的应用，其特征在于：用于番茄灰霉病的防效和番茄的促生长。
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