KR102318012B1 - 내염성 및 항균성이 우수한 유산균 및 이의 응용 - Google Patents

내염성 및 항균성이 우수한 유산균 및 이의 응용 Download PDF

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Abstract

본 발명은 락토바실러스 사케이 NSML-52(Lactobacillus casei NSML-52, KFCC11853P) 균주 및 이의 산업적 응용에 관한 것이다. 상기 균주는 내염성 및 항균성이 우수하기 때문에, 상기 균주를 이용하여 다양한 발효 식품에 활용될 수 있고, 식품 첨가제로 활용될 수 있다.

Description

내염성 및 항균성이 우수한 유산균 및 이의 응용{LACTIC ACID BACTERIUM HAVING EXCELLENT HALOTOERANCE AND ANTIBACTERIAL PROPERTY AND APPLICATION THEREOF}
본 발명은 미생물 균주에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 장류에서 유래하여 내염성 및 항균성이 우수한 유산균 균주 및 상기 유산균 균주의 산업적 응용에 관한 것이다.
소금이라고 불리는 염화나트륨은 섭취 시에 인체의 전해질 성분인 나트륨을 보충하여, 세포 내외의 체액 평형 유지, 수분 균형 유지, 영양소 이동 등 생명을 유지하기 위한 필수적인 물질이다. 하지만 과다한 나트륨 섭취는 고혈압, 심혈관계질환, 신장질환, 위암의 발생위험을 증가시키며, 간접적으로 비만, 신장 결성 및 골다공증의 위험을 증가시키는 요인으로 작용한다.
특히, 우리나라의 전통 식품인 김치, 장류, 젓갈 등은 염도가 매우 높기 때문에, 우리나라 사람들은 고-염도의 식품을 상대적으로 많이 섭취한다. 뿐만 아니라, 국, 탕, 찌개 등을 선호하는 음식문화로 인해 우리나라 사람들의 나트륨 섭취량은 다른 나라 사람들에 비하여 높은 것으로 알려져 있다.
실제로 2012년 국민건강영양조사 결과에 따르면, 우리나라 국민의 일일 나트륨 평균 섭취량은 4,546 mg (남자 5,212 mg, 여자 3,868 mg)으로 세계보건기국(World Health Organization, WHO)의 일일 나트륨 권고 상한 값인 2,000 mg의 2배 이상을 섭취하고 있는 것으로 조사되었다. 따라서 우리나라 사람들은 나트륨 과다섭취에 의한 문제가 발생할 위험이 높은 것으로 평가되고 있다. 이에 따라, 정부나 지방자치단체에서는 국민 건강을 고려하여 정책적으로 국민들의 나트륨 섭취를 줄이기 위하여 다양한 노력을 기울이고 있으며, 학계 및 사업체에서도 다각적으로 나트륨을 저감하기 위한 다양한 방안이 연구되고 있다.
2016년 보건복지부에서 발효한 국민건강통계를 보면 우리나라 국민들의 나트륨 급원 식품 중 소금 25%, 장류 19%, 김치류 13%로 조사되어, 소금을 제외하고 가장 높은 포지션을 차지하고 있는 장류, 특히 된장에 대한 나트륨 저감화가 필요하다.
단순하게 된장에 들어가는 소금의 함량을 줄여 이른바 저염 된장을 제조할 수 있지만, 장류에 들어가는 소금의 함량을 줄이면 장류의 맛이 없어질 뿐만 아니라, 낮은 염도로 인하여 발효균 이외의 다른 유해 세균이 장류에 번식하게 된다. 이에 따라 제조된 장류에서 이미 및 이취가 생성되고, 과량으로 섭취되었을 경우 식중독 유사 증상, 고혈압 유발, 발암 물질의 전구체로 전환될 수 있는 바이오제닉 아민(biogenic amines)과 같은 독성 물질이 생성될 수 있기 때문에, 발효 식품을 제조할 때 염 농도를 줄이는 데는 한계가 있다. 이러한 문제로 인해 2000년대 들어 활발하게 개발되고 생산되던 저염 된장은 현재 시중에서 찾아보기가 어렵게 되었다.
대한민국등록특허 제10-1703989
본 발명의 목적은 내염성 및 항균성이 우수한 유산균 균주, 상기 유산균 균주를 포함하는 조성물, 식품 첨가제, 상기 유산균 균주를 발효시켜 제조되는 식품 및 그 제조 방법을 제공하고자 하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 풍미가 개선된 발효 식품과 발효 식품을 제조하는 방법을 제공하고자 하는 것이다.
일 측면에 따르면, 본 발명은 락토바실러스 사케이 NSML-52(Lactobacillus sakei NSML-52, KFCC11853P) 균주를 제공한다.
상기 균주는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 및 대장균 (Escherichia coli) 중에서 적어도 하나의 세균에 대한 항균 활성을 가질 수 있다.
다른 측면에 따르면, 본 발명은 락토바실러스 사케이 NSML-52(Lactobacillus sakei NSML-52, KFCC11853P) 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 함유하는 항균 활성을 가지는 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 락토바실러스 사케이 NSML-52(Lactobacillus sakei NSML-52, KFCC11853P) 균주 또는 이의 배양물을 첨가하여 제조된 발효 식품을 제공한다.
예를 들어, 상기 발효 식품은 된장과 같은 장류일 수 있다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 락토바실러스 사케이 NSML-52(Lactobacillus sakei NSML-52, KFCC11853P) 균주 또는 이의 배양물을 첨가하여 제조된 식품 첨가제를 제공한다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 락토바실러스 사케이 NSML-52(Lactobacillus sakei NSML-52, KFCC11853P) 균주 또는 이의 배양물을 발효 대상 물질에 접종시켜 발효 식품을 제조하는 방법을 제공한다.
일례로, 상기 발효 식품은 장류를 포함할 수 있다.
상기 락토바실러스 사케이 MSML-52 균주 또는 이의 배양물은 상기 발효 대상 물질 대비 1 내지 20 중량%의 비율로 접종될 수 있다.
본 발명에 따른 유산균 균주는 염 농도 10% 이상에서도 배양 가능하여, 내염성이 있다. 따라서 고염 조건인 발효 식품의 제조 조건에서도 본 발명이 유산균 균주는 생존하여 활성을 유지할 수 있다.
또한, 본 발명의 유산균 균주는 식품의 발효 과정에서 식품의 품질에 유해한 작용을 일으키는 바실러스 세레우스 및 대장균(에스케리키아 콜라이)의 증식을 억제한다. 따라서, 이러한 유해균에 의하여 발효 식품의 품질이 저하되지 않는다.
따라서, 본 발명의 유산균 균주는 식품 첨가제로 활용되거나, 또는 본 발명에 따른 유산균 균주를 발효, 숙성시켜 다양한 발효 식품에 활용될 수 있으며, 본 발명의 유산균 균주를 활용하여 발효 식품의 풍미와 맛을 향상시킬 수 있다.
도 1은 본 발명의 예시적인 실시형태에 따라 배양된 유산균 균주를 활용하여 장류인 된장을 제조하는 과정을 개략적으로 나타낸 순서도이다.
도 2는 본 발명에 따른 신규 유산균인 락토바실러스 사케이 NSML-52(Lactobacillus sakei NSML-52, KFCC11853P) 균주의 16s rRNA 염기서열을 바탕으로 분석한 계통분류학적 관계를 나타낸 모식도이다.
도 3은 본 발명의 예시적인 실시예에 따라 8% 염 농도의 조건에서 24 시간 배양한 뒤 각각의 미생물 균주의 생균수를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 다른 예시적인 실시예에 따라 11% 염 농도의 조건에서 24 시간 배양한 뒤 각각의 미생물 균주의 생균수를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
이하, 필요한 경우에 첨부하는 도면을 참조하면서 본 발명을 설명한다.
본 발명자들은 발효 식품을 제조할 때 종균을 사용한다는 점에 착안하여, 저염 식품의 단점을 개선할 수 있도록 Starter로 활용될 수 있는 우수한 종균을 개발하여 본 발명을 완성하였다. 미생물 균주 중에서도 유산균은 생육하면서, 발효 식품의 pH를 낮을 수 있고, 항균 물질을 생산하여 부패 미생물을 줄일 수 있고, 대사 과정을 통하여 발효 식품의 풍미를 높일 수 있는 주요 발효균으로 식품 안전성이 검증되었다는 점을 토대로 신규 유산균을 분리, 동정하였다.
대료적인 발효 식품인 된장은 다양한 미생물이 발효에 관여하고 있으며 미생물의 분포에 따라 맛과 향이 달라진다. 다양한 발효 미생물이 자연적으로 접종되어 발효, 숙성되는 재래식 된장과 달리, 개량식 된장은 선별된 종균을 접종하여 발효가 되기 때문에 비교적 일정한 품질의 제품을 생산할 수 있다. 하지만 단일 미생물의 작용에 의해 그 맛이 단순하고 깊지 못한 단점이 있다. 이러한 단점을 해결하기 위해 기본으로 사용하는 A. oryzae 외에 종균을 사용하여 발효 식품의 풍미를 강화할 수 있다.
[미생물 균주 및 항균 조성물]
본 발명자들은 전통 장류인 된장으로부터 다양한 미생물 균주를 1차적으로 선별하고, 해당 미생물 균주를 동정하기 위하여 형태적, 생리학적 분석과 16S rRNA를 비교하였다. 본 발명에 따른 락토바실러스 사케이 NSML-52 균주는 간균(bacillus) 형태로서, 집락(colony) 색깔은 흰색이며, 운동성 및 카탈라제(catalase) 활성은 없으며, 37℃에서 24시간 생육할 수 있고, 비-호기성 조건에서도 증식할 수 있다. 또한 락토바실러스 사케이 NSML-52 균주의 분리된 16S rRNA 서열(서열식별번호: 1)을 갖는다. 도 1에 도시된 계통 연관성과 16S rRNA 염기 서열을 토대로 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei)로 분리, 동정될 수 있다.
락토바실러스 사케이 NSML-52 균주는 예를 들어 8% 내지 11%의 고염 조건에서도 사멸하지 않고 증식 및 배양이 가능하여 내염성이 우수하다. 뿐만 아니라, 락토바실러스 사케이 NSML-52 균주는, 발효 식품의 부패를 야기하고, 설사나 구토를 일으키는 식중독 균인 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)와 식중독 및 출혈성 장염을 야기할 수 있는 대장균(Escherichia coli)에 대한 항균 활성이 우수하다. 본 발명의 락토바실러스 사케이 NSML-52 균주는 2020년 3월 27일 서울 서대문구 소재의 한국미생물보전센터에 수탁번호 KFCC11855P로 기탁되어 있다.
본 발명의 다른 측면에서 락토바실러스 사케이 NSML-52 균주 또는 이의 배양물을 포함하며, 적어도 바실러스 세레우스 및 대장균에 대한 항균 활성을 가지는 조성물에 관한 것이다.
상기 배양물은 락토바실러스 사케이 NSML-52 균주를 배양시켜 얻어질 수 있다. 일례로, 락토바실러스 사케이 NSML-52 균주를 적절한 배지, 예를 들어 MRS 등의 배지에 접종하고 30 내지 40℃, 예를 들어 33 내지 37℃에서 12 시간 내지 48 시간, 예를 들어 15 시간 내지 30 시간 배양하여 상기 배양물을 얻을 수 있다. 일례로, 상기 배양물은 균체가 제거된 배양물이거나 균체가 포함된 배양물일 수 있고, 액체 상태 또는 고체 상태일 수 있다.
예를 들어 균체가 제거된 액체 상태의 배양물은 MRS 액체 배지에 본 발명에 따른 락토바실러스 사케이 NSML-52 균주를 접종, 배양하여 균주 배양액을 얻은 뒤에, 균주 배양액을 원심분리 하여 그 중에서 상등액을 회수, 여과하는 방법으로 수득할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 고체 상태의 배양물은 균주 배양액을 농축 및 분무 건조하는 방법으로 수득할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 항균 조성물은 락토바실러스 사케이 NSML-52 균주 또는 이의 배양물 그 자체일 수 있고, 제형화(formulation)를 위하여 필요한 담체, 부형제 및/또는 희석제와 같이 항균 조성물에 통상적으로 사용되는 다른 첨가제가 더욱 포함될 수 있다.
예를 들어, 항균 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제는 락토오스, 덱스트로스, 덱스트린, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 셀룰로스, 메틸셀룰로스, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 칼슘 카보네이트, 프로필렌글리콜, 리퀴드 파라핀, 생리식염수 및 이들의 조합으로 구성되는 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, 통상적인 담체, 부형제 및/또는 희석제를 모두 사용할 수 있다. 필요에 따라, 항균 조성물은 락토바실러스 사케이 NSML-52 균주 또는 이의 배양물 이외에 다른 항균 물질을 더욱 포함할 수 있다.
하나의 예시적인 실시형태에서, 본 발명에 따른 락토바실러스 사케이 NSML-52 균주 또는 이의 배양물의 함량은 사용 목적 및 사용 방법 등을 고려하여 적절하게 설계될 수 있다. 일례로, 락토바실러스 사케이 NSML-52 균주 또는 이의 배양물은 항균 조성물 중에 1 내지 100 중량%, 바람직하게는 10 내지 100 중량%, 더욱 바람직하게는 30 내지 100 중량%의 함량으로 포함될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
[발효 식품 및 응용]
전술한 바와 같이, 락토바실러스 사케이 NSML-52 균주는 우수한 내염성이 있고, 유해 미생물에 대한 항균 활성을 가진다. 이에 따라, 락토바실러스 사케이 NSML-52 균주 및 이의 배양물은 내염성 발효 식품, 예를 들어 장류, 젓갈이나 김치와 같은 발효 식품이나 식품 첨가제에 적용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 균주 및 이의 배양물은 발효 식품을 제조하는데 활용될 수 있다.
예를 들어, 식품 첨가제는 락토바실러스 사케이 NSML-52 균주 또는 이의 배양물을 포함할 수 있다. 필요한 경우, 식품 첨가제는 제형화에 필요한 부형제나 희석제와 같은 첨가제를 더욱 포함할 수 있다. 이때, 락토바실러스 사케이 NSML-52 균주 또는 이의 배양물은 식품 첨가제 중에 1 내지 100 중량%, 바람직하게는 10 내지 100 중량%, 더욱 바람직하게는 30 내지 50 중량%의 함량으로 포함될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
한편, 락토바실러스 사케이 NSML-52 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 발효 식품은 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, 상기 발효 식품은 육가공품, 어육제품, 두부, 묵, 죽, 라면이나 국수 등의 면류, 간장, 된장, 고추장, 청국장, 혼합장 등의 장류 조미식품, 소스, 과자, 발효유나 치즈 등의 유가공품, 김치나 장아찌 등의 절임 식품, 과실, 채소, 두유, 발효음료 등의 음료수일 수 있으며, 이들 식품을 제조하는 과정 중에 상기 항균용 조성물을 첨가하는 방법으로 제조할 수 있다.
이때, 락토바실러스 사케이 NSML-52 균주 또는 이의 배양물의 첨가량은 발효 식품의 종류, 형태, 목적 및 제조 방법을 고려하여 적절하게 설계될 수 있다. 일례로, 된장과 같은 장류 조미식품을 제조하는 과정에서, 본 발명에 따른 락토바실러스 사케이 NSML-52 균주 또는 이의 배양물은 발효 대상 원료의 총 중량에 대하여 1 내지 20 중량%, 바람직하게는 5 내지 15 중량%의 비율로 접종, 첨가될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
이때, 본 발명에 따른 락토바실러스 사케이 NSML-52 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 발효 식품은 그 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및/또는 희석제를 포함할 수 있고, 그 외에도 향미제 또는 천연 탄수화물과 같은 식품 보조 첨가제 성분을 더욱 포함할 수 있다.
전술한 천연 탄수화물의 예는 포도당, 과당과 같은 단당류; 말토스, 수크로스와 같은 이당류; 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 다당류 등을 포함하는 통상적인 당류는 물론이고, 자일리톨, 솔비톨, 에리쓰리톨 등의 당 알코올을 포함할 수 있다. 그 외의 향미제 또는 감미제로서 타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어, 레바이디오시드 A, 글리시르히진)과 같은 천연 향미제 또는 천연 감미제; 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 향미제 또는 합성 감미제 등을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 사케이 NSML-52 균주를 발효 대상 물질에 첨가 또는 접종시켜 발효 식품을 제조하는 방법을 제공한다. 전술한 바와 같이, 발효 식품은 육가공품, 어육제품, 두부, 묵, 죽, 라면이나 국수 등의 면류, 간장, 된장, 고추장, 청국장, 혼합장 등의 장류 조미식품, 소스, 과자, 발효유나 치즈 등의 유가공품, 김치나 장아찌 등의 절임 식품, 과실, 채소, 두유, 발효음료 등의 음료수일 수 있다. 도 1은 본 발명의 예시적인 실시형태에 따라 락토바실러스 사케이 NSML-52 균주를 접종시켜 장류의 하나인 된장을 제조하는 과정을 개략적으로 나타낸 공정 순서도이다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 우선 된장을 제조하기 위한 발효 대상 물질인 메주를 성형하기 위한 원료인 대두 및 쌀을 혼합하고 이를 침지한다(s110 단계). 이때, 메주를 성형하기 위한 원료인 대두 및 쌀은 대략 1:1 내지 2:1의 중량 비율로 배합될 수 있고, 배합된 대두와 쌀은 2 내지 6시간 상온에서 충분히 침지시킨다. 침지 이후에 대두와 쌀을 증자하는데(s120 단계), 증자 온도는 대략 110 내지 130℃이고 증자 시간은 10 분 내지 60분일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
증자 이후에 1차 접종 공정이 수행된다(s130 단계). 일례로, 1차 접종에 사용되는 균주는 아스퍼질러스 오리제(Aspergillus oryzae, 황국곰팡이), 아스퍼질러스 소제(Aspergillus sojae), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 나토(Bacillus natto) 및 이들의 조합으로 구성되는 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는, 1차 접종 균주는 아스퍼질러스 오리제 및 아스퍼질러스 소제 및 이들의 조합으로 구성되는 군에서 선택되는 국균을 사용할 수 있다.
일례로, 1차 접종에 사용되는 균주는 분말 상태로 가공된 것일 수 있고, 증자 공정이 완료된 대두 및 쌀의 총량을 기준으로 대략 0.1 내지 1.0 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 0.5 중량%의 비율로 접종될 수 있다. 1차 접종이 완료되면, 접종 균주가 충분히 배양될 수 있도록 25 내지 35℃의 온도, 상대 습도 50 내지 70%의 조건에서 24 시간 내지 96시간, 바람직하게는 36 시간 내지 72 시간 숙성될 수 있다.
1차 접종 및 숙성이 완료되면, 메주로 성형하고(s140 단계), 다시 25 내지 35℃의 온도 및 상대 습도 20 내지 40%의 조건에서 대략 5일 내지 10일 가량 발효시킨다(s150 단계).
1차 접종에 의하여 메주가 충분히 발효되면, 메주에 염수를 첨가하여 침지한다(s160 단계). 메주와 염수는 대략 1:2 내지 2:1의 중량 비율이 될 수 있도록 염수를 첨가할 수 있고, 첨가하기 전의 염수 중의 염도는 대략 10 내지 20%(w/v)로 조절하여, 메주에 염수가 첨가된 상태에서 최종적인 염도는 대략 5 내지 15%(w/v), 예를 들어 7 내지 3%(w/v)가 될 수 있도록 설계될 수 있다. 2차 침지 단계(s160 단계)는 대략 5일 내지 10일 동안 상온에서 수행될 수 있다.
이어서, 본 발명에 따른 락토바실러스 사케이 NSML-52 균주를 염수가 첨가된 메주에 2차 접종한다(s170 단계). 2차 접종 이전에 락토바실러스 사케이 NSML-52 균주는 대략 30 내지 40℃, 예를 들어 33 내지 37℃에서 12 시간 내지 48 시간, 예를 들어 15 시간 내지 30 시간 배양할 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 락토바실러스 사케이 NSML-52 균주는 내염성이 우수하기 때문에, 높은 염도 조건에서도 배양될 수 있다. 고염 조건에서 발효, 숙성할 수 있기 때문에, 곰팡이나 유해 세균에 의하여 본 발명의 발효 식품이 오염되지 않는다. 뿐만 아니라, 락토바실러스 사케이 NSML-52 균주에 의해 메주가 발효되는 과정에서, 해당 유산균이 활성화되면서 각종 유해균에 의한 부패를 억제한다.
하나의 예시적인 실시형태에서, 2차 접종 단계(s176 단계)에서, 배양물 중의 락토바실러스 사케이 NSML-52 균주의 균수는 대략 106 내지 109, 바람직하게는 107 내지 108개로 조정될 수 있고, 염수와 배합된 메주의 총량 대비 락토바실러스 사케이 NSML-52 균주를 포함하는 배양물은 1 내지 20 중량%, 바람직하게는 5 내지 15 중량%의 비율로 접종, 첨가될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
2차 접종이 완료되면, 성형된 메주를 분쇄하고(s180 단계), 20일 이상, 예를 들어 20일 내지 40일 동안, 25 내지 35℃, 상대 습도 20 내지 40%의 조건에서 충분히 발효, 숙성시켜(s190 단계), 원하는 된장을 제조할 수 있다.
이하, 예시적인 실시형태를 통하여 본 발명을 설명하지만, 본 발명이 하기 실시예에 기재된 기술사상으로 한정되지 않는다.
실시예 1: 미생물 균주의 분리 및 동정
경기도 성남, 전라북도 순창, 경상남도 밀양 지역에서 전통 방식으로 제조한 된장 샘플을 수집하였다. MRS 배지에 1.5% Agar, 2% NaCl, 0.7% CaCO3를 첨가하여 멸균하고, L-시스테인, HCL, Nalidixic acid를 각각 최종 농도 100 mg/L, 25 mg/L가 되도록 무균적으로 첨가한 선택 배지에 수집된 된장 샘플을 넣고 도말평판법(Spread plate method)으로 도말한 후 35℃에서 24 시간 동안 배양하였다. 배양된 균주 중에서 배양 중 생성된 균과 CaCO3가 반응하여 투명한 환을 생성하는 집락(colony)을 유산균으로 특정하여, NSML-16, NSML-21, NSML-22, NSML-24, NSML-27, NSML-35, NSML-52 균주를 선별하였다.
선별된 균주의 형태적, 심리학적 특징을 분석하고, NSML-52 균주의 분석된 16S rRNA 염기 서열(서열식별번호: 1)을 NCBI blast search를 통해 확인하여, 분리된 유산균을 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei)로 동정하였다. 상기와 같은 방법으로 선별, 동정된 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) NSML-52 균주의 형태적, 생리학적 특징을 하기 표 1에 나타낸다. 분리, 동정된 락토바실러스(Lactobacillus sakei) NSML-52 균주는 2020년 3월 27일 서울 서대문구 소재의 한국미생물보전센터에 기탁(기탁번호: KFCC11855P)하였다.
유산균 균주의 형태적 생리학적 특징
분리원 전통 된장 (경남 밀양)
형태 간균
집락(colony) 색깔 흰색
운동성 없음
카탈라제(catalase) 시험 -
생육 온도 및 시간 37℃, 24 시간
산소 요구도 미호기성
실시예 2: 내염성 평가 (배지 환경)
실시예 1을 통해 선별된 균주들을 MRS 배지에서 24 시간 2차 계대배양(subculture)하였다. 내염성을 평가하기 위하여 NaCl을 첨가하여 염 농도를 8%로 조정한 MRS 배지에 초기 생균수를 아래 표 2에서와 같이 각각 접종하고, 35℃에서 24시간 동안 배양하였다. 접종 초기와 24시간 배양 후의 생균수를 도말평판법으로 측정하였다. 측정 결과를 하기 표 2와 도 3에 나타낸다. 표 2 및 도 3에 나타낸 바와 같이, NSML-52 균주의 생균수는 8% 염 농도에서 크게 증가한 것을 확인하였다.
유산균 균주의 8% 염도 조건에서 생균수 변화
균주 초기 생균수(cfu/㎖) 24시간 배양 후 생균수(cfu/㎖)
NSML-16 1.02 ⅹ107 12.9 ⅹ107
NSML-21 4.345 ⅹ107 10.9 ⅹ107
NSML-22 2.58 ⅹ107 2.58 ⅹ107
NSML-24 0.855 ⅹ107 2.935 ⅹ108
NSML-27 2,815 ⅹ107 2.815 ⅹ107
NSML-35 2.05 ⅹ107 3.75 ⅹ106
NSML-52 1.115 ⅹ107 3.27 ⅹ108
실시예 3: 내염성 평가 (고염 장류 조건)
실시예 2에서 내염성이 확인된 락토바실러스 사케이 NSML-52 균주를 발효 식품인 된장에 적용하여, 생균수를 평가하였다. 대두 (1.5 kg)과 쌀(1 kg)을 혼합하고 4시간 동안 상온에서 침지시켰다. 이어서, 121℃에서 30분 동안 증자하고 분말 균주인 아스퍼질러스 오리제(Aspergillus oryzae, 충무발효)를 대두 및 쌀의 혼합물 중량 대비 0.3%로 접종하였다. 접종 후 30℃에서 48시간 동안 발효하여 종국을 제조하고 이렇게 제조된 종국을 분쇄하여 메주로 성형하였다. 이 메주를 30℃, 습도 30%에서 7일간 발효 후, 메주와 22% 염도의 염수와 중량대비 1:1이 되도록 혼합하여 침지하고, 이를 분쇄하여 최종 염도 11%의 된장을 제조하고 이 된장에 락토바실러스 사케이 NSML-52 종균을 메주 및 염수의 중량 대비 10%, 초기 생균수가 107이 되도록 접종하고, 3030℃, 습도 30%에서 30일 동안 발효, 숙성시켜 된장을 제조하였다. 락토바실러스 사케이 NSML-52 종균을 접종하고 10일마다 생균수를 측정하였다. 측정 결과를 하기 표 3에 나타낸다.
락토바실러스 사케이 NSML-52 균주의 11% 염도 조건에서 생균수 변화
발효 시간 생균수 (cfu/㎖)
0시간 2.06 ⅹ107
10일 1.40 ⅹ107
20일 9.35 ⅹ106
30일 1.24 ⅹ107
표 3에 나타낸 바와 같이, 염도 11%의 된장에 락토바실러스 사케이 NSML-52 종균을 접종시켜 발효를 진행하면, 기간 경과에 따라 초기 생균수가 약간 줄어들었으나, 발효 20일 이후 다시 증식하는 것을 확인하였다. 본 실시예를 통해, 락토바실러스 사케이 NSML-52 균주가 된장과 같은 고염 발효 식품의 발효 환경에서도 양호하게 생육하는 것을 확인하였다.
실시예 4: 항균 활성 평가
실시예 2에서 선별된 락토바실러스 사케이 NSML-52 균주의 유해 균주에 대한 항균 활성을 평가하였다. 선발된 유산균을 MSR 배지에 넣고 35℃에서 24시간 배양하고, 배양액을 12,000 g에서 10분 동안 원심분리 후, 상등액을 사용하였다. 유해균으로 Bacillus cereus ATCC 14579와 Escherichia coli KCTC 2571을 각각 배양하여, Nutrient Agar plate에 도말하고, 그 위에 paper disk (사이즈 8 mm)를 올려 선발된 유산균의 상등액을 40 ㎕씩 분주하고, 35℃에서 다시 24시간 배양하고, 생성된 환을 확인하여 항균 활성을 평가하였다. 평가 결과를 하기 표 4에 나타낸다. 락토바실러스 사케이 NSML-52 균주는 발효 식품의 부패를 야기하고, 설사나 구토를 일으키는 식중독 균인 바실러스 세레우스와 식중독 및 출혈성 장염을 야기할 수 있는 E. coli에 대한 항균 활성을 가지는 것을 확인하였다.
락토바실러스 사케이 NSML-52 균주의 항균 활성
유해균 Inhibitor zone (mm)
Bacillus cereus 9.67±1.03
Escherichia coli 9.67
실시예 5: 내염성 평가
실시예 2 및 실시예 3에서 내염성이 확인된 락토바실러스 사케이 NSML-52 균주와 다른 유산균 균주의 내염성을 비교하였다. 염 농도를 11%로 조정하고, 각각의 균주에 대한 초기 생균수를 하기 표 5에 기재된 것처럼 조정한 것을 제외하고 실시예 2의 절차를 반복하였다. 다른 락토바실러스 사케이 균주는 국립농원과학원에서 분양 받은 락토바실러스 사케이 KACC12421, 락토바실러스 사케이 KACC16119, 락토바실러스 사케이 KACC18352와, 락토바실러스 사케이 NSML-24 (KFCC11853P)를 각각 사용하였다. 평가 결과를 하기 표 5와 도 4에 각각 나타낸다.
유산균 균주의 11% 염도 조건에서 생균수 변화
균주 초기 생균수(cfu/㎖) 24시간 배양 후 생균수(cfu/㎖)
NSML-24 5.65 ⅹ106 9.60 ⅹ105
NSML-52 1.02 ⅹ107 6.65 ⅹ106
KACC12421 1.06 ⅹ107 1.14 ⅹ106
KACC16119 9.9 ⅹ106 7.65ⅹ105
KACC18352 1.04 ⅹ107 9.95 ⅹ105
표 5와 도 4에 나타낸 바와 같이, 염 농도를 11로 조정하였을 때, 실험에 사용된 모든 유산균 균주들이 초기 생균수 대비 24시간 배양 후의 생균수가 감소하였다. 하지만, 락토바실러스 사케이 NSML-52 균주는 다른 유산균 균주에 비하여 생균수가 적게 감소하여, 고염 조건에서도 내염성이 우수한 것을 확인하였다.
실시예 6: 항균성 평가
실시예 4에서 항균성이 확인된 락토바실러스 사케이 NSML-52 균주와, 실시예 5에서 사용한 다른 유산균 균주의 항균성을 실시예 4와 동일한 조건에 따라 평가하였다. 평가 결과를 하기 표 6에 나타낸다. 표 6에 나타낸 바와 같이, 락토바실러스 사케이 NSML-52 균주는 다른 유산균 균주와 비교해서 유해균에 대한 항균 활성이 우수한 것을 확인하였다.
유산균 균주의 항균 활성
균주 Inhibitor zone (mm)
B. cereus E. coli
NSML-24 10.60±1.14 9.40±0.55
NSML-52 11.00±0.71 10.80±0.84
KACC12421 - -
KACC16119 - -
KACC18352 8.80±0.84 9.20±0.84
상기에서는 본 발명의 예시적인 실시형태 및 실시예에 기초하여 본 발명을 설명하였으나, 본 발명이 상기 실시형태 및 실시예에 기재된 기술사상으로 한정되는 것은 아니다. 오히려 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 전술한 실시형태 및 실시예를 토대로 다양한 변형과 변경을 용이하게 추고할 수 있다. 하지만, 이러한 변형과 변경은 모두 본 발명의 권리범위에 속한다는 점은, 첨부하는 청구범위에서 분명하다.
한국미생물보존센터(국내) KFCC11855P 20200327
<110> NONGSHIM CO., LTD. <120> LACTIC ACID BACTERIUM HAVING EXCELLENT HALOTOERANCE AND ANTIBACTERIAL PROPERTY AND APPLICATION THEREOF <130> 2849 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1400 <212> RNA <213> Lactobacillus casei <400> 1 ctcgtttaga ttgaaggagc ttgctcctga ttgataaaca tttgagtgag tggcggacgg 60 gtgagtaaca cgtgggtaac ctgccctaaa gtgggggata acatttggaa acagatgcta 120 ataccgcata aaacctaaca ccgcaaggtg tagggttgaa agatggtttc ggctatcact 180 ttaggatgga cccgcggtgc attagttagt tggtgaggta aaggctcacc aagaccgtga 240 tgcatagccg acctgagagg gtaatcggcc acactgggac tgagacacgg cccagactcc 300 tacgggaggc agcagtaggg aatcttccac aatggacgaa agtctgatgg agcaacgccg 360 cgtgagtgaa gaaggttttc ggatcgtaaa actctgttgt tggagaagaa tgtatctgat 420 agtaactgat caggtagtga cggtatccaa ccagaaagcc acggctaact acgtgccagc 480 agccgcggta atacgtaggt ggcaagcgtt gtccggattt attgggcgta aagcgagcgc 540 aggcggtttc ttaagtctga tgtgaaagcc ttcggctcaa ccgaagaagt gcatcggaaa 600 ctgggaaact tgagtgcaga agaggacagt ggaactccat gtgtagcggt gaaatgcgta 660 gatatatgga agaacaccag tggcgaaggc ggctgtctgg tctgtaactg acgctgaggc 720 tcgaaagcat gggtagcaaa caggattaga taccctggta gtccatgccg taaacgatga 780 gtgctaggtg ttggagggtt tccgcccttc agtgccgcag ctaacgcatt aagcactccg 840 cctggggagt acgaccgcaa ggttgaaact caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagcg 900 gtggagcatg tggtttaatt cgaagcaacg cgaagaacct taccaggtct tgacatcctt 960 tgaccactct agagatagag ctttcccttc ggggacaaag tgacaggtgg tgcatggttg 1020 tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccttattac 1080 tagttgccag catttagttg ggcactctag tgagactgcc ggtgacaaac cggaggaagg 1140 tggggacgac gtcaaatcat catgcccctt atgacctggg ctacacacgt gctacaatgg 1200 atggtacaac gagttgcgag accgcgaggt ttagctaatc tcttaaaacc attctcagtt 1260 cggattgtag gctgcaactc gcctacatga agccggaatc gctagtaatc gcggatcagc 1320 atgccgcggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc atgagagttt 1380 gtaacaccca aagccggtga 1400

Claims (10)

  1. 락토바실러스 사케이 NSML-52(Lactobacillus sakei NSML-52, KFCC11853P) 균주.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 균주는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 및 대장균 (Escherichia coli) 중에서 적어도 하나의 세균에 대한 항균 활성을 가지는 미생물 균주.
  3. 락토바실러스 사케이 NSML-52(Lactobacillus sakei NSML-52, KFCC11853P) 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 함유하는 항균 활성을 가지는 조성물.
  4. 락토바실러스 사케이 NSML-52(Lactobacillus sakei NSML-52, KFCC11853P) 균주 또는 이의 배양물을 첨가하여 제조된 발효 식품.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 발효 식품은 장류를 포함하는 발효 식품.
  6. 제 4항에 있어서, 상기 발효 식품은 된장을 포함하는 발효 식품.
  7. 락토바실러스 사케이 NSML-52(Lactobacillus sakei NSML-52, KFCC11853P) 균주 또는 이의 배양물을 첨가하여 제조된 식품 첨가제.
  8. 락토바실러스 사케이 NSML-52(Lactobacillus sakei NSML-52, KFCC11853P) 균주 또는 이의 배양물을 발효 대상 물질에 접종시켜 발효 식품을 제조하는 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 발효 식품은 장류를 포함하는 방법.
  10. 제 8항에 있어서, 상기 락토바실러스 사케이 MSML-52 균주 또는 이의 배양물은 상기 발효 대상 물질 대비 1 내지 20 중량%의 비율로 접종되는 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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