CN112516068A - 枯草芽孢杆菌在抑菌除臭和清洁产品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及保藏号为CCTCC M 2016442的枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)的如下任一应用：(1)在抑制细菌和/或真菌、去除臭味中的应用；(2)在制备抑制细菌和/或真菌、去除臭味的清洁产品中的应用，所述清洁产品为洗手液、香皂、止痒露、沐浴露、洗发露或宠物香波。该枯草芽孢杆菌还可以直接加入到清洁产品中，为个人清洁护理或者宠物毛发清洁带来便捷、安全和有效的杀菌效果。该枯草芽孢杆菌不仅生命力强，还可以分泌高效活性物质，分解能够产生恶臭气体的有机物质及油脂，达到去污除臭的效果，其还具有高效的抑菌能力。本发明提供的宠物香波泡沫细腻丰富、易冲洗，不仅可以高效去污除菌、减少螨虫滋生，长期使用还可以缓解宠物掉毛、重塑健康肌理。
Description
技术领域
本发明涉及枯草芽孢杆菌在抑菌除臭和清洁产品中的应用，属于微生物技术领域，同时也属于日化产品技术领域。
背景技术
人们在日常生活中，特别是春季和夏季，环境湿度增大，气温上升，各种各样的细菌和病毒活跃起来，作为环境与生物本体间的界面，细菌和病毒总是随着物品之间的接触和其他渠道不断传播到人体的皮肤上。据2009年5月29日的《科学》杂志报道：人体的皮肤是细菌的“理想家园”，人体表层共覆盖着大约1000种细菌，寄居在皮肤上的细菌无论是数量还是种类都达到令人吃惊的程度。特别是在潮湿并长有毛发的腋下和头皮下，就好像是热带雨林，为细菌的滋生提供了非常好的生活环境。皮肤上的这些细菌给人们生活带来了很大的安全隐患，并引起一些皮肤疾病，如头屑、湿疹、牛皮癣、痤疮、耐抗生素传染病等。随着人们生活质量的提升，个人卫生越来越多地被消费者所认识和重视，抗菌护肤的个人护理品也成为了人们的必需品，如具有抗菌功能的香皂、药皂、洗手液、沐浴液、洗发水、香波等清洁产品。但目前这些产品的抑菌活性成分还主要是一些化学合成的抑菌剂和杀菌剂，对人体皮肤具有较大的危害，长期使用易产生依赖性。这些化学物质会刺激皮肤，若长期使用，容易造成皮肤粗糙、皴裂、脱皮和敏感，从而破坏其自身天然屏障，造成反复感染。
此外，随着宠物饲养观念的普及和宠物行业延伸服务的挖掘，越来越多的人们喜欢饲养宠物来消磨休闲时光，如宠物狗、宠物猫、宠物兔等。殊不知这些带毛的宠物对家居生活隐藏着很多健康危害。猫狗等动物茂密的毛发容易滋生寄生虫、尘螨等，同时也很容易感染病原微生物。这些潜在的病原体不仅会危害宠物的健康，还会造成人宠交叉感染。
传统的宠物香波主要由增稠剂、软化剂、螯合剂、防腐剂、芳香剂、表面活性剂等组成，这种宠物香波大多为清洁型，只能清洗掉宠物毛发表面的灰尘和部分细菌，而能够去除细菌并抑制有害菌的生长才可以达到真正的洁净。因此，宠物香波不应只具有单纯的清洁功效。能够清洁宠物毛发、祛除异味的同时，还能抑制有害微生物的生长，多功能且安全环保的宠物香波将会受到更多消费者的喜爱。
因此，寻找安全、无毒、高效的，能够抑制细菌或真菌的生长，去污除臭能力强，且刺激性低、不易产生依赖性，可以长时间使用的天然杀菌物质是具有抗菌功能的日化产品的发展方向。
发明内容
本发明的目的在于提供枯草芽孢杆菌在抑菌除臭和清洁产品中的应用，其不仅安全健康、无刺激，还能够清洁人体或宠物皮肤/毛发、祛除异味、抑制有害微生物生长。
为了实现本发明的目的，本发明的第一方面提供了保藏号为CCTCC M 2016442的枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)的如下任一应用：
(1)保藏号为CCTCC M 2016442的枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)在抑制细菌和/或真菌、去除臭味中的应用；
(2)保藏号为CCTCC M 2016442的枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)在制备抑制细菌和/或真菌、去除臭味的清洁产品中的应用，其中，所述清洁产品为洗手液、香皂、止痒露、沐浴露、洗发露或宠物香波。
本发明的第二方面提供了一种通过向清洁产品加入有效量的保藏号为CCTCC M2016442的枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)对抗细菌和/或真菌、去除臭味的方法，所述清洁产品为洗手液、香皂、止痒露、沐浴露、洗发露或宠物香波。
进一步的，所述细菌包括金黄色葡萄球菌和大肠杆菌中的至少一种；
所述真菌为白色念珠菌。
进一步的，在制备得到的清洁产品中或者在加入所述枯草芽孢杆菌后的清洁产品中，所述枯草芽孢杆菌的含量≥1.0×106CFU/mL。
本发明的第三方面提供了一种宠物香波，其含有保藏号为CCTCC M 2016442的枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)作为有效成分。
进一步的，所述枯草芽孢杆菌的含量≥1.1×106CFU/mL。
进一步的，所述枯草芽孢杆菌为活菌。
进一步的，所述宠物香波还包括表面活性剂、防腐剂和水；
在所述宠物香波中，各组分的重量百分含量为：
枯草芽孢杆菌，0.1％～1％；
表面活性剂，1％～10％；
防腐剂，0.1％～1％；
余量为水。
进一步的，所述表面活性剂为椰子油二乙醇酰胺、十二烷基硫酸钠中的一种或多种。
进一步的，所述防腐剂为乙基己基甘油、苯氧乙醇中的一种或多种。
区别于现有技术，本发明具有以下有益效果：
1、在本发明中，保藏号为CCTCC M 2016442的枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)不仅生命力强，还可以分泌高效活性物质，分解能够产生恶臭气体的有机物质及油脂，达到去污除臭的效果。该枯草芽孢杆菌还具有高效的抑菌能力，通过生物竞争的方式，它能够快速占据生存空间，抑制有害菌、病原菌等有害微生物的生长繁殖，从而起到除菌的作用。
2、保藏号为CCTCC M 2016442的枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)可以用于制备或者直接加入到洗手液、香皂、止痒露、沐浴露、洗发露、香波等清洁产品中，为个人清洁护理或者宠物毛发清洁带来了便捷、安全和有效的杀菌效果。
3、本发明提供的宠物香波泡沫细腻丰富、易冲洗，不仅可以高效去污除菌、减少螨虫滋生，长期使用还可以缓解宠物掉毛、重塑健康肌理。
具体实施方式
为详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例详予说明。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的原料、辅料、试剂及器材等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。
首先，对本发明实施例中涉及的原料、试剂及其制备方法等进行说明。
枯草芽孢杆菌：
本发明涉及的保藏号为CCTCC M 2016442的枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)以引述中国发明专利CN106479939B的方式并入本文以供参考。在中国发明专利CN106479939B中，公开了该枯草芽孢杆菌及其在禽畜消化方面的应用。具体的，本发明涉及的保藏号为CCTCC M 2016442的枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)保藏于中国微生物菌种保藏中心CCTCC，保藏编号为：CCTCC M 2016442，保藏日期为：2016年9月1日，分类命名的拉丁名称：Bacillus Subtilis。该菌株可发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和甘露醇，形成酸，不产气，不分解乳糖，不形成吲哚、硫化氢；产酶有淀粉酶、过氧化氢、蛋白酶、解胶酶、纳豆激酶等；菌落表面粗糙、干燥，中间突起，呈圆环形；不透明，为灰白色；边缘不扩张，向上微隆，菌落形态呈片状或圆饼状；细胞杆状，有芽孢，芽孢椭圆形中生或近中生，芽孢囊不明显膨大；明胶液化测定：菌株分解明胶，呈阳性在7％氯化钠中生长，V-P测定阳性，硝酸盐还原阳性，能从D-甘露醇产酸，不利用丙酸盐。该枯草芽孢杆菌可产生纳豆激酶，改善禽畜的血液循环，提高禽畜的免疫力，同时产生消化酶能力强，可促进禽畜对饲料的消化。
经过发明人的大量研究和实践验证，发现保藏号为CCTCC M 2016442的枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)还具有高效的去污除臭以及抑菌能力，并且相比于其它类型的枯草芽孢杆菌菌株，其具有更强的抑菌能力。因此，在本发明中，提供的是保藏号为CCTCC M2016442的枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)在抑制细菌和/或真菌、去除臭味中的新应用。
培养基的制备：
(1)营养琼脂培养基的制备：分别称取牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g、琼脂粉15.0g、氯化钠5.0g置于1000mL烧杯中，加无菌水1000mL使其溶解，煮沸，冷却至60℃，用1mol/L氢氧化钠或1mol/L盐酸将pH值调节为7.2～7.4，分装到250mL三角瓶中，塞上透气塞子，121℃高压灭菌20min，冷藏备用。
(2)营养肉汤培养基的制备：分别称取牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g、氯化钠5.0g置于1000mL烧杯中，加无菌水1000mL使其溶解，煮沸，冷却至60℃，用1mol/L氢氧化钠或1mol/L盐酸将pH值调节为7.2～7.4，分装到250mL或500mL三角瓶或者10mL或25mL试管中，塞上透气塞子，121℃高压灭菌20min，冷藏备用。
(3)金黄色葡萄球菌显色培养基：用于金黄色葡萄球菌的平板菌落计数，购自广东环凯微生物科技有限公司。
(4)马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：用于白色念珠菌的平板菌落计数，购自广东环凯微生物科技有限公司。
(5)结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)：用于大肠菌群的平板菌落计数，购自广东环凯微生物科技有限公司。
微生物繁殖体悬液的制备：
本发明实施例中以金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌以及白色念珠菌作为试验菌。
(1)金黄色葡萄球菌(CICC10384)细菌繁殖体悬液的制备：取冻干菌种管，在无菌操作下打开，用无菌吸管吸取0.5mL液体培养基于管中将冻干菌粉全部溶解。取营养肉汤培养基5.0mL～10mL/试管，滴入少许菌种悬液，置于37℃培养箱中培养24h，用接种环取第一代培养的菌悬液，划线接种于斜面试管中，于37℃培养箱中培养24h即为第3代培养物。取菌种新鲜培养物，吸取5mL无菌水加入斜面试管中，反复吹吸，洗下菌苔，随后将洗液移至另一支无菌试管中，用电动混合器混匀，即得金黄色葡萄球菌悬液(菌体浓度为1.0×105～1.0×106CFU/mL)。
(2)大肠埃希氏菌(CICC10389)细菌繁殖体悬液的制备：在无菌操作下，用接种环挑取一环冻干菌粉，加入营养肉汤培养基(500mL的三角瓶)中混合均匀，于37℃条件下静置培养24h；用接种环将培养好的菌悬液划线于已凝固的无菌营养琼脂培养基平板上，置于37℃生化培养箱中培养24h；用接种环挑取单菌落，加入新的营养肉汤培养基中混合均匀，置于37℃条件下静置培养24h，得到大肠埃希氏菌悬液(菌体浓度为1.0×105～1.0×106CFU/mL)。
(3)白色念珠菌(ATCC10231)细菌繁殖体悬液的制备：在无菌操作下，用接种环挑取一环冻干菌粉，加入营养肉汤培养基(500mL的三角瓶)中混合均匀，于28℃条件下静置培养24h；用接种环将培养好的菌悬液划线于已凝固的无菌营养琼脂培养基平板上，置于28℃生化培养箱中培养24h；用接种环挑取单菌落，加入新的营养肉汤培养基中混合均匀，置于28℃条件下静置培养24h，得到白色念珠菌悬液(菌体浓度为1.0×106～1.0×107CFU/mL)。
上述各细菌繁殖体悬液保存在4℃冰箱中备用，且应当天使用，不可过夜。
接着，通过具体实施例对本发明进行详细说明，但是本发明并不限定于以下的实施方式。
实验例1枯草芽孢杆菌抑菌能力的探究
为了探究本发明的枯草芽孢杆菌的抑菌能力，进行了如下对比实验。
1、试验菌：金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌和白色念珠菌。
2、测试菌株：
样品1：枯草芽孢杆菌浓缩菌粉(CCTCC M 2016442)；
样品2：枯草芽孢杆菌浓缩菌粉(CCTCC M 2016441)；
样品3：枯草芽孢杆菌浓缩菌粉(CICC 21735)；
样品1～样品3的菌体浓度均为1.0×106CFU/g。
(3)操作步骤：
分别以金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌和白色念珠菌为试验菌。设置实验组1～3：在无菌操作下，吸取1mL细菌繁殖体悬液加入到98mL营养肉汤培养基中，再加入1.0g样品1，混合均匀，记作实验组1；吸取1mL细菌繁殖体悬液加入到98mL营养肉汤培养基中，再加入1.0g样品2，混合均匀，记做实验组2；吸取1mL细菌繁殖体悬液加入到98mL营养肉汤培养基中，再加入1.0g样品3，混合均匀，记作实验组3；吸取1mL细菌繁殖体悬液加入到98mL营养肉汤培养基中，再加入1mL无菌水，混合均匀，记作空白对照组。每组设置3个平行进行重复实验。
共培养后的菌落计数：将上述实验组和对照组的混合培养物放置于37℃(其中，白色念珠菌对应的组别置于28℃培养箱内培养)、200r/min的恒温培养振荡中振荡培养，经过48小时的共培养后，采用平板计数法，分别测定各组混合培养物所对应的试验菌的菌落数。吸取各实验组和对照组对应的样液(或用生理盐水作适当的稀释后，取其中2-3个稀释度的稀释液)1mL，置于灭菌平板内，每个样液接种三个灭菌平板。用凉至40℃～45℃的琼脂培养基(金黄色葡萄球菌对应的组别采用金黄色葡萄球菌显色培养基，大肠埃希氏菌对应的组别采用VRBA培养基，白色念珠菌对应的组别采用PDA培养基)作倾注，绕8字混合均匀，待培养基凝固后倒扣平板于37℃培养箱内培养，(其中，白色念珠菌对应的组别置于28℃培养箱内培养)，48h后对试验菌的菌落数进行测定并计数。
表1各枯草芽孢杆菌对试验菌的抑制程度
注：表中数据为三次重复实验的平均值；—表示抑菌率为<0；+表示抑菌率为75％～85％；++表示抑菌率为86％～95％；+++表示抑菌率为96％～98％。
抑菌率的计算公式：
式中：X——抑菌率，％；
A——空白组共培养后平均菌落数；
B——实验组共培养后平均菌落数。
实验例2枯草芽孢杆菌有效抑菌用量的探究
为了探究本发明的枯草芽孢杆菌(CCTCC M 2016442)的有效抑菌用量，进行了如下的对比实验。
实验组：以无菌水作为悬浮液，体系内枯草芽孢杆菌均匀分散：
①菌含量为1.0×104CFU/mL的枯草芽孢杆菌悬液；
②菌含量为1.0×105CFU/mL的枯草芽孢杆菌悬液；
③菌含量为1.0×106CFU/mL的枯草芽孢杆菌悬液；
④菌含量为1.0×107CFU/mL的枯草芽孢杆菌悬液；
⑤菌含量为1.0×108CFU/mL的枯草芽孢杆菌悬液。
2、具体操作：
以金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌和白色念珠菌为试验菌。设置实验组1～5：在无菌操作下，分别吸取1mL的细菌繁殖体悬液，分别加入98mL的营养肉汤培养基，混合均匀，再分别加入1mL实验组①～⑤的试剂，得到实验组①～⑤，每组设置3个平行进行重复实验。同时设置空白对照组：吸取1mL的细菌繁殖体悬液，加入98mL的营养肉汤培养基，混合均匀，再加入1mL无菌水，同样设置3个平行。
共培养后的菌落计数：将上述实验组和对照组的混合培养物放置于37℃(其中，白色念珠菌对应的组别置于28℃培养箱内培养)、200r/min的恒温培养振荡中振荡培养，经过48小时的共培养后，采用平板计数法，分别测定各组混合培养物所对应的试验菌的菌落数。吸取各实验组和对照组对应的样液(或用生理盐水作适当的稀释后，取其中2-3个稀释度的稀释液)1mL，置于灭菌平板内，每个样液接种三个灭菌平板。用凉至40℃～45℃的琼脂培养基(金黄色葡萄球菌对应的组别采用金黄色葡萄球菌显色培养基，大肠埃希氏菌对应的组别采用VRBA培养基，白色念珠菌对应的组别采用PDA培养基)作倾注，绕8字混合均匀，待培养基凝固后倒扣平板于37℃培养箱内培养，(其中，白色念珠菌对应的组别置于28℃培养箱内培养)，48h后对试验菌的菌落数进行测定并计数。
表2不同浓度枯草芽孢杆菌的抑菌程度
注：表中数据为三次重复实验的平均值；—表示抑菌率为<0；+表示抑菌率为75％～85％；++表示抑菌率为86％～95％；+++表示抑菌率为96％～98％；++++表示抑菌率为99％～100％；抑菌率的计算公式和实验例1中的相同。
上述结果表明，当枯草芽孢杆菌(CCTCC M 2016442)的菌含量大于等于1.0×106CFU/mL时，其抑菌率可达86％～95％。可见，本发明的枯草芽孢杆菌(CCTCC M 2016442)的有效抑菌用量为≥1.0×106CFU/mL。在以下实施例中，以枯草芽孢杆菌含量为1.0×106CFU/mL的清洁产品作为示例性说明。
实施例1抑菌沐浴露的制备
本实施例给出了一种抑菌沐浴露，其组分按质量分数计为：脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠AES 16％、烷醇酰胺65013％、椰油酰胺丙基甜菜碱CAB-355％、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)0.05％、柠檬酸0.05％、珠光片1.6％、氯化钠0.8％、香精0.1％、枯草芽孢杆菌1％(使得菌含量为1.0×106CFU/mL)，余量为纯化水。
抑菌沐浴露的制备方法：纯化水加热到85℃，依次加入脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠AES、椰油酰胺丙基甜菜碱CAB-35、烷醇酰胺6501，使原料充分溶解后，加入EDTA-2Na、柠檬酸，搅拌溶解后，将温度调整到75℃，加入珠光片，搅拌均匀，通入冷却水，缓慢冷却到45℃，加入香精和枯草芽孢杆菌、氯化钠，搅拌均匀，继续冷却到38℃。取样检验合格后灌装为抑菌沐浴露成品。
实施例2抑菌香皂的制备
本实施例给出了一种抑菌香皂，其组分按质量分数计为：纯化水2％、EDTA-2Na0.1％、叔丁基羟基苯甲醚BHA 0.02％、香精1％、钛白粉0.4％、枯草芽孢杆菌1％(使得菌含量为1.0×106CFU/mL)，余量为皂基。
抑菌香皂的制备方法：将纯化水、EDTA-2Na、叔丁基羟基苯甲醚香精、以及枯草芽孢杆菌混合、搅拌溶解均匀，得到混合液；将钛白粉与皂基混合均匀，得到混合物；然后混合液喷入混合物中，拌和均匀，经过三辊研磨机研磨均匀后，再经过压条、切块、打印等操作，即可制得抑菌香皂。取样检验合格后灌装为抑菌香皂成品。
实施例3抑菌宠物香波的制备
本实施例给出了一种抑菌宠物香波，其组分按质量分数计为：枯草芽孢杆菌1％(使得菌含量为1.0×106CFU/mL)、椰子油二乙醇酰胺8％、乙基己基甘油0.6％，余量为纯化水。
抑菌宠物香波的制备方法：在搅拌条件下，将椰子油二乙醇酰胺、纯化水搅拌、溶解均匀；再加入枯草芽孢杆菌、乙基己基甘油搅拌、溶解均匀。充分搅拌均匀后过滤出料，将半成品密封后放置陈化间，陈化时间为48h。同时取样检测半成品的感官指标、理化指标、微生物指标等，检验合格后再进行灌装、包装。
抑菌宠物香波的使用方法：使用抑菌宠物香波前，先将其轻轻摇匀，再用温水将宠物的毛发打湿，将香波涂抹在宠物的周身进行泡泡浴，轻揉宠物毛发并做适当的按摩，然后用清水反复冲洗，彻底冲净泡沫后再擦干宠物毛发。
在其它实施例中，表面活性剂椰子油二乙醇酰胺亦可以采用十二烷基硫酸钠作为替代；防腐剂乙基己基甘油亦可以采用苯氧乙醇作为替代。
实施例4抑菌洗手液的制备
本实施例给出了一种抑菌洗手液，其组分按质量分数计为：月桂醇聚醚硫酸酯钠10％、椰油酰胺丙基甜菜碱2％、月桂基羟基磺基甜菜碱1％、月桂醇硫酸酯铵4％、椰油酰甘氨酸钾2％、柠檬酸0.01％、纯化水74.39％、枯草芽孢杆菌3％(使得菌含量为1.0×106CFU/mL)、苯氧乙醇0.35％、EDTA-2Na0.05％、香精0.2％、氯化钠2％、甘油1％。
抑菌洗手液的制备方法：在搅拌条件下，将月桂醇聚醚硫酸酯钠、月桂醇硫酸酯铵、椰油酰胺丙基甜菜碱、月桂基羟基磺基甜菜碱、椰油酰甘氨酸钾、柠檬酸、纯化水搅拌、溶解均匀；接着，加入枯草芽孢杆菌、苯氧乙醇、EDTA-2Na、香精、氯化钠、甘油，搅拌、溶解均匀。充分搅拌均匀后过滤出料，将半成品密封后放置陈化间，陈化时间为48h。同时取样检测半成品的感官指标、理化指标、微生物指标等，检验合格后再进行灌装、包装。
实验例3清洁产品的发泡性能测试
1、试验材料
实施例1～4的清洁产品、纯化水。
2、试验方法
采用搅动法测试泡沫体积：称取0.5g样品(实施例1～4的清洁产品中的任意一种)于100mL量筒中，加入20mL纯化水，用玻璃棒均匀搅拌100次，于1min时读取泡沫体积值，重复三次，取平均值。
3、测试结果
表3清洁产品的发泡性能测试结果
| 组别 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 |
| 泡沫体积值 | 68mL | 65mL | 66mL | 64mL |
按上述方法进行测试后，各实施例清洁产品的泡沫体积均达到60mL以上，发泡性能良好。
实验例4清洁产品的抑菌效果测试
1、对金黄色葡萄球菌的抑制效果
在无菌操作下，吸取15mL清洁产品添加到85mL已灭菌的金黄色葡萄球菌显色培养基中混合均匀；吸取15mL 75％乙醇添加到85mL已灭菌的金黄色葡萄球菌显色培养基中混合均匀；吸取15mL无菌水添加到85mL已灭菌的金黄色葡萄球菌显色培养基中混合均匀。将三种混合培养基分别倒三个平皿，待凝固后备用。
吸取金黄色葡萄球菌悬液1mL接种于含15％清洁产品的金黄色葡萄球菌显色培养基平皿(清洁产品实验组)；另取1mL金黄色葡萄球菌悬液接种于含15％乙醇的金黄色葡萄球菌显色培养基平皿(乙醇实验组)；另取1mL金黄色葡萄球菌悬液接种于含15％无菌水的金黄色葡萄球菌显色培养基平皿(空白对照组)。将三组实验置于37℃生化培养箱中培养48h，观察菌落生长情况。
2、对大肠埃希氏菌的抑制效果
在无菌操作下，吸取15mL清洁产品添加到85mL已灭菌的VRBA培养基中混合均匀；吸取15mL 75％乙醇添加到85mL已灭菌的VRBA培养基中混合均匀；吸取15mL无菌水添加到85mL已灭菌的VRBA培养基中混合均匀。将三种混合培养基分别倒三个平皿，待凝固后备用。
吸取大肠埃希氏菌悬液1mL接种于含15％清洁产品的VRBA培养基平皿(清洁产品实验组)；另取1mL大肠埃希氏菌悬液接种于含15％乙醇的VRBA培养基平皿(乙醇实验组)；另取1mL大肠埃希氏菌悬液接种于含15％无菌水的VRBA培养基平皿(空白对照组)。将三组实验置于37℃生化培养箱中培养48h，观察菌落生长情况。
3、对白色念珠菌的抑制效果
在无菌操作下，吸取15mL清洁产品添加到85mL已灭菌的PDA培养基中混合均匀；吸取15mL 75％乙醇添加到85mL已灭菌的PDA培养基中混合均匀；吸取15mL无菌水添加到85mL已灭菌的PDA培养基中混合均匀。将三种混合培养基分别倒三个平皿，待凝固后备用。
吸取白色念珠菌悬液1mL接种于含15％清洁产品的PDA培养基平皿(清洁产品实验组)；另取1mL白色念珠菌悬液接种于含15％乙醇的PDA培养基平皿(乙醇实验组)；另取1mL白色念珠菌悬液接种于含15％无菌水的PDA显色培养基平皿(空白对照组)。将三组实验置于28℃生化培养箱中培养48h，观察菌落生长情况。
实验结果如表4所示，抑菌程度用“+”表示。
表4清洁产品对试验菌的体外抑制效果
注：表中数据为三次重复实验的平均值；—表示抑菌率为<0；+表示抑菌率为75％～85％；++表示抑菌率为86％～95％；+++表示抑菌率为96％～98％；++++表示抑菌率为99％～100％。
上述结果表明，各实施例的清洁产品对金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、白色念珠菌均表现出了很好的抑制效果。
实验例5清洁产品的刺激性、过敏性测试
将160只小白鼠均分为4组，每组40只，在每只小白鼠背部的相同位置均剪取相同大小的毛发并露出表皮；在每只小白鼠的去毛位置均匀涂抹等量沐浴露。其中，第一组小白鼠涂抹实施例1制备的抑菌沐浴露；第2组小白鼠涂抹实施例2制备的抑菌香皂；第3组小白鼠涂抹实施例3制备的抑菌宠物香波；第4组小白鼠涂抹实施例4制备的抑菌洗手液。涂抹2h后水洗，将涂抹部位与未涂抹部位的皮肤状态进行比较，观察各组小白鼠涂抹部位皮肤有无出现发红、起疹、起泡现象。
经观察，各组试验小白鼠涂抹部位均未出现发红、起疹、起泡现象，说明采用本发明提供的抑菌组合物制备的沐浴露、香皂、宠物香波、洗手液均较为温和、无刺激性和过敏反应，不会引起皮肤不良反应。
实验例6抑菌宠物香波的体外杀螨效果测试
选取临床上感染螨类外寄生虫的宠物犬、猫共20例。感染螨病的宠物眼眶周围、鼻部脱毛明显，部分宠物脱毛部位皮肤出现色素沉淀。采取毛样、用手术刀片刮取皮屑于培养皿中，镜检后均可见螨虫活体。
每日为患病犬、猫使用实施例3制备的抑菌宠物香波，于7日后再次采取毛样、皮屑镜检观察螨虫活动状况，发现螨虫数量、活性与使用抑菌宠物香波前明显减少和降低，并且瘙痒症状明显减缓，眼眶周围、鼻部有新毛长出。可见，本发明提供的抑菌宠物香波对宠物螨病的临床使用效果良好。
实验例7抑菌宠物香波的体外抑菌效果测试
选取同品种的宠物猫20只，均分为2组，分别为试验组和对照组，每组10只。将两组宠物猫分别置于恒温恒湿的相同环境中饲养24小时。24小时后，在各宠物猫的皮肤表面取样，面积为2cm×2cm，测定菌落总数，记录试验结果，取每组10只的平均值。接着，使用实施例3制备的抑菌宠物香波为试验组进行沐浴，使用市售某宠物香波为对照组，吹干后再置于恒温恒湿环境中饲养12小时。12小时后再次在各宠物猫的相同区域的皮肤表面取样，测定菌落总数，记录试验结果，取每组10只的平均值。实验结果如表5所示。
表5抑菌宠物香波的体外抑菌效果测试结果
注：表格中，有害菌菌落总数指的是经过生理生化鉴定后的有害菌，例如：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌等有害菌的菌落总数，未包括宠物身上枯草芽孢杆菌的菌落数。
上述结果表明，使用后试验组宠物狗与对照组宠物狗的皮肤菌落总数均呈下降趋势，且使用后试验组菌落数明显低于对照组，说明本发明的沐浴露具有较好的除菌效果，可以起到有效防护作用。
本发明所述的枯草芽孢杆菌(CCTCC M 2016442)的应用并不限于以上实施形式，其还可以直接加入到洗手液、香皂、止痒露、沐浴露、洗发露、香波等清洁产品中，为个人清洁护理或者宠物毛发清洁带来便捷、安全和有效的杀菌效果，有效预防细菌交叉感染。
本发明提供的清洁产品并不限于以上洗手液、香皂、沐浴露、香波，其还可以是任何包含本发明所述的枯草芽孢杆菌(CCTCC M 2016442)的清洁产品。
需要说明的是，尽管在本文中已经对上述各实施例进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施例进行的变更和修改，或利用本发明说明书所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围之内。
Claims (10)
1.保藏号为CCTCC M 2016442的枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)的如下任一应用：
(1)保藏号为CCTCC M 2016442的枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)在抑制细菌和/或真菌、去除臭味中的应用；
(2)保藏号为CCTCC M 2016442的枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)在制备抑制细菌和/或真菌、去除臭味的清洁产品中的应用，其中，所述清洁产品为洗手液、香皂、止痒露、沐浴露、洗发露或宠物香波。
2.一种通过向清洁产品加入有效量的保藏号为CCTCC M 2016442的枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)对抗细菌和/或真菌、去除臭味的方法，其特征在于，所述清洁产品为洗手液、香皂、止痒露、沐浴露、洗发露或宠物香波。
3.根据权利要求1所述的应用或者权利要求2所述的方法，其特征在于，所述细菌包括金黄色葡萄球菌和大肠杆菌中的至少一种；
所述真菌为白色念珠菌。
4.根据权利要求1所述的应用或者权利要求2所述的方法，其特征在于，在制备得到的清洁产品中或者在加入所述枯草芽孢杆菌后的清洁产品中，所述枯草芽孢杆菌的含量≥1.0×106CFU/mL。
5.一种宠物香波，其含有保藏号为CCTCC M 2016442的枯草芽孢杆菌(BacillusSubtilis)作为有效成分。
6.根据权利要求5所述的宠物香波，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌的含量≥1.1×106CFU/mL。
7.根据权利要求6所述的宠物香波，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌为活菌。
8.根据权利要求5或6所述的宠物香波，其特征在于，还包括表面活性剂、防腐剂和水；
在所述宠物香波中，各组分的重量百分含量为：
枯草芽孢杆菌，0.1％～1％；
表面活性剂，1％～10％；
防腐剂，0.1％～1％；
余量为水。
9.根据权利要求8所述的宠物香波，其特征在于，所述表面活性剂为椰子油二乙醇酰胺、十二烷基硫酸钠中的一种或多种。
10.根据权利要求8所述的宠物香波，其特征在于，所述防腐剂为乙基己基甘油、苯氧乙醇中的一种或多种。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20210319 |