JP2008211994A - 新規乳酸菌株、飲食品、発酵飲食品および発酵飲食品の製造方法 - Google Patents
新規乳酸菌株、飲食品、発酵飲食品および発酵飲食品の製造方法 Download PDFInfo
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Abstract
【解決手段】16S rDNAの、5’末端〜490番目に特定の塩基配列があり、911番目〜1410番目に固有の塩基配列を持つラクトバチルス ブレビスに属する乳酸菌株;ラクトバチルス ブレビス FERM AP−21222株;かかる乳酸菌株を用いて発酵を行う工程を有する発酵飲食品の製造方法;かかる乳酸菌株を含有する飲食品;かかる乳酸菌株を用いて発酵を行って得られる発酵飲食品。
【選択図】なし
Description
なかでも、ラクトバチルス ブレビス(Lactobacillus brevis)FERM BP−4693株はインターフェロン産生能向上剤として利用可能な事が知られており(特許文献1参照)、極めて有用な乳酸菌である。また、生きた状態で摂取すれば、容易に腸に到達して長く生存できるため、健康増進を志向した飲食品として、ラクトバチルス ブレビス FERM BP−4693株を生きた状態で含有する発酵飲食品が望まれている。
請求項1に記載の発明は、16S rDNAの、5’末端〜490番目の塩基配列が配列番号1で表わされ、911番目〜1410番目の塩基配列が配列番号2で表わされるラクトバチルス ブレビスに属する乳酸菌株である。
請求項2に記載の発明は、ラクトバチルス ブレビス FERM AP−21222株である。
請求項3に記載の発明は、植物性原料の発酵に用いる請求項1または2に記載の乳酸菌株である。
請求項4に記載の発明は、請求項1〜3のいずれか一項に記載の乳酸菌株を用いて発酵を行う工程を有する発酵飲食品の製造方法である。
請求項5に記載の発明は、請求項1〜3のいずれか一項に記載の乳酸菌株を含有する飲食品である。
請求項6に記載の発明は、請求項1〜3のいずれか一項に記載の乳酸菌株を用いて発酵を行って得られる発酵飲食品である。
<ラクトバチルス ブレビス FERM AP−21222株の取得>
ラクトバチルス ブレビス FERM BP−4693株(以下、「FERM BP−4693株」と略記することがある)を、市販のMRS液体培地(OXOID社製)で、30℃、18時間培養した。次に、その培養液を、トマト果汁10mLに1容量%植菌し、30℃で18時間培養し、この培養物を、MRS寒天培地(OXOID社製)を用いて混釈培養した。
ラクトバチルス ブレビス FERM BP−4693株をMRS寒天培地で培養した時に通常観察されるコンペイトウ状の形態とは異なる円盤状のコロニーを、イノキュレーティングニードル(Nunc社製)で穿刺し、付着した菌体をMRS液体培地に接種して、30℃で18時間培養した。
さらに純化するため、この培養液を、MRS寒天培地を用いて混釈培養し、30℃で2日間培養後に形成した円盤状のコロニーを同様に分離、培養し、これを4回繰り返した。
その結果、MRS寒天培地で混釈培養した時のプレート中でのコロニー形態が、ラクトバチルス ブレビスFERM BP−4693株とは明らかに異なる変異株として、ラクトバチルス ブレビス FERM AP−21222株(以下、「本菌株」と略記することがある)を得た。この時のコロニーの撮影画像を図1に示す。図1(a)は、ラクトバチルス ブレビス FERM AP−21222株の撮影画像、図1(b)は、ラクトバチルス ブレビスFERM BP−4693株の撮影画像である。
なお、ここで培養に用いたラクトバチルス ブレビス FERM BP−4693株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターより分譲可能である。
(形態的性質)
ラクトバチルス ブレビス FERM AP−21222株の形態的性質は、前記各培地で培養した時のコロニーを顕微鏡観察することにより確認した。その結果、細胞形態は桿菌であり、ラクトバチルス ブレビスFERM BP−4693株およびラクトバチルス ブレビス(Lactobacillus brevis)JCM1059T株(以下、「基準株」と略記することがある)同様、胞子を有さず、運動性も有していなかった。
前記MRS寒天培地で培養した時のコロニー形態は、円形、半球形、スムース、白色であった。
また、BL寒天培地(栄研化学株式会社製)で培養した時のコロニー形態は、円形、半レンズ状、スムース、白色であった。
なお、ラクトバチルス ブレビスFERM BP−4693株も、これら培地で培養した場合は、いずれも本菌株と同様の性質を示し、前記混釈培養の場合とは、異なるコロニー形態であった。
ラクトバチルス ブレビス FERM AP−21222株の生理学的性質を公知の方法により評価し、ラクトバチルス ブレビスFERM BP−4693株およびラクトバチルス ブレビス JCM1059T株と比較した。結果を表1に示す。
表1に示すように、本菌株は、FERM BP−4693株および基準株と同じ生理学的性質を示した。
ラクトバチルス ブレビス FERM AP−21222株の各種炭水化物の分解性を、細菌検査同定用キットApi 50 CH(bio Merieux社製)を使用して評価し、ラクトバチルス ブレビス FERM BP−4693株およびラクトバチルス ブレビス JCM1059T株と比較した。その結果を表2および3に示す。
表2および3から明らかなように、本菌株と基準株とは、リボース、β−メチル−D−キシロース、ガラクトース、D−フラクトース、α−メチル−D−グルコシドの資化性に相違が認められた(表中、「*」で示した)。一方、本菌株とFERM BP−4693株との間に資化性の相違は認められなかった。
ラクトバチルス ブレビス FERM AP−21222株の16S rDNAの塩基配列(部分配列)を公知の方法で決定した。決定した塩基配列のうち、5’末端(1番目)から490番目までの塩基配列を配列番号1に示し、911番目から1410番目までの塩基配列を配列番号2に示す。この決定した塩基配列について、大学共同利用機関法人 情報・システム研究機構 国立遺伝学研究所 生命情報・DDBJ研究センターが運営している日本DNAデータバンクの相同性検索(BLAST)を行った。
その結果、本菌株の配列番号1に示す塩基配列は、FERM BP−4693株と同じであり、81番目の塩基が基準株とは異なっていた。また本菌株の配列番号2に示す塩基配列は、376番目の塩基が基準株とは異なっており、470、491、492、496、498〜500番目の塩基が、FERM BP−4693株および基準株と異なっていた(FERM BP−4693株と基準株とでは同じであった)。そして、本菌株とFERM BP−4693株、本菌株と基準株とは、いずれも99%以上の相同性を示したが、異なる菌である事が示唆された。
以上の結果より、本菌株は、ラクトバチルス ブレビスに属する新規の乳酸菌株であることが示された。
本発明の乳酸菌株は、16S rDNAの、5’末端(1番目)〜490番目の塩基配列が配列番号1で表わされ、911番目〜1410番目の塩基配列が配列番号2で表わされるラクトバチルス ブレビスに属するものである。
そして、該乳酸菌株に、ラクトバチルス ブレビス FERM AP−21222株は包含される。
野菜としては、例えば、トマト、赤ピーマン、ニンジン、キャベツ、はくさい、レタス、大根、ほうれん草、ケール、玉葱、なす、プチヴェール(登録商標)(ケールと芽キャベツの交雑種)、しいたけ、シメジ等が挙げられる。
果実としては、例えば、グレープフルーツ、オレンジ、リンゴ、ブドウ、イチゴ、パイナップル、キウイ、グアバ、マンゴー、アセロラ、ブルーベリー、ザクロ、モモ、洋なし、パパイヤ、メロン、スイカ、バナナ、イチジク等が挙げられる。
穀類としては、例えば、麦(麦芽)、米等を、豆類としてはダイズ、エンドウ等が挙げられる。
本発明においては、これら植物性原料を単独で用いても良く、二種以上を併用しても良い。目的に応じて、適宜最適な組み合わせを選択できる。
本発明の飲食品は、上記本発明の乳酸菌株を含有するものである。具体的には、例えば、別途調製した飲食品に本発明の乳酸菌株を添加したものでも良いし、本発明の乳酸菌株を用いて原料を発酵させて得られた発酵飲食品でも良い。
別途調製した飲食品に本発明の乳酸菌株を添加する場合の添加量は、特に限定されない。
本発明の乳酸菌株を用いて原料を発酵させる場合は、発酵物をそのまま発酵飲食品としても良いし、適宜後処理や加工を行って発酵飲食品としても良い。発酵条件は先に述べた条件と同様である。
また、発酵時の原料は、目的に応じて適宜加工した状態のものを用いることができる。例えば、植物性原料は、搾汁液、磨砕物または破砕物、あるいはこれらを濃縮物、希釈物または乾燥物等に加工した形態で用いることができる。具体的には、ダイズであれば、豆乳の形態で用いることもできる。本発明においては、発酵原料として液状のものが特に好適である。
[実施例1]
ラクトバチルス ブレビス FERM AP−21222株の凍結保存菌液を、MRS液体培地に1容量%接種し、30℃で18時間培養して賦活した後、同様の条件で継代したものを前培養液とした。得られた前培養液をMRS液体培地10mLに1容量%接種し、30℃で培養して、下記の方法により経時的に生菌数、並びに培養液の濁度、pHおよび酸度を測定した。結果を図2〜5に示す。図2は生菌数、図3は培養液の濁度、図4は培養液のpH、図5は培養液の酸度の経時変化をそれぞれ示すグラフである。
(測定方法)
生菌数;段階希釈した培養液1mLを分注したシャーレに、MRS寒天培地約20mLを加えて混釈プレートを作成し、30℃で2日間培養した後、形成したコロニーをカウントして算出した。
培養液の濁度;分光光度計U−3310(株式会社日立ハイテクノロジーズ製)を用いて、測定波長660nmで測定した。
培養液のpH;pHメーターF−52(株式会社堀場製作所製)を用いて測定した。
培養液の酸度;滴定法により算出した。すなわち、試料を約5g量り採り、フェノールフタレイン溶液を約500μL加えて、0.1N水酸化ナトリウム水溶液を滴下し、微赤色が呈する点を終点とした。そのときの滴定量から下記式を用いて酸度を算出した。
(算出式)
酸度(%)=(水酸化ナトリウム水溶液の規定数)×(水酸化ナトリウム水溶液の滴定量(L))×(乳酸1g当量)÷(試料採取量)×100
ラクトバチルス ブレビス FERM AP−21222株の凍結保存菌液に代わり、ラクトバチルス ブレビス FERM BP−4693株の凍結保存菌液を用いたこと以外は、実施例1と同様に測定を行った。結果を図2〜5に示す。
一方、長時間培養すると、本菌株の方がやや培養液の酸度が高く、それに伴い培養液のpHの低下がやや大きい傾向が認められた。
[実施例2]
Brix.60%の透明ニンジン濃縮果汁を蒸留水で希釈して、Brix.12%に調整し、300mLの三角フラスコに100mL入れて、115℃、15分間の条件でオートクレーブ滅菌したものを発酵培地とした。
ラクトバチルス ブレビス FERM AP−21222株の凍結保存菌液を、MRS液体培地に1容量%接種し、30℃で18時間培養して賦活した後、同様の条件で継代したものを前培養液とした。
次いで、調製した発酵培地に、5容量%の前培養液を接種し、32℃で18時間静置培養し、下記の方法により培養前後における生菌数、並びに培養液の酸度およびpHを測定し、培養後の培養液の凝集性の有無を確認した。結果を表4に示す。
(測定および確認方法)
生菌数;段階希釈した培養液1mLを分注したシャーレに、MRS寒天培地約20mLを加えて混釈プレートを作成し、30℃で2日間培養した後、形成したコロニーをカウントして算出した。
培養液の酸度およびpH;実施例1と同様の方法で測定した。
培養液の凝集性;培養液を試験管に移し、試験管ミキサーで軽く攪拌後、目視することにより凝集性の有無を確認した。
ラクトバチルス ブレビス FERM AP−21222株の凍結保存菌液に代わり、ラクトバチルス ブレビス FERM BP−4693株の凍結保存菌液を用いたこと以外は、実施例2と同様に測定および確認を行った。結果を表4に示す。
[実施例3]
ラクトバチルス ブレビス FERM AP−21222株の凍結保存菌液を、MRS液体培地に1容量%接種し、30℃で18時間培養して賦活した後、さらに同条件で2回継代培養したものを培養液とした。
次いで、13000×g、5分間の条件の遠心分離により、該培養液から菌体を除去し、さらに乳酸などの有機酸の影響を除去するために、得られた培養液上清をpH6.0に調整した。これを滅菌フィルターMILLEXGV Filter Unit 0.22μm(ミリポア社製)でろ過滅菌したものを被評価培養液とした。
また、抗菌活性を評価する際の対象菌として、食品危害微生物であるバチルス セレウス(Bacillus cereus)JCA1501株、バチルス セレウス IFO13690株、バチルス ズブチリス(Bacillus subtilis)JCA527株、バチルス ズブチリス IFO13719株、バチルス コアギュランス(Bacillus coagulans)JCM2257T株、リステリア モノサイトジェネス(Listeria monocytogenes)ATCC7644株、スタフィロコッカス アウレウス(Staphylococcus aureus)RCSA1株を使用した。これら対象菌は、その凍結保存菌液をSCD培地(日水製薬株式会社製)に1容量%接種し、30℃で18時間、好気培養した。さらに同条件で2回継代培養を行って供試菌体とした。
(至適温度)
バチルス セレウス JCA1501株、バチルス セレウス IFO13690株、バチルス ズブチリス JCA527株、バチルス ズブチリス IFO13719株;30℃
バチルス コアギュランス JCM2257T株、リステリア モノサイトジェネス ATCC7644株、スタフィロコッカス アウレウス RCSA1株;35℃
(算出式)
抗菌活性(AU/ml)=(最大希釈率(AU))÷0.01
ラクトバチルス ブレビス FERM AP−21222株の凍結保存菌液に代わり、ラクトバチルス ブレビス FERM BP−4693株の凍結保存菌液を用いたこと以外は、実施例3と同様に評価を行った。結果を表5に示す。
ラクトバチルス ブレビス FERM AP−21222株の凍結保存菌液に代わり、ラクトバチルス ブレビス 基準株の凍結保存菌液を用いたこと以外は、実施例3と同様に評価を行った。結果を表5に示す。
Claims (6)
- 16S rDNAの、5’末端〜490番目の塩基配列が配列番号1で表わされ、911番目〜1410番目の塩基配列が配列番号2で表わされるラクトバチルス ブレビス(Lactobacillus brevis)に属する乳酸菌株。
- ラクトバチルス ブレビス(Lactobacillus brevis)FERM AP−21222株。
- 植物性原料の発酵に用いる請求項1または2に記載の乳酸菌株。
- 請求項1〜3のいずれか一項に記載の乳酸菌株を用いて発酵を行う工程を有する発酵飲食品の製造方法。
- 請求項1〜3のいずれか一項に記載の乳酸菌株を含有する飲食品。
- 請求項1〜3のいずれか一項に記載の乳酸菌株を用いて発酵を行って得られる発酵飲食品。
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