CN110250058A - 提高克氏原螯虾养殖成活率的复合制剂及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了提高克氏原螯虾养殖成活率的复合制剂及其使用方法。该制剂主要包括组分A和组分B。其中组分A为芽孢杆菌属30‑50%及好氧反硝化菌50‑70%；组分B为群感效应淬灭剂10‑15%，增效剂10‑15%，絮凝剂20‑30%，表面活性剂10‑15%，增氧剂20‑30%。本制剂先使用组分B，同时组分A经扩培后延后使用。本制剂可改善养殖环境底部氧化还原电位，降低养殖水体蓝藻、铜绿微囊藻的繁殖，通过组分A与组分B的协同序列施用，基于群感效应淬灭、微生物生态占位、微生物基质竞争、微生物代谢产物抑制等原理削减底部环境有害菌群与水体有害藻类，从而基本杜绝藻毒素、硫化氢、氨氮、亚硝酸盐等有毒物质产生，进而提高养殖克氏原螯虾的成活率。本制剂具有起效快且效果可持续性强等优点。

Description

提高克氏原螯虾养殖成活率的复合制剂及其使用方法
技术领域
本发明属于水产养殖技术领域，确切的说涉及通过改善养殖底部与水体环境实现提高克氏原螯虾养殖成活率的复合生物制剂制备技术及使用方法。
背景技术
克氏原螯虾 (Procambarus clarkia) ，俗称小龙虾，是深受消费者喜爱的产品，目前在我国已成为稻田养殖，池塘养殖的重要品种，也为保障菜篮子安全提供了有效支撑。
然而，养殖过程中由于高蛋白饲料大量投喂，极易导致底部环境产生毒性的氨氮、硫化氢、亚硝酸盐等物质。同时，残余营养元素在水体中，高温季节易导致藻类水华爆发（蓝藻、铜绿微囊藻）。克氏原螯虾由于其自身生理特点，底部环境及水环境为主要栖息生境，虽然其自身抗逆性较强，但若环境恶化严重则必然导致克氏原螯虾死亡率增加，养殖失败。即使养殖成功，由于环境条件不佳，导致其个体偏小或体色偏差（如存在“铁锈色”）等，同样大幅影响产品的最终售价。
常规水环境调控手段主要是换水，但换水不仅易造成克氏原螯虾应激，造成应激脱壳。由于其一生脱壳次数恒定，过多过早的脱壳导致其个体偏小。同时，换水也无法短期内改善底部环境与水环境，由于存在营养元素缺乏，极易导致有害藻类的爆发。目前已有的水质改良技术手段主要包括施用化学型制剂：如过氧化钙、过氧化氢、氧化钙、碱性过硫酸氢钾复合盐、硝化抑制剂等，化学制剂虽然在施用期间具有短期效果，但是其作用原理主要为与有毒有害物质反应，所以无法从本质上改变底部与水体环境的微生物菌群结构，缺乏长期稳定的效果。生物制剂主要包括芽孢杆菌、乳酸菌、丁酸羧菌等，对养殖克氏原螯虾的肠道具有保健作用，部分芽孢杆菌也具有消耗多余有机质的作用，但在环境中单独施用生物制剂往往存在“土著菌”与“入侵菌”间的竞争作用，导致效果不佳。
随着近来对微生物领域的不断深入研究，微生物单独个体会通过系列的行为来实现群体的特性，比如可通过群体感应效应来实现个体增殖、毒力表达、产物代谢等各种行为。目前在克氏原螯虾领域的生物制剂均为从“微生物个体”的角度来调整养殖环境，产品多为单独或复配菌株，忽略了基于微生物生态及“微生物群体属性”实现整体环境调控的手段，故常导致应用效果不佳甚至养殖失败。
发明内容
鉴于上述问题，本发明旨在提供提高克氏原螯虾养殖成活率的复合制剂及其使用方法。本发明通过组分A与组分B的协同序列施用可改善养殖环境底部氧化还原电位，基于群感效应淬灭、微生物生态占位、微生物基质竞争、微生物代谢产物拮抗等原理削减底部环境有害菌群，抑制水体有害藻类繁殖。从而基本杜绝藻毒素、硫化氢、氨氮、亚硝酸盐等有毒物质产生，进而提高养殖克氏原螯虾的成活率。本发明与常规生物菌剂及化学制剂相比，具有起效快且效果可持续性强的优点。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种提高克氏原螯虾养殖成活率的生物制剂，包括组分A、组分B，先施用组分B，再施用组分A；
其中所述的组分B包括群体感应淬灭剂、增效剂、絮凝剂、表面活性剂及增氧剂，
所述的群体感应淬灭剂，用于淬灭养殖底部有害菌群间的群体感应通讯，
所述的增效剂用于扩大淬灭剂的比表面积，
所述的絮凝剂及表面活性剂用于改变底部环境污泥的表面张力，
所述的增氧剂用于改善底部微环境的氧化还原电位；
其中所述的组分A包括芽孢杆菌、好氧反硝化菌，
所述的芽孢杆菌用于消耗有机质，分泌代谢产物抗菌肽，并可拮抗有害藻类；
所述的好氧反硝化菌用于竞争底部有机质，并同步去除氨氮、亚硝酸盐、硝酸盐。
按质量比，组分A包括芽孢杆菌30-50%及好氧反硝化菌50-70%；组分B包括群体感应效应淬灭剂10-20%，增效剂10-15%，絮凝剂20-30%，表面活性剂5-15%，增氧剂20-30%，先投加组分B，间隔4-6小时后，投加经过扩培的组分A。
按质量比组分A中，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 15-25%，凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans) 15-25%；所述的好氧反硝化菌包括假单胞菌(Pseudomonas) 25-35%，除烃海杆菌 (Marinobacter hydrocarbonoclasticus) 25-35%，以上均为模式菌株。
所述的芽孢杆菌和好氧反硝化菌菌株经过纯菌发酵后冷冻干燥保存，冷冻干燥过程参数为：温度 -5℃；压力0.1 mpa，冷冻保护剂为按质量比复配15%的海藻酸钠和15%的脱脂奶粉。
B组分中所述的群体感应效应淬灭剂选自香草醛、乙酰转移酶、次氯酸钙、硝酸钠，或上述几种的混合物。
B组分中所述的增效剂物质选自活性炭粉、氢氧化钙，或上述两种的混合物。
组分B中所述的絮凝剂为聚丙烯酰胺；所述的表面活性剂为十二烷基硫酸钠；所述的增氧剂选自过氧化钙或过碳酸钠。
一种所述的生物制剂的使用方法，为先投加组分B，具体用量为5-15 mg/m3 水体，间隔4-6小时后，投加经过扩培的组分A液体，扩培液体OD600值要求≥2.0，具体的用量为3-5mL/m3水体。
所述组分A的扩培方法，具体为：500 g 组分A，含冷冻干燥后的纯菌粉并按质量比搭配15%的海藻酸钠和15%的脱脂奶粉，可培养200 L液体，要求营养液含有的营养元素为：食用红糖 20 g/L，硝酸钾300 mg/L，硫代硫酸钠50 mg/L，七水硫酸镁50 mg/L，磷酸二氢钾15 mg/L，培养水温25-35℃，培养时间36-48小时。
本发明的有益效果为：
（1）本发明组分B中群体感应淬灭剂，可有效淬灭养殖底部有害菌群间的群体感应通讯，降低弧菌、嗜水气单胞菌、氨氧化菌的AI (Auto-inducer)类自诱导物质、AHL(Homoserine Lactone)高丝氨酸内酯信号分子等，从而降低上述菌群的增殖和毒力表达。组分B中的增效剂可有效扩大淬灭剂的比表面积，增加应用效能，絮凝剂及表面活性剂可改变底部环境污泥的表面张力，进一步增加淬灭剂的效能。增氧剂经过增效剂载体，进一步改善底部微环境的氧化还原电位，削减有害菌群的生态位宽度。
（2）组分A的枯草芽孢杆菌，可有效利用有机质，同步分泌抗菌肽抑制有害病菌与藻类，组分A中的凝结芽孢杆菌，可有效利用有机质，促进底泥氮、磷循环利用，分泌乳酸、多种消化酶等代谢产物强化小龙虾肠道健康。组分A中的好氧反硝化菌，可有效竞争底部有机质，其中假单胞菌在利用有机物过程可直接去除硝酸盐、亚硝酸盐和氨氮；海杆菌可直接去除亚硝酸盐和硝酸盐。同时，此两类菌协同施用的情况下，通过前期施用的组分B可对有害菌群进行有效生态位竞争，并通过生态占位与自身代谢产物拮抗有害藻类，从而保持长期稳定的优质底部与水体环境，避免高温季节养殖失败。
具体实施方式
下面结合实施方式对本发明作进一步阐述。
实施例1
克氏原螯虾水泥池养殖应用案例。本实施例包括组分A和组分B，其中组分A为枯草芽孢杆菌25%，凝结芽孢杆菌25%，假单胞菌25%，除烃海杆菌25%。组分B为香草醛18%，乙酰转移酶17%，活性炭粉15%，聚丙烯酰胺20%，十二烷基硫酸钠15%，过氧化钙15%。组分B的用量为15mg/m3 水体；扩配后的组分A用量为5 mL/m3 水体。
表一为该实施例应用于克氏原螯虾水泥池养殖的效果：
表1. 复合制剂水泥池应用效果
项目 数值
施用前NH<sub>4</sub><sup>+</sup>-N (mg/L) 0.8±0.2 mg/L
施用前NO<sub>2</sub><sup>-</sup>-N (mg/L) 0.5±0.1 mg/L
施用前NO<sub>3</sub><sup>-</sup>-N (mg/L) 2.4±0.3 mg/L
施用后NH<sub>4</sub><sup>+</sup>-N (mg/L) 0.2±0.1 mg/L
施用后NO<sub>2</sub><sup>-</sup>-N (mg/L) 0.2±0.2 mg/L
施用后NO<sub>3</sub><sup>-</sup>-N (mg/L) 0.6±0.4 mg/L
养殖成活率<sup>a</sup> 88%
对比池养殖成活率<sup>b</sup> 72%
备注：a, 养殖过程120天，复合制剂共使用3次，平均间隔时间40天；b，除复合制剂外，其余操作与a相同。
实施例2
克氏原螯虾土池养殖应用案例。本实施例包括组分A和组分B，其中组分A为枯草芽孢杆菌15%，凝结芽孢杆菌17%，假单胞菌33%，除烃海杆菌35%。组分B为香草醛12%，乙酰转移酶13%，硝酸钠10%，活性炭粉10%，氢氧化钙5%，聚丙烯酰胺20%，十二烷基硫酸钠15%，过碳酸钠15%。组分B的用量为5 mg/m3 水体；扩配后的组分A用量为3 mL/m3 水体。
表二为该实施例应用于克氏原螯虾土池养殖的效果：
表2. 复合制剂土池应用效果
项目 数值
施用前NH<sub>4</sub><sup>+</sup>-N (mg/L) 0.5±0.2 mg/L
施用前NO<sub>2</sub><sup>-</sup>-N (mg/L) 1.1±0.3 mg/L
施用前NO<sub>3</sub><sup>-</sup>-N (mg/L) 1.5±0.2 mg/L
施用后NH<sub>4</sub><sup>+</sup>-N (mg/L) 0.2±0.1 mg/L
施用后NO<sub>2</sub><sup>-</sup>-N (mg/L) 0.1±0.1 mg/L
施用后NO<sub>3</sub><sup>-</sup>-N (mg/L) 0.7±0.2 mg/L
养殖成活率<sup>a</sup> 72%
对比池养殖成活率<sup>b</sup> 61%
备注：a, 养殖过程147天，复合制剂共使用3次，平均间隔时间50天；b，除复合制剂外，其余操作与a相同
实施例3
克氏原螯虾稻田养殖应用案例。本实施例包括组分A和组分B，其中组分A为枯草芽孢杆菌20%，凝结芽孢杆菌30%，假单胞菌25%，除烃海杆菌25%。组分B为香草醛5%，乙酰转移酶5%，硝酸钠10%，活性炭粉10%，氢氧化钙10%，聚丙烯酰胺30%，十二烷基硫酸钠15%，过碳酸钠15%。组分B的用量为7 mg/m3 水体；扩配后的组分A用量为4 mL/m3 水体。
表三为该实施例应用于克氏原螯虾稻田养殖的效果：
表3. 复合制剂稻田养殖应用效果
项目 数值
施用前NH<sub>4</sub><sup>+</sup>-N (mg/L) 0.4±0.1 mg/L
施用前NO<sub>2</sub><sup>-</sup>-N (mg/L) 0.3±0.2 mg/L
施用前NO<sub>3</sub><sup>-</sup>-N (mg/L) 0.7±0.1 mg/L
施用后NH<sub>4</sub><sup>+</sup>-N (mg/L) 0.1±0.1 mg/L
施用后NO<sub>2</sub><sup>-</sup>-N (mg/L) 0.2±0.1 mg/L
施用后NO<sub>3</sub><sup>-</sup>-N (mg/L) 0.6±0.3 mg/L
养殖成活率<sup>a</sup> 77%
对比池养殖成活率<sup>b</sup> 65%
备注：a, 养殖过程160天，复合制剂共使用3次，平均间隔时间50天；b，除复合制剂外，其余操作与a相同
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解，根据已经公开的教导和启示，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (9)

1.一种提高克氏原螯虾养殖成活率的生物制剂，其特征在于，包括组分A、组分B，先施用组分B，再施用组分A；
其中所述的组分B包括群体感应淬灭剂、增效剂、絮凝剂、表面活性剂及增氧剂，
所述的群体感应淬灭剂，用于淬灭养殖底部有害菌群间的群体感应通讯，
所述的增效剂用于扩大淬灭剂的比表面积，
所述的絮凝剂及表面活性剂用于改变底部环境污泥的表面张力，
所述的增氧剂用于改善底部微环境的氧化还原电位；
其中所述的组分A包括芽孢杆菌、好氧反硝化菌，
所述的芽孢杆菌用于消耗有机质，分泌代谢产物抗菌肽，并可拮抗有害藻类；
所述的好氧反硝化菌用于竞争底部有机质，并同步去除氨氮、亚硝酸盐、硝酸盐。
2.如权利要求1所述的生物制剂，其特征在于，按质量比，组分A包括芽孢杆菌30-50%及好氧反硝化菌50-70%；组分B包括群体感应效应淬灭剂10-20%，增效剂10-15%，絮凝剂20-30%，表面活性剂5-15%，增氧剂20-30%，先投加组分B，间隔4-6小时后，投加经过扩培的组分A。
3.如权利要求2所述的生物制剂，其特征在于，按质量比组分A中，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 15-25%，凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans) 15-25%；所述的好氧反硝化菌包括假单胞菌(Pseudomonas) 25-35%，除烃海杆菌 (Marinobacter hydrocarbonoclasticus) 25-35%，以上均为模式菌株。
4.如权利要求3所述的生物制剂，其特征在于，所述的芽孢杆菌和好氧反硝化菌菌株经过纯菌发酵后冷冻干燥保存，冷冻干燥过程参数为：温度 -5℃；压力0.1 mpa，冷冻保护剂为按质量比复配15%的海藻酸钠和15%的脱脂奶粉。
5.如权利要求2所述的生物制剂，其特征在于，B组分中所述的群体感应效应淬灭剂选自香草醛、乙酰转移酶、次氯酸钙、硝酸钠，或上述几种的混合物。
6.如权利要求2所述的生物制剂，其特征在于，B组分中所述的增效剂物质选自活性炭粉、氢氧化钙，或上述两种的混合物。
7.如权利要求2所述的生物制剂，其特征在于，组分B中所述的絮凝剂为聚丙烯酰胺；所述的表面活性剂为十二烷基硫酸钠；所述的增氧剂选自过氧化钙或过碳酸钠。
8.一种如权利要求2所述的生物制剂的使用方法，其特征在于，为先投加组分B，具体用量为5-15 mg/m3 水体，间隔4-6小时后，投加经过扩培的组分A液体，扩培液体OD600值要求≥2.0，具体的用量为3-5 mL/m3水体。
9.如权利要求8所述的使用方法，其特征在于，所述组分A的扩培方法，具体为：500 g组分A，含冷冻干燥后的纯菌粉并按质量比搭配15%的海藻酸钠和15%的脱脂奶粉，可培养200 L液体，要求营养液含有的营养元素为：食用红糖 20 g/L，硝酸钾300 mg/L，硫代硫酸钠50 mg/L，七水硫酸镁50 mg/L，磷酸二氢钾 15 mg/L，培养水温25-35℃，培养时间36-48小时。
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