KR20140055959A - 항균활성 미생물의 발효 성분을 포함하는 항균 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 패니바실러스 크리벤시스(Paenibacillus kribbensis)의 발효배양물을 포함하는 항균 조성물 및 이를 항균 성분으로 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 항균력을 갖는 패니바실러스 크리벤시스의 발효배양물을 함유하는 항균 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 토양으로부터 분리한 패니바실러스 크리벤시스의 발효배양물을 유효성분으로 함유하는 특히 화장품 오염균에 대한 항균 조성물 및 이를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 패니바실러스 크리벤시스 발효배양물은 다양한 균들에 대한 폭넓은 항균활성 스펙트럼을 나타내는바 이를 포함하는 항균 조성물 및 화장료 조성물은 화장품 분야에서 살균, 항균, 방부목적으로 유용하게 이용가능하다.

Description

항균활성 미생물의 발효 성분을 포함하는 항균 조성물 {ANTIBIOTIC COMPOSITION CONTAINING ANTIBIOTIC MICROBIAL FERMENTED EXTRACTS}

본 발명은 패니바실러스 크리벤시스(Paenibacillus kribbensis)의 발효배양물을 포함하는 항균 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 화장료 조성물, 의약외품 조성물, 방부제 조성물, 약학적 조성물 및 패니바실러스 크리벤시스를 발효배양하는 단계를 포함하는 항균 조성물의 제조방법에 관한 것이다.

요즈음 교통의 발달로 전 세계적인 이동이 활발하고 이로 인해 사람의 이동을 따라 여러가지 전염성 질환이나 신규 질환이 급속도로 퍼지고 있다. 그동안 무분별한 항균 물질의 사용으로 여러 미생물들이 내성을 가지게 되어 인류를 위협하고 있다.

농약은 살균제, 살충제, 제초제, 생장 조절제 등으로 크게 나눌 수 있는데 바이러스나 미생물에 의한 작물 피해의 경우 살균제를 사용하여 방재한다. 농업 분야에서 값싸고 강력한 인공 합성된 항균물질들이 과도하게 사용됨으로써 우리 식탁을 위협하게 되었다. 인체에 직접 사용하는 생활용품에도 다양한 항균물질들이 사용되고 있으며 대부분 값이 싼 화학성분들이 사용되고 있다. 불행하게도 이렇게 사용되고 있는 항균물질들 대부분은 장기간 사용시 인체에 해로울 수 있음이 과학적으로 밝혀지고 있다.

우리 생활주변에서 널리 이용되는 식품, 의약품, 생활용품, 화장품 등의 많은 제품에는 내부물성의 변화를 방지하고, 일정기간 동안의 보존을 위해서 인체 사용이 허가된 항균물질인 방부제가 첨가되어 있다. 특히, 화장품은 손으로 떠서 사용하거나 인체와의 접촉이 잦은 제품의 특성상 외부로부터 미생물의 유입이 가능하고 이러한 미생물에 의하여 제품의 품질이 변할 수 있다. 특히, 눈가에 사용하는 제품의 오염은 눈병을 유발할 수 있는 위험성이 있으며, 1920년대 미국에서는 미생물에 의해 오염된 마스카라를 사용한 소비자가 실명한 사례가 있었다. 이에 따라, 미생물에 의한 상기 제품들의 오염을 방지하여 소비자의 안전을 확보하고 제품의 품질을 보존하는 기술이 꾸준히 개발되어 왔다.

한편, 상기 방부제로서 사용되고 있는 물질로는 천연에서 산출된 물질도 있으나 거의 대부분 화학적으로 합성한 인공물질들이 이용되고 있다. 기존 방부제로서 가장 안전하며 생활용품, 화장품, 의약품에 범용적으로 사용되는 파라벤류의 방부제들조차 피부 알러지(Andrea Counti et al., Contact Dermatitis, 1997, 37;35-36)와 환경호르몬으로서의 가능성(Edwin et al., Toxicology and applied pharmacology, 1998, 153;12-19) 및 내성균 유발이라는 문제점을 가지고 있다.

방부제로 사용되고 있는 천연활성 물질들의 경우 대부분 색취, 안정성 저하, 좁은 항균스펙트럼, 제형상 문제 등으로 인해 상용화되지 못하고 있으며, 편백 추출물인 히노키티올(hinokitiol)과 목련추출물인 마그노놀(magnolol), 자몽추출물인 DF-100등 극히 일부만 상용화되고 있는 실정이다. 따라서, 기존 합성 화학 항균물질을 대체할 수 있는 천연 유래 항균 물질의 필요성이 극대화되고 있다. 특히, 항균제의 가장 큰 단점인 부작용을 줄이고 동시에 폭넓은 항균 스펙트럼, 제형상 안정성 등을 보유한 천연 항균 물질의 개발이 필요하다.

이러한 배경하에, 본 발명자들은 부작용을 줄이고 동시에 폭넓은 항균 스펙트럼, 제형상 안정성 등을 보유한 천연 항균 물질을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 항균 활성 미생물 중 특히 항균활성이 우수하고, 항균 스펙트럼 범위가 넓은 패니바실러스 크리벤시스를 동정하여 이를 이용한 천연 항균제를 개발하게 되었다.

본 발명의 하나의 목적은 패니바실러스 크리벤시스의 발효배양물을 포함하는 항균 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 항균 조성물을 항균 성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 항균 조성물을 항균 성분으로 포함하는 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 항균 조성물을 항균 성분으로 포함하는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 항균 조성물을 포함하는 방부제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 패니바실러스 크리벤시스를 발효배양하여 발효배양물을 제조하는 단계를 포함하는 항균 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 패니바실러스 크리벤시스(Paenibacillus kribbensis)의 발효배양물을 포함하는 항균 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 화장품 분야에 적용할 수 있는 우수한 항균활성, 넓은 항균 스펙트럼을 갖는 천연 항균제를 제공하고자 하였다.

본 발명에서 상기 패니바실러스 크리벤시스(Paenibacillus kribbensis , P. kribbensis)는 바람직하게는 항균성을 갖는 패니바실러스 크리벤시스일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 기탁번호 KCTC 12297BP인 것인 패니바실러스 크리벤시스일 수 있다.

본 발명의 항균 조성물은 바람직하게는 세균, 진균 또는 효모에 대해 항균 활성을 가질 수 있으며, 더욱 바람직하게는 대장균 (Escherichia coli), 녹농균 (Pseudomonas aeruginosa), 칸디다균 (Candida albicans), 흑곰팡이 (Aspergillusniger)에 동시에 항균 활성을 가질 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 항균성이 있는 미생물을 동정해내기 위하여 토양 시료를 멸균된 생리식염수에 넣고 균질화한 후, 고체 영양배지(Plate count agar)에 도말하고 배양하여 각각의 콜로니를 분리하였다. 이후 분리된 콜로니를 배양하고, Disk diffusion assay를 통해 항균성이 확인된 패니바실러스 크리벤시스(기탁번호 KCTC 12297BP)를 동정해내었다(실시예 1 및 도 1). 상기 동정된 패니바실러스 크리벤시스의 발효배양물을 이용하여 항균 조성물을 제조하였다(실시예 2).

상기 항균성이 확인된 패니바실러스 크리벤시스는 대장균 (Escherichia coli), 녹농균 (Pseudomonas aeruginosa), 칸디다균 (Candida albicans), 흑곰팡이 (Aspergillusniger)에 동시에 항균성을 가지며, 16S rRNA유전자 서열의 비교결과 기존 동정된 패니바실러스 크리벤시스와 99%의 상동성을 가졌다(서열번호 1).

본 발명에서 용어, "항균"은 균에 저항하는 능력을 의미하며, 세균이나 곰팡이, 효도 등과 같은 미생물의 작용으로부터 방어하기 위해 이루어지는 모든 기작을 의미한다. 본 발명의 패니바실러스 크리벤시스 발효배양물을 포함하는 조성물은 세균, 진균 및 효모를 포함하는 미생물에 대한 항균활성이 뛰어난 것을 확인하였다.

본 발명에서 용어, "세균"은 박테리아에 속하는 생물로서, 생명체들 중에 가장 많이 번성한 종으로 대부분 병원성 균이며 원핵생물의 특징을 그대로 가지고 있으나, 핵막이나 미토콘드리아, 엽록체와 같은 구조는 가지고 있지 않다. 크기는 0.5 μm 부터 0.5 mm 까지 다양하다. 상기 세균에는 예를 들어, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 슈도모나스 아에루기노사(Paeudomonas aeruginosa)이 포함된다.

본 발명에서 용어, "진균"은 곰팡이, 효모, 버섯을 포함한 72,000종 이상의 균종으로 구성되는 미생물군을 총칭하며, 핵막이 있는 진핵생물에 속하고, 미토콘드리아, 소포체 등의 세포 소기관이 발달해 있으며, 키틴, 글루칸 등으로 구성된 세포벽이 있다. 대부분은 세포성인 균사를 형성하여 신장, 발육하고 유성생식 및 무성생식을 하는 것이 특징이다. 번식체로 포자를 형성하지만 일부 균종은 단세포성 증식을 한다. 주로 부생균으로서 자연계의 유기분해에 관여하지만, 일부는 동식물에 기생 또는 공생한다. 상기 진균에는 예를 들어, 캔디다 알비칸스(Candida albicans) 및 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger)이 포함된다.

본 발명에서 용어, "효모"는 곰팡이, 버섯 무리이지만 균사가 없고, 광합성능이나 운동능도 가지지 않는 단세포 생물을 총칭하며, 가장 간단한 형태의 진핵생물로 인간의 세포 주기와 비슷한 세포주기를 가지는 것으로 알려져 있다. 상기 효모에는 예를 들어, 사카로마이세스 속, 피치아 속, 캔디다 속이 포함된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 패니바실러스 크리벤시스 발효배양물은 대장균 (Escherichia coli), 녹농균 (Pseudomonas aeruginosa), 칸디다균 (Candida albicans), 및 흑곰팡이 (Aspergillusniger)를 대상으로 항균 활성을 가진다.

본 발명에서 용어, "발효"는 균주가 가지고 있는 효소를 이용해 유기물을 분해시키는 과정을 말한다. 발효반응과 부패반응은 비슷한 과정에 의해 진행되지만 분해 결과 인간에게 유용한 물질이 만들어지면 발효라 하고 악취가 나거나 유해한 물질이 만들어지면 부패라고 한다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 본 발명의 조성물에 포함되는 패니바실러스 크리벤시스 미생물의 발효배양물은 YM Broth 배양 배지를 이용할 수 있다. 또한, 배양시 15 내지 40 ℃ 범위에서 발효 배양할 수 있으며, 바람직하게는 20 내지 35 ℃에서 발효 배양할 수 있다.

본 발명의 발효배양물은 물, 유기용매 또는 이의 혼합용매를 사용하여 추출할 수 있다. 이들 성분들을 모두 혼합하여 동시에 추출하거나 개개 성분들을 최적의 조건에서 추출한 후 혼합하여 사용할 수도 있다. 이 추출액은 건조하여 사용하거나 추출 상태 그대로 사용할 수 있다. 유기용매를 사용하는 경우, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올 등의 알코올, 아세톤, 헥산, 클로르포름, 에틸아세테이트, 부틸렌 글리콜, 이들의 혼합물 등을 이용하여 실온에서 또는 가온하여 유기용매로 추출할 수 있다.

배양액에 부유하는 고체 입자를 제거하기 위해 여과, 예를 들어 나일론 등을 이용해 입자를 걸러내거나 냉동여과법 등을 이용해 여과한 후, 그대로 사용하거나 이를 동결건조, 열풍건조, 분무건조 등을 이용해 건조시켜 사용할 수 있다.

본 발명의 항균 조성물에는 패니바실러스 크리벤시스의 발효배양물이 조성물의 총 중량에 대해 0.1 내지 30 중량%, 바람직하게는 0.5 내지 20 중량%, 보다 바람직하게는 0.8 내지 10중량% 포함될 수 있다.

본 발명의 항균 조성물을 유효성분으로 함유하는 항균활성 효과를 갖는 각종 조성물은 예를 들면, 액상, 크림상, 페이스트상, 고체상 등 어떠한 제형으로도 응용될 수 있으며, 그 용도도 다양한 분야에 적용될 수 있다. 예를 들면 전신, 피부, 구강, 모발 등 인체관련 세정제 등 각종 화장료 조성물 등에 적용될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 항균 조성물에는 유효 성분으로서의 패니바실러스 크리벤시스 발효배양물 이외에 추가적으로 당업계에 공지된 항균활성을 가진 물질이 추가적으로 포함될 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명의 항균 조성물을 항균 성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

화장료 조성물은 유효 성분으로서의 패니바실러스 크리벤시스 발효배양물을 포함하는 항균 조성물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예를 들어 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및/또는 담체를 포함할 수 있다.

본 발명의 패니바실러스 크리벤시스의 발효배양물을 포함하는 항균 조성물을 화장료 첨가물로 사용할 경우, 상기 조성물은 그대로 첨가되거나 다른 화장료 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합량은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 크림, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에서, 패니바실러스 크리벤시스의 발효배양물을 포함하는 항균 조성물의 양은 전체 조성물에 대하여 0.001 내지 30 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 30 중량%, 보다 바람직하게는 0.5 내지 30 중량%의 화장료 조성물을 포함할 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명에 따른 항균용 조성물을 포함하는 의약외품 조성물을 제공할 수 있다. 즉, 본 발명의 조성물은 항균활성이 요구되는 의약외품 조성물에 첨가될 수 있다.

본 발명의 조성물을 첨가물로 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 의약외품 또는 의약외품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

바람직하게는, 상기 의약외품 조성물은 소독청결제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제비누, 핸드워시, 가습기 충진제, 마스크, 연고제, 코팅제 또는 필터충진제일 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명에 따른 항균용 조성물을 포함하는 약학적 조성물을 제공할 수 있다. 본 발명의 항균용 조성물을 항균 활성을 갖는 약학적 조성물의 유효성분으로 포함하거나 의약 용도를 갖는 유효 성분의 보조제로써 사용할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 기술분야의 당업자라면 잘 알고 있는 방법에 따라 제조될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 통상의 방법에 따라 정제, 환제, 산제 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다. 상세하게는 제형화할 경우, 통상 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 고형제제는 상기 패니바실러스 크리벤시스 발효배양액을 포함하는 조성물 외에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다.

또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 첨가하여 조제될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제를 포함할 수 있다. 비수성 용제 및 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명에 따른 항균용 조성물을 유효성분으로 포함하는 방부제 조성물을 제공할 수 있다. 본 발명의 항균용 조성물을 유효성분으로 포함하는 방부제 조성물은 기술분야의 당업자라면 잘 알고 있는 방법에 따라 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 방부제 조성물은 방부제 조성물이 함유되는 제품의 종류 및 사용목적에 따라 통상 사용하는 성분의 적당량을 배합하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 초산, 초산나트륨계, 소르빈산계, 안식향산계, 프로피온산계를 추가할 수 있으며, 천연 Linseed Oil 비누, 봉랍 비누, 아카시아 수액 등 천연유화제로 유화를 시켜 수용성과 유성유화제로 제조하여 액상, 분말 등 자유자재로 제조 공급할 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 기탁번호 KCTC 12297BP인 패니바실러스 크리벤시스(Paenibacillus kribbensis)를 배지에 발효배양하여 발효배양물을 제조하는 단계를 포함하는 항균 조성물의 제조방법을 제공할 수 있다. 상기 방법은 바람직하게는 상기 방법에 따른 발효배양물을 농축하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 발효배양은 바람직하게는 패니바실러스 크리벤시스를 접종하고 20~35 ℃, 24~120 시간 동안 발효하는 것일 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 본 발명에 따른 항균용 조성물의 제조를 위해 먼저 토양으로부터 분리한 패니바실러스 크리벤시스(Paenibacillus kribbensis LG H005, KCTC 12297BP)을 YM 고체배지에서 48시간 배양(30℃)한 후, YM 액체배지가 포함된 삼각플라스크에 패니바실러스 크리벤시스 미생물을 접종한 후, 30℃에서 250 rpm으로 48시간 배양하여 발효물을 얻었다. 발효물을 121℃, 15lb psi, 15분의 조건에서 습윤 멸균한 후 발효액과 동량의 부탄올을 넣어 분별을 실시하여, 상부의 부탄올과 하부의 물층으로 분별하였다. 분별된 액체는 감압 evaporator를 이용하여 농축하여 발효배양물을 수득하였다(실시예 2).

뿐만 아니라, 본 발명의 패니바실러스 크리벤시스 발효배양물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.

본 발명의 제조방법으로 제조된 항균용 조성물은 화장료 조성물, 방부제 조성물, 약학적 조성물 및 의약외품 조성물에 항균을 위하여 첨가할 수 있다.

본 발명은 특히 화장품 오염균에 항균력을 갖는 패니바실러스 크리벤시스 (Paenibacillus kribbensis) 미생물을 함유하는 항균 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 토양으로부터 분리한 패니바실러스 크리벤시스 발효배양물을 유효성분으로 함유하는 화장품의 오염 미생물에 대한 항균 조성물 및 이를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다. 이에 따른 패니바실러스 크리벤시스 발효배양물은 다양한 균들에 대한 폭넓은 항균활성 스펙트럼을 나타내는바 이를 포함하는 항균 조성물은 화장품, 의약, 생활용품, 농약 등 다양한 분야에서 살균, 항균, 방부목적으로 유용하게 이용가능하다.

도 1은 본 발명에서 동정해낸 미생물(KCTC12297BP)의 16S rRNA유전자 서열을 비교하여 패니바실러스 크리벤시스 (Paenibacillus kribbensis)로 동정한 계통수 분석 결과를 보여주는 도면이다.

이하, 하기 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. 항균활성 미생물 동정

항균성이 있는 미생물을 동정해내기 위하여 토양 시료를 멸균된 생리식염수에 넣고 균질화한 후, 고체 영양배지(Plate count agar)에 도말하고 배양하여 각각의 콜로니를 분리하였다. 이후 분리된 콜로니를 배양하고, Disk diffusion assay를 통해 항균성이 확인된 미생물을 분리해내었다.

상기 항균성이 확인된 미생물 중에서 대장균 (Escherichia coli), 녹농균 (Pseudomonas aeruginosa), 칸디다균 (Candida albicans), 흑곰팡이 (Aspergillusniger)에 동시에 항균성을 가지며, 16S rRNA유전자 서열을 동정하여(서열번호 1), 비교한 결과 기존 동정된 패니바실러스 크리벤시스와 99%의 상동성을 가지는 신규한 패니바실러스 크리벤시스를 동정해내었다(도 1). 이를 2012년 10월 29일 한국생명공학연구원 생명자원센터에 기탁번호 KCTC12297BP로 기탁하였다.

실시예 2. 패니바실러스 크리벤시스의 발효배양물의 제조

토양으로부터 분리한 패니바실러스 크리벤시스(Paenibacillus kribbensis LG H005, KCTC 12297BP)을 YM 고체배지에서 48시간 배양(30℃)한 후, YM 액체배지가 포함된 삼각플라스크에 패니바실러스 크리벤시스 미생물을 접종한 후, 30℃에서 250 rpm으로 48시간 배양하여 발효물을 얻었다. 발효물을 121℃, 15lb psi, 15분의 조건에서 습윤 멸균한 후 발효액과 동량의 부탄올을 넣어 분별을 실시하여, 상부의 부탄올과 하부의 물층으로 분별하였다. 분별된 액체는 감압 evaporator를 이용하여 농축하여 발효배양물을 제조하였다.

실시예 3. 항균 효능 평가

상기 실시예 2에서 수득한 발효배양물의 항균 효능을 평가하기 위하여, Escherichia coli ATCC 10536, Pseudomonas aeruginosa ATCC 15522, Candida albicans ATCC 10231, Aspergillusniger ATCC 9642에 대한 항균효과를 측정하였다.

여러 개의 원반에 기지농도의 발효배양물을 묻혀 시험 균주가 도포된 고체 한천배지에 올려놓고 배양한 후 원반 주변의 투명대(growth inhibition halo)의 크기를 측정하는 한천 확산법으로 항균활성을 측정하였다. 항균시험 농도를 100ppm(0.01%)으로 한정해서 수행한 결과를 표 1에 나타내었다.

시험 균주에 대한 항균활성 실험.

시험 균주	억제능
Escherichia coli	+++
Pseudomonas aeruginosa	+++
Candida albicans	++
Aspergillusniger	++

+ :투명대크기가 9 mm 미만.

++ : 투명대 크기가 9 내지 13 mm 미만.

+++ :투명대 크기가 13 mm 이상.

상기 표에서 보이듯이, 실시예 2에서 수득한 패니바실러스 크리벤시스 발효배양물은 대장균 (Escherichia coli), 녹농균 (Pseudomonas aeruginosa), 칸디다균 (Candida albicans), 흑곰팡이 (Aspergillusniger)에 동시에 높은 항균성을 가지고 있음을 확인하였다.

실시예 4. 발효배양물의 미생물 최소 억제 농도( MIC ) 결정

상기 실시예 2에서 수득한 발효배양물의 최소저해농도(Minimum Inhibition Concentration: MIC)를 측정하였다. 액상배지에 전 배양한 Escherichia coli , Pseudomonas aeruginosa는 Brain heart infusion broth 5 ml에 37℃, 24시간 배양하고, Candida albicans , Aspergillusniger는 Potato dextrose broth 5 ml에 30℃, 48시간 배양하여 준비하였다. 발효배양물의 MIC를 측정하기 위해서 2배 희석법을 사용하였다.

시험 균주에 대한 최소저해농도 실험.

시험 균주	MIC(ppm)
Escherichia coli	200
Pseudomonas aeruginosa	200
Candida albicans	580
Aspergillusniger	200

상기 표에서 보이듯이, 매우 낮은 농도에서도 모든 시험 균주에 대해서 우수한 항균 활성을 나타냄을 알 수 있었다.

실시예 5. 패니바실러스 크리벤시스 발효배양물을 포함하는 에센스의 제조

제형에 패니바실러스 크리벤시스 발효배양물을 함유한 것과 함유하지 않은 에센스(음성 대조군)를 하기 표 3과 같은 조성으로 제조하였다. 양성 대조군으로는 파라벤을 포함한 에센스를 제조하였다.

제조된 실험 에센스 중량 조성.

원료명	음성 대조군 (발효배양물-)	실험군 (발효배양물+)	양성 대조군 (방부제-파라벤+)
	중량 %(w/w)	중량 %(w/w)	중량 %(w/w)
프로필렌글라이콜	10	10	10
히알루론산나트륨수용액(1%)	5	5	5
글리세린	5	5	5
1,3-부틸렌 글리콜	3	3	3
폴리옥시에틸렌경화피마자유	1	1	1
파라벤	-	-	1
발효배양물	-	1	-
정제수	76	75	75

상기 표 3의 조성을 가진 에센스를 이용하여 하기 실험을 진행하였다.

실시예 6. 패니바실러스 크리벤시스 발효배양물의 미생물 오염 방지 효과

실시예 5의 표 3의 조성비로 제조한 에센스의 미생물 오염 정도를 측정하였다. 구체적으로, 입구가 넓은 화장품 용기에 에센스 제품을 담고 30℃ 배양기에 30일간 보관하면서 매일 오전 9시와 오후 6시에 각 5회씩 손가락으로 제품의 표면을 인위적으로 터치하였다. 한달 후 제품의 변화 상태를 관찰하여 미생물 오염 방지 효과를 평가하였다.

	7일 경과	14일 경과	21일 경과	28일 경과	판정
음성 대조군	-	-	+	+	미생물 오염
실험군	-	-	-	-	오염 없음
양성 대조군	-	-	-	-	오염 없음

- :오염 미생물이 100 CFU/ml 이하

+ : 오염 미생물이 100 CFU/ml 이상 및 제형의 취, 점도 변화

상기 오염미생물의 평가는 제품 1ml을 멸균 생리 식염수 9ml에 희석한 후 희석액 1 ml씩을 Brain heart infusion 고체 배지 및 Potato dextrose 고체 배지에 도말하고, 전자는 37℃, 48시간 배양하고, 후자는 30℃, 72시간 배양한 후 성장한 미생물을 계수하였다.

상기 표 4에서 보이듯이, 패니바실러스 크리벤시스 발효배양물을 함유한 실험군에서는 3주에 이르자 미생물 오염된 음성대조군과 상이하게 한달에 이르도록 미생물에 의한 오염이 예방됨을 확인하였다.

상기 결과들을 종합하면, 본 발명의 신규하게 동정된 패니바실러스 크리벤시스의 발효배양물은 다양한 균들에 대한 폭넓은 항균활성 스펙트럼을 나타내는바 이를 포함하는 항균 조성물은 화장품, 의약, 생활용품, 농약 등 다양한 분야에서 살균, 항균, 방부목적으로 유용하게 이용가능함을 확인하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그 리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범 위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

한국생명공학연구원 KCTC12297BP 20121029

<110> LG HOUSEHOLD & HEALTH CARE LTD. <120> ANTIBIOTIC COMPOSITION CONTAINING ANTIBIOTIC MICROBIAL FERMENTED EXTRACTS <130> PA120974KR <150> KR 10-2012-0120757 <151> 2012-10-29 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 616 <212> DNA <213> Paenibacillus kribbensis LG_H005 16S rRNA <400> 1 gggataacta ccggaaacgg gagctcatac ccgatacatc cttttcctgc atgggagaag 60 gaggaaaggc ggagcaatct gtcacttgtg gatgggcctg cggcgcatta gctagttggt 120 ggggtaaagg cctaccaagg cgacgatgcg tagccgacct gagagggtga tcggccacac 180 tgggactgag acacggccca gactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttccgcaatg 240 ggcgaaagcc tgacggagca acgccgcgtg agtgatgaag gttttcggat cgtaaagctc 300 tgttgccagg gaagaacgcc ttgtagagta actgctctta aagtgacggt acctgagaag 360 aaagccccgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtagggggca agcgttgtcc 420 ggaattattg ggcgtaaagc gcgcgcaggc ggctctttaa gtctggtgtt taatcccgag 480 gctcaacttc gggtcgcact ggaaactggg gagcttgagt gcacaagagg agagtggaat 540 tccacgtgta gcggtgaaat gcgtagagat gtggaggaac accagtggcg aaggcgactc 600 tctgggctgt aactga 616

Claims (10)

1. 패니바실러스 크리벤시스(Paenibacillus kribbensis)의 발효배양물을 포함하는 항균 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 세균, 진균 또는 효모에 대해 항균 활성을 갖는 항균 조성물.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 발효배양물이 조성물의 총 중량에 대해 0.1 내지 30 중량%의 양으로 포함되는 항균 조성물.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 패니바실러스 크리벤시스는 기탁번호 KCTC 12297BP인 것인 항균 조성물.
   
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 항균 조성물을 항균 성분으로 포함하는 화장료 조성물.
   
6. 제5항에 있어서, 상기 항균 조성물이 전체 조성물의 중량에서 0.1 내지 30 중량%로 함유된 화장료 조성물.
   
7. 제5항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 유연 화장수, 영양 화장수, 크림, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 및 파우더로 이루어진 군에서 선택된 제형인 화장료 조성물.
   
8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 항균 조성물을 항균 성분으로 포함하는 의약외품 조성물.
   
9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 항균 조성물을 항균 성분으로 포함하는 약학적 조성물.
   
10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 항균 조성물을 포함하는 방부제 조성물.

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