CN111012700B

CN111012700B - 凉薯发酵物及其用于制备提升基因表现量、以及降低皮肤黑色素含量的组合物的用途

Info

Publication number: CN111012700B
Application number: CN201811449321.4A
Authority: CN
Inventors: 林咏翔
Original assignee: TCI Co Ltd
Current assignee: TCI Co Ltd
Priority date: 2018-10-09
Filing date: 2018-11-28
Publication date: 2023-02-17
Anticipated expiration: 2038-11-28
Also published as: TW202014176A; TWI702055B; CN111012700A

Abstract

本发明是关于生物发酵物，尤其是凉薯发酵物及其用于制备提升基因表现量、以及降低皮肤黑色素含量的组合物的用途。本发明提供的该凉薯发酵物，是将凉薯水萃取物以酿酒酵母菌、植物乳杆菌及醋酸杆菌进行三段式发酵所制得。该凉薯发酵物用于制备提升COL基因、TIMP基因、LOX基因、ELN基因、HAS基因、SOD基因、TCP1基因与UNG基因、以及降低皮肤黑色素含量的组合物，能有效增加皮肤抗老化活性、增加皮肤紧致度、及增加皮肤美白能力的医药组合物，并达到综合地皮肤保健功效。

Description

凉薯发酵物及其用于制备提升基因表现量、以及降低皮肤黑色素含量的组合物的用途

技术领域

本发明是关于生物发酵物，尤其是凉薯发酵物及其用于制备提升基因表现量以及降低皮肤黑色素含量的组合物的用途。

背景技术

表皮层为皮肤的最外层，由外往内依序为角质层、颗粒层、有棘层及基底层，表皮层主要由基底层中未分化的圆柱型角质细胞持续向上进行分化形成，此过程称为角质化。角质细胞内含水量高，随着细胞向上代谢分化，角质细胞形状会逐渐变成扁平状，且细胞核及胞器开始退化萎缩，并在角质层形成不具细胞核与胞器的死细胞。表皮层的主要功能为使皮肤保水，并形成皮肤屏障以抵御各种外来伤害，其中表皮层最外层由一弱酸性的皮脂膜以及如砖墙结构的角质层所构成，此屏障能锁住皮肤的水分和油脂、抵抗皮肤表面病菌入侵，及对抗外界异物及紫外光等伤害，对人体有非常重要的保护作用。

然而，随着年纪渐长皮肤会逐渐地老化(Ageing)，皮肤老化形成原因与过程非常复杂牵涉了无数的生理现象，其中紫外线伤害、自由基伤害、胶原蛋白减少、细胞更新减缓、异常细胞的出现、皮肤脂肪减少、细胞间质缺乏、细胞生长休止、荷尔蒙下降等是较常见的因素。但截至目前为止，市售的皮肤抗老化产品大多只能着手在增加抗氧化活性，并无法直接且有效地改善或推迟皮肤老化的发生。

另外近年来，为达到人们努力追求皮肤白皙及斑点渐少的需求，市面上不断开发出各种抑制黑色素形成或淡化斑点的美白产品，然而，该些产品为要求达到特殊效果，而加入过多致癌的化学物质或环境荷尔蒙，使消费者在不知情的状况下使用会伤害皮肤影响健康的成分。

因此，综合上面所述，因应讲求天然健康的现代，开发一种能直接且有效地改善或推迟皮肤老化发生，又能同时兼顾皮肤美白要求的综合皮肤保健组合物，着实有其必要性。

发明内容

缘此，本发明的一目的在提供一种凉薯发酵物，其是凉薯的水萃取物经由酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、及醋酸杆菌(Acetobacter aceti)依序进行发酵而获得。

本发明的又一目的在提供一种如前所述的凉薯发酵物用于制备一提升胶原蛋白(Collagens,COL)基因、基质金属蛋白酶(Tissue inhibitor of metallopeptidases,TIMP)基因、离胺酸氧化酶(Lysyl oxidase,LOX)基因、弹性蛋白(elastin,ELN)基因、及玻尿酸合成酶(Hyaluronan synthase, HAS)基因的表现量的组合物的用途。

本发明的又一目的在提供一种如前所述的凉薯发酵物用于制备一提升超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)基因、TCP1的折迭蛋白 (Chaperonin containingTCP1,CCT)基因、及尿嘧啶DNA糖基化酶(Uracil DNA glycosylase,UNG)基因的表现量的组合物的用途。

本发明的另一目的在提供一种如前所述的凉薯发酵物用于制备降低皮肤黑色素含量的组合物的用途。

在本发明的一实施例中，其中该酿酒酵母菌的添加量为0.01-0.5％(v/v)、该植物乳杆菌的添加量0.01-0.25％(v/v)、及该醋酸杆菌的添加量为3-10％ (v/v)；且该酿酒酵母菌的发酵时间为1至2.5天、该植物乳杆菌的发酵时间为1至3天、及该醋酸杆菌的发酵时间为3至10天。

在本发明的又一实施例中，其中该胶原蛋白基因是为胶原蛋白23型A1(Collagen,type XXIII,alpha 1；COL23A1)基因、胶原蛋白25型A1(Collagen, type XXV,alpha 1；COL25A1)基因、胶原蛋白6型A2(Collagen,type VI, alpha 2；COL6A2)基因、及胶原蛋白4型A4(Collagen,type IV,alpha 4； COL4A4)基因；该基质金属蛋白酶基因为基质金属蛋白酶1(Tissue inhibitor of metallopeptidases 1,TIMP1)基因、及基质金属蛋白酶3(Tissue inhibitor of metallopeptidases 3,TIMP3)基因；该玻尿酸合成酶基因为玻尿酸合成酶2(Hyaluronan synthase 2,HAS2)基因及玻尿酸合成酶3 (Hyaluronansynthase 3,HAS3)基因。

在本发明的又一实施例中，其中该凉薯发酵物是提升弹性蛋白的生成。

在本发明的又一实施例中，其中该凉薯发酵物是提升皮肤紧致度及玻尿酸的生成。

在本发明的又一实施例中，其中该超氧化物歧化酶基因是为超氧化物歧化酶2(Superoxide dismutase 2,SOD2)基因、及超氧化物歧化酶3(Superoxide dismutase 3,SOD3)基因；该TCP1的折迭蛋白基因是为TCP1的折迭蛋白2 (Chaperonin containing TCP12,CCT2)基因、TCP1的折迭蛋白4(Chaperonin containing TCP1 4,CCT4)基因、TCP1的折迭蛋白5(Chaperonin containing TCP1 5,CCT5)基因、及TCP1的折迭蛋白7(Chaperonincontaining TCP1 7, CCT 7)基因。

在本发明的又一实施例中，其中该凉薯发酵物是促进DNA修复能力。

本发明将凉薯以酿酒酵母菌、植物乳杆菌及醋酸杆菌进行三段式发酵所得的凉薯发酵物，能有效提升其中的总多酚含量、提升皮肤细胞抗紫外光能力、且也能有效提升皮肤细胞中COL4A4基因、TIMP1基因、LOX基因、HAS2基因、 HAS3基因、CCT2基因、CCT5基因、CCT7基因、及SOD3基因的表现量，且较凉薯水萃取物有更佳的效果，因此能更加有效的用于制备增加皮肤抗氧化活性、增加皮肤抗老化活性、增加皮肤紧致度、及增加皮肤美白能力的医药组合物，并达到综合地皮肤保健功效。

以下将配合图式进一步说明本发明的实施方式，下述所列举的实施例是用以阐明本发明，并非用以限定本发明的范围，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可做些许更动与润饰，因此本发明的保护范围当视后附的申请专利范围所界定者为准。

附图说明

图1是为本发明的凉薯发酵物提升总多酚含量的直方图；

图2是为本发明的凉薯发酵物降低黑色素生成量的直方图；

图3是为本发明的凉薯发酵物于DNA微数组分析中提升COL基因、TIMP 基因、ELN基因、及HAS基因表现量的直方图；

图4是为本发明的凉薯发酵物于DNA微数组分析中提升SOD基因、CCT基因、及UNG基因表现量的直方图；

图5是为本发明的凉薯发酵物提升COL4A4基因表现量的直方图；

图6是为本发明的凉薯发酵物提升TIMP1基因表现量的直方图；

图7是为本发明的凉薯发酵物提升LOX基因表现量的直方图；

图8是为本发明的凉薯发酵物提升HASs基因表现量的直方图；

图9是为本发明的凉薯发酵物提升CCTs基因表现量的直方图；

图10是为本发明的凉薯发酵物提升SOD3基因表现量的直方图。

具体实施方式

本文中所使用数值为近似值，所有实验数据皆表示在20％的范围内，较佳为在10％的范围内，最佳为在5％的范围内。

本发明提供一种凉薯发酵物及其用于制备提升COL基因、TIMP基因、LOX 基因、ELN基因、HAS基因、SOD基因、TCP1基因与UNG基因、以及降低皮肤黑色素含量的组合物的用途，本发明的凉薯发酵物是将凉薯以酿酒酵母菌、植物乳杆菌及醋酸杆菌进行三段式发酵所得，其可用于提升其中的总多酚含量、提升皮肤细胞抗紫外光能力、且也能有效提升皮肤细胞中COL4A4基因、TIMP1 基因、LOX基因、HAS2基因、HAS3基因、CCT2基因、CCT5基因、CCT7基因、及SOD3基因的表现量。

同时，本发明用于制备提升COL基因、TIMP基因、LOX基因、ELN基因、 HAS基因、SOD基因、TCP1基因与UNG基因、以及降低皮肤黑色素含量的组合物，亦可包含一有效量的凉薯发酵物及一医药上可接受的载体，该组合物是以粉末状、颗粒状、液状、胶状或膏状的剂型存在，且其剂型是以食品、饮品、药品、试剂或营养补充剂的形式提供。

以下将详细说明本发明凉薯发酵物的详细制备方法，与该凉薯发酵物的总多酚含量测试、抗UVA能力测试、调控基因的初步测试、调控弹性蛋白基因能力的测试、及调控抗老化基因能力的测试，以证实该凉薯发酵物对于提升COL 基因、TIMP基因、LOX基因、ELN基因、HAS基因、SOD基因、TCP1基因与UNG 基因表现量、以及提升皮肤抗老化能力的效果。

细胞培养

本发明以人类皮肤纤维母细胞(CCD-966sk)进行本发明的凉薯发酵物的细胞实验。该人类皮肤纤维母细胞是购自美国典型培养物保藏中心(美国)，编号CRL-1881。该细胞是培养于含有10％的胎牛血清(Fetal Bovine Serum) 的MEM(Minimum essentialmedium，购自Gibco，美国，12100-046)培养液，其中加入1mM的丙酮酸钠(sodium pyruvate)以及1％的青霉素/链霉素。

实施例1本发明凉薯发酵物的制备方法

凉薯(Pachyrhizus erosus)为豆科(Legumen)豆薯属(Pachyrhizus)多年生藤本状草本植物，又称豆薯、葛薯、番葛，凉薯为豆类因根如薯块而得名，凉薯块根可生食或熟食，直径约20-30公分，富含糖类、蛋白质，并可加工制成沙葛粉，有清凉去热的功效。

在本发明一实施例中，将凉薯彻底清洗，取洗净后的凉薯以1:5-10的重量比例与水混合，在50-100℃下灭菌萃取0.5-1.5小时，以获得凉薯水萃取物，该凉薯水萃取物冷却至室温供后续三段式发酵使用，首先殖入0.01-0.5％酿酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae，购买于生物资源保存与研究中心，中国台湾，编号为BCRC20271)于该凉薯水萃取物内进行发酵1-2.5天后，接着直接加入0.01-0.25％植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum TCI028，专利寄存于生物资源保存与研究中心，中国台湾，编号为BCRC910805)发酵1-3 天，再加入3-10％醋酸杆菌(Acetobacter aceti，购买于生物资源保存与研究中心，中国台湾，编号为BCRC11688)发酵3-10天；其中，植物乳杆菌TCI028 是已于中国台湾专利申请号106145146完成专利寄存，此三种菌的发酵依序为：酿酒酵母菌、植物乳杆菌、醋酸杆菌，且无法前后对调，最后在不移除此三种菌的情况下，使用设定的糖度范围2-10°、pH2-4、无酒精、多酚等规格，如检验符合该规格，则判定发酵完成并得到发酵液，其总多酚含量至少占20％。接着，将该发酵液于45-70℃进行减压浓缩，并以200-400目网筛过滤，再添加1-3％柠檬酸及40-70％异麦芽寡糖调整规格后灭菌，即得到本发明的凉薯发酵物，其中藉由微生物发酵制成，使凉薯的效性物质大量释出。

实施例2本发明的凉薯发酵物的总多酚含量提升

本实施例是为了比较本发明的凉薯发酵物中总多酚含量是否较凉薯水萃取物高，使用Folin-Ciocalteu比色法测定其中总多酚含量，该测定法是利用试剂中的钨钼酸定量总多酚含量，其自身被还原(由Mo⁶⁺变为Mo⁵⁺)后会生成蓝色化合物，而该蓝色化合物的深浅与总多酚含量呈正相关。首先，分别将本发明的凉薯发酵物及凉薯水萃取物以水稀释1倍后取100mL到离心管中，接着加入500μL的Folin-Ciocalteu酚试剂混合并静置3分钟后，加入400μL 的7.5％碳酸钠混匀静置30分钟后，取200μL反应溶液96孔板中，并测量 750nm的吸亮度。其中以没食子酸(Gallic acid)作为标准品以制作标准曲线，将10g的没食子酸溶于水中，并配置标准0、20、40、60、80、及100μL/mL 的没食子酸，并分别取100μL的各浓度的标准溶液至10mL离心管中，并加入500μL的Folin-Ciocalteu酚试剂混合静置3分钟后，加入400μL的 7.5％碳酸钠混匀静置30分钟后，取200μL反应溶液96孔板中，并测量750 nm的吸亮度，以获得标准曲线，再经由标准曲线换算本发明的凉薯发酵物及凉薯水萃取物中总多酚含量。

本发明的凉薯发酵物提升总多酚含量的结果如图1所示。多酚为一种抗氧化剂，先前研究指出多酚可以预防紫外光造成的氧化损伤，能够提高细胞的抗氧化压力、协助去除自由基、并防止DNA损伤。凉薯水萃取物经本发明的三段式发酵作用后，其中总多酚为单纯凉薯水萃取物的13倍之高，此结果显示本发明的凉薯发酵物在经过特定的微生物发酵步骤后，可有效提升其中的总多酚含量，该特定发酵步骤能提升凉薯的抗氧化能力，并可用于制备提高皮肤抗氧化能力的组合物，使皮肤抗老化及抗紫外线伤害能力提升。

实施例3本发明的凉薯发酵物降低人类皮肤纤维母细胞黑色素含量的能力

本实施例是为了比较本发明的凉薯发酵物降低黑色素含量的能力是否较凉薯水萃取物高，因此利用黑色素瘤细胞(B16F10，编号

CRL-6475TM)测试，其中使用含有10％的胎牛血清(Fetal Bovine Serum)、1％青霉素-链霉素 (购自Gibco，美国)、以及90％的DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium，购自Gibco，美国，12100-046)培养液进行细胞培养。首先，于6孔培养盘的每孔中加入3mL培养液，并植入1.5×10⁵个细胞，将细胞于37℃培养24小时后，在不扰动贴附细胞的情况下去除培养液，接着将细胞分成以下四组(各组n＝4)：(1)空白控制组、(2)0.25％曲酸为正控制组、(3)0.25％凉薯水萃取物、及(4)0.25％本发明的凉薯发酵物，并在3mL新鲜培养液中于37℃作用48 小时后，移除培养液并使用1倍磷酸盐缓冲溶液(1x Phosphate buffered saline,1xPBS)清洗细胞两次，再加入200μL胰蛋白酶(Trypsin)反应3分钟，使细胞由培养盘上脱落，加入200μL的培养液终止反应，并将细胞连同培养液收集至15mL离心管，以400g离心5分钟后移除上清液，再以1mL的1xPBS 冲洗细胞二次后，以200μL的1xPBS重新悬浮细胞，再将细胞溶液置于液态氮中急速冷冻10分钟，接着将细胞在室温下静置30分钟以解冻，待完全解冻后，以12,000g离心30分钟并去除上清液，接着加入并混合120μL的1N的NaOH(以 ddH₂O配置)于60℃中干浴1小时后，取100μL待测溶液至96孔培养盘中测量 OD₄₅₀ _nm，其中以下列公式测定黑色素含量：

黑色素含量(％)＝(％)＝(实验组OD值/控制组OD值)×100％

再利用Excel软件进行student t-test以决定变异系数与是否在统计上具有显著差异(*p值<0.05；**p值<0.01；***p值<0.001)。

本发明的凉薯发酵物降低黑色素生成量的结果如图2所示。人类皮肤纤维母细胞经本发明的凉薯发酵物处理后，降低了14％的细胞黑色素含量，与曲酸的正控制组数值相近，而未经发酵的凉薯水萃取物仅降低约8％的细胞黑色素含量，此结果显示本发明的凉薯发酵物在经过特定的微生物发酵步骤后，可有效降低细胞的黑色素含量，该特定发酵步骤能提升凉薯减少细胞黑色素含量的功效，并可用于制备提高皮肤美白的组合物使皮肤净透亮白。

实施例4分析受本发明的凉薯发酵物所调控的基因

为了初步检测本发明的凉薯发酵物会影响细胞中哪些基因的表现，藉由DNA微数组分析(DNA microarray)经本发明的凉薯发酵物处理过后的细胞中表现量上升的基因。首先，收集经2％凉薯发酵物刺激24小时的人类皮肤纤维母细胞后，将细胞以细胞裂解液(RBbuffer，购自Geanaid公司，中国台湾，Cat. No.RBD300)回收细胞后，使用RNA萃取试剂套组(购自Geneaid公司，中国台湾， Cat.No.RBD300)萃取人类皮肤纤维母细胞内的RNA，接着利用

III反转录酶(购自Invitrogene公司，美国，编号18080-044)以1μg的萃取RNA为模板并以T7 Oligo(dT)引物进行反转录反应(42℃,2小时)产生具有 T7启动子(promoter)的相应cDNA产物，接着同时加入1μL的DNA合成酶 (Polymerase)及0.5μL的RNA分解酶(RNase H)将该cDNA产物的原始RNA 模板分解，并以该单股cDNA为模板进行DNA合成反应(16℃,2小时)以形成双股cDNA产物，将该双股cDNA产物进行纯化以移除可能抑制体外转录反应 (in vitro transcription)的RNA、引物、酶和盐类。其中纯化是将50μL 的cDNA产物加入50μL的Nuclease-free water混合均匀，再加入250μL 的cDNA bindingbuffer混合均匀后，放入cDNA spin column中，以10,000 g离心1分钟，接着将离心管下方液体移除，再将cDNA spin column放入离心机内，以离心10,000g离心3分钟，使spincolumn内残余酒精完全去除，再将spin column移到新的1.5mL离心管，加入已于55℃预热的12μL Nuclease-free water，于室温静置5分钟后，以离心10,000g离心2分钟，即得到纯化的双股cDNA。接着使用Amino Allyl MessageAmpTMII aRNA Amplification Kit(购自Ambion，美国，编号AM1753)，将Amino Allyl UTP (aaUTP)以该双股cDNA为模板进行体外转录反应，以合成具有胺基烯丙基修饰的aRNA(amino allyl-modified antisensesRNA)，使待测RNA的量扩增，接着将该aRNA产物使用Amino Allyl MessageAmpTMII aRNAAmplification Kit 进行纯化(购自美国，编号AM1753)，以去除未嵌入产物的NTP、盐类、酶和无机磷酸盐，以改善aRNA的稳定性，再透过Labeling Reagent and Hybridization Kit(购自Phalanx Biotech Group，美国，编号HOA v7)将 Cy5 NHS ester染料(购自AATBioquest，美国，编号Cat.151)与aRNA上具有胺基烯丙基修饰的UTP残基进行染料偶联反应(Dye coupling reaction)，接着将剩余的染料去除后，将缓冲溶液置换成不含核酸分解酶的水 (Nuclease-free Water，购自Ambion，美国，编号AM1753)，并建立Whole GenomeExperssion微数组杂交系统(购自Phalanx Biotech Group，美国，编号HOA v7)，以AgilentMicroarray Scanner进行扫描和信号分割，于标准化原始数据后，通过使用log2的比率方法测定不同基因的相对表现量。再利用Excel 软件进行非成对单尾student t-test，以决定变异系数与是否在统计上具有显著差异(*p值<0.05；**p值<0.01；***p值<0.001)。

本发明的凉薯发酵物于DNA微数组分析的结果如图3及图4所示。图3 中可看出经本发明的凉薯发酵物处理过后，皮肤纤维母细胞中COL23A1基因、 COL25A1基因、COL6A2基因、TIMP3基因、ELN基因、及HAS2基因表现量显著上升2^0.56-2^1.37倍不等，其中COL23A1、COL25A1、及COL6A2为胶原蛋白的结构蛋白；TIMP3已知可抑制与癌症转移相关的MMP(Matrix metalloproteinases) 酵素活性；ELN为弹性蛋白(Elastin)；HAS则可表现玻尿酸合成酶，能促进角质细胞分泌玻尿酸的能力。

图4中则可看出经本发明的凉薯发酵物处理过后，皮肤纤维母细胞中SOD2 基因、CCT2基因、CCT4基因、及UNG基因表现量也显著上升2^0.37-2^1.46倍不等，其中SOD是一种能够催化超氧化物通过歧化反应，并使其转化为氧气和过氧化氢的酵素，是生物体内一种重要的抗氧化剂，保护暴露于氧气中的细胞；CCT 基因为折迭蛋白(Chaperonin)的一种，主要功能为矫正错误折迭的蛋白质，其被认为与个体的老化调节相关；UNG则为DNA修复机制中一重要蛋白质，亦被认为与老化调节相关。

此些结果可初步地观察出本发明的凉薯发酵物可能与胶原蛋白、弹性蛋白及玻尿酸生成有关，也可能与抗氧化、抗老及DNA修复的作用有关，为了更详尽了解本发明的凉薯发酵物，对细胞的影响，将于后续实施例中更进一步的探讨本发明的凉薯发酵物于各种调节弹性蛋白相关基因及各种抗老化相关基因表现的功效。

实施例5本发明的凉薯发酵物提升弹性蛋白基因表现的效果

以人类皮肤纤维母细胞进行本发明的凉薯发酵物对弹性蛋白基因表现的测试。将1.5x10⁵个人类皮肤纤维母细胞培养于含有2mL上述培养液的六孔培养盘中，并分成以下三组：(1)加入2％(v/v)前述的凉薯水萃取物的对照组、 (2)加入2％(v/v)本发明的凉薯发酵物的实验组，以及(3)仅含培养液的空白控制组于37℃下培养6小时，接着将纤维母细胞以细胞裂解液(RB buffer，购自 Geanaid公司，中国台湾，编号RBD300)回收细胞后，使用RNA萃取试剂套组(购自 Geneaid公司，中国台湾，Lot No.FC24015-G)分别收集三组纤维母细胞内的RNA，接着利用

III反转录酶(购自Invitrogene公司，美国，编号18080-051)以2000ng的萃取RNA为模板并以引物产生mRNA反转录的相应cDNA 产物，接着利用ABI StepOnePlus^TM Real-Time PCR system(Thermo Fisher Scientific公司，美国)，以及KAPA SYBR FAST(购自Sigma公司，美国，编号38220000000)将三组反转录后产物分别以表一的组合引物进行定量实时反转录聚合酶连锁反应(quantitative real-time reversetranscription polymerase chain reaction)试验，条件为95℃反应1秒，60℃反应20秒，总共40个循环。用以定量COL1A1基因、COL1A2基因、COL4A1基因、COL4A3基因、COL4A4基因、COL4A5基因、MMP1基因、MMP9基因、MMP2基因、TGM1基因、 TIMP1基因、ELN基因、FBN1基因、LOX基因、HAS2基因、及HAS3基因的mRNA表现量，其中定量数值是取由阈值循环数(Ct)，而目标基因的mRNA相对量是推导自方程式2^-△Ct，其中△Ct＝Ct_目标基因-Ct _GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶， Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)，再利用Excel软件进行非成对单尾student t-test，以决定变异系数与是否在统计上具有显著差异(*p 值<0.05；**p值<0.01；***p值<0.001)。

表一、定量实时反转录聚合酶连锁反应的组合引物

本发明的凉薯发酵物于提升COL4A4基因表现量的结果如图5所示；于提升TIMP1基因表现量的结果如图6所示；提升LOX基因表现量的结果如图7 所示，其中LOX主要功能为使胶原蛋白和弹性蛋白产生交联，以稳定胶原纤维和成熟的弹性蛋白间的完整性和弹性；提升HAS基因表现量的结果如图8所示。其中，单纯以凉薯水萃取物处理的组别皆与空白控制组的数据相近；然而，以本发明的凉薯发酵物处理后，COL4A4基因的表现量为空白控制组的1.78倍， TIMP1基因的表现量为空白控制组的1.37倍，LOX基因的表现量为空白控制组的1.24倍，HAS2基因的表现量为空白控制组的2.24倍，HAS3基因的表现量则为空白控制组的2.74倍。此结果显示本发明的凉薯发酵物在经过特定的微生物发酵步骤后，可有效提升COL4A4基因、TIMP1基因、LOX基因、HAS2基因、及HAS3基因的表现量，使胶原蛋白、弹性蛋白、及玻尿酸的生成提升，并可用于制备提高皮肤紧致度的组合物，使皮肤光滑有弹性。

实施例6本发明的凉薯发酵物提升抗老基因表现的效果

以人类皮肤纤维母细胞进行本发明的凉薯发酵物对抗老基因表现的测试。将1.5x105个人类皮肤纤维母细胞培养于含有2mL上述培养液的六孔培养盘，并分成以下三组：(1)加入2％前述的凉薯水萃取物的对照组、(2)加入2％本发明的凉薯发酵物的实验组，以及(3)仅含培养液的空白控制组于37℃下培养24小时，并以实施例5的方法分析经本发明的凉薯发酵物处理过的皮肤纤维母细胞中CCT2基因、CCT5基因、CCT6A基因、CCT7基因、CCT8基因、Pink1 基因、Parkin基因、Atg1基因、Atg8基因、SIRT1基因、FOXO基因、PARP1 基因、PARP2基因、NADSYN基因、MRPS5基因、Ubl-5基因、及SOD3基因的表现情形。

表二、定量实时反转录聚合酶连锁反应的组合引物

本发明的凉薯发酵物于提升CCT2基因、CCT5基因、及CCT7基因表现量的结果如图9所示；于提升SOD3基因表现量的结果如图10所示。其中，单纯以凉薯水萃取物处理的组别皆与空白控制组的数据相近或较低；然而，以本发明的凉薯发酵物处理后，CCT2基因的表现量为空白控制组的1.1倍，CCT5基因的表现量为空白控制组的1.3倍，CCT7基因的表现量为空白控制组的2.5 倍，SOD3基因的表现量则为空白控制组的1.5倍。此结果显示本发明的凉薯发酵物在经过特定的微生物发酵步骤后，可有效提升CCT2基因、CCT5基因、 CCT7基因、及SOD3基因的表现量，而能有效提升细胞代谢的能力，以及有效提高清除细胞内自由基的效率，并可用于制备提高皮肤抗老化以及抗氧化力能力的组合物，使皮肤回复年轻状态。

综上所述，本发明将凉薯以酿酒酵母菌、植物乳杆菌及醋酸杆菌进行三段式发酵所得的凉薯发酵物，能有效提升其中的总多酚含量、提升皮肤细胞抗紫外光能力、且也能有效提升皮肤细胞中COL4A4基因、TIMP1基因、LOX基因、 HAS2基因、HAS3基因、CCT2基因、CCT5基因、CCT7基因、及SOD3基因的表现量，且较凉薯水萃取物有更佳的效果，因此能更加有效的用于制备增加皮肤抗氧化活性、增加皮肤抗老化活性、增加皮肤紧致度、及增加皮肤美白能力的医药组合物，并达到综合地皮肤保健功效。

Claims

1.一种凉薯发酵物，其是凉薯的水萃取物经由酿酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、及醋酸杆菌(Acetobacter aceti)依序进行发酵而获得，其中所述凉薯的水萃取物是以重量比例为1:5-10的凉薯和水混合，且在50-100℃下灭菌萃取0.5-1.5小时而得；所述酿酒酵母菌的添加量为0.01-0.5％(v/v)，所述植物乳杆菌的添加量0.01-0.25％(v/v)，及所述醋酸杆菌的添加量为3-10％(v/v)；及所述酿酒酵母菌的发酵时间为1至2.5天，所述植物乳杆菌的发酵时间为1至3天，及所述醋酸杆菌的发酵时间为3至10天。

2.一种如权利要求1所述的凉薯发酵物用于制备一提升胶原蛋白(Collagens,COL)基因、基质金属蛋白酶(Tissue inhibitor of metallopeptidases,TIMP)基因、离胺酸氧化酶(Lysyloxidase,LOX)基因、弹性蛋白(elastin,ELN)基因、及玻尿酸合成酶(Hyaluronansynthase,HAS)基因的表现量的组合物的用途，其中所述胶原蛋白基因为胶原蛋白23型A1(Collagen,type XXIII,alpha 1；COL23A1)基因、胶原蛋白25型A1(Collagen,type XXV,alpha 1；COL25A1)基因、胶原蛋白6型A2(Collagen,type VI,alpha 2；COL6A2)基因、及胶原蛋白4型A4(Collagen,type IV,alpha 4；COL4A4)基因；所述基质金属蛋白酶基因为基质金属蛋白酶1(Tissue inhibitor of metallopeptidases 1,TIMP1)基因、及基质金属蛋白酶3(Tissue inhibitor of metallopeptidases 3,TIMP3)基因；所述玻尿酸合成酶基因为玻尿酸合成酶2(Hyaluronan synthase 2,HAS2)基因及玻尿酸合成酶3(Hyaluronansynthase 3,HAS3)基因。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述凉薯发酵物是提升弹性蛋白的生成。

4.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述凉薯发酵物是提升皮肤紧致度及玻尿酸的生成。

5.一种如权利要求1所述的凉薯发酵物用于制备一提升超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase,SOD)基因、TCP1的折迭蛋白(Chaperonin containing TCP1,CCT)基因、及尿嘧啶DNA糖基化酶(UracilDNA glycosylase,UNG)基因的表现量的组合物的用途，其中所述超氧化物歧化酶基因为超氧化物歧化酶2(Superoxide dismutase 2,SOD2)基因、及超氧化物歧化酶3(Superoxide dismutase 3,SOD3)基因；所述TCP1的折迭蛋白基因为TCP1的折迭蛋白2(Chaperonin containing TCP1 2,CCT2)基因、TCP1的折迭蛋白4(Chaperonincontaining TCP1 4,CCT4)基因、TCP1的折迭蛋白5(Chaperonin containing TCP1 5,CCT5)基因、及TCP1的折迭蛋白7(Chaperonin containing TCP1 7,CCT 7)基因。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述凉薯发酵物是促进DNA修复能力。

7.一种如权利要求1所述的凉薯发酵物用于制备降低皮肤黑色素含量的组合物的用途。