CN116716228A - 一种具有提高类黄酮含量的植物乳植杆菌el6及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种具有提高类黄酮含量的植物乳植杆菌EL6及其应用，属于微生物饲料技术领域，用以解决现有技术中青贮发酵过程中还未有提高类黄酮含量的专用乳酸菌菌剂。本发明所述的植物乳植杆菌EL6为革兰氏染色阳性菌，为葡萄糖兼型发酵，具有耐酸和生长速度快等优点；且对类黄酮存在生物转化能力，能够显著提高苜蓿青贮中类黄酮的含量，促进了结合态类黄酮的释放和转化。植物乳植杆菌EL6改善了青贮饲料的发酵品质，具有成本低、安全、可靠、易于利用等优点。

Description

一种具有提高类黄酮含量的植物乳植杆菌EL6及其应用

技术领域

本发明涉及微生物饲料技术领域，尤其涉及一种具有提高类黄酮含量的植物乳植杆菌EL6及其应用。

背景技术

紫花苜蓿是豆科苜蓿属多年生草本植物，具有蛋白含量高、适口性好等优点，并且含有多种活性物质，是反刍动物的优质饲草来源。青贮作为一种简单易行，成本较低的牧草贮藏手段，能很好的保存牧草的营养价值，提高牧草的适口性和消化率。

青贮发酵可促进活性物质的释放，如类黄酮，这是一类拥有抗菌、抗氧化功能的植物次级代谢产物，对动物健康有重要意义。青贮的关键在于乳酸菌的主导的乳酸发酵程度，但目前在青贮饲料中还未有用以提高类黄酮含量的专用乳酸菌菌剂。

发明内容

鉴于上述的分析，本发明旨在提供一种具有提高类黄酮含量的植物乳植杆菌EL6及其应用，用以解决现有技术中青贮发酵过程中还未有提高类黄酮含量的专用乳酸菌菌剂。

第一方面，一种保藏编号为CGMCC No.27566的植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)EL6。

进一步的，所述的植物乳植杆菌EL6包含SEQ ID NO.1所示的16SrDNA。

进一步的，所述的植物乳植杆菌EL6从苜蓿中分离培养得到。

第二方面，本发明提供了一种青贮饲料添加剂，包括所述的植物乳植杆菌EL6。

第三方面，本发明提供了一种青贮饲料，包括所述的植物乳植杆菌EL6。

进一步的，还包括苜蓿青贮饲料，优选的，苜蓿青贮饲料为紫花苜蓿青贮饲料。

第四方面，本发明提供了一种青贮饲料的制备方法，包括：将青贮原料与所述的植物乳植杆菌EL6混合发酵，得到所述的青贮饲料。

进一步的，所述的植物乳植杆菌EL6与青贮原料的质量比≥1.0×10⁶CFU/g。

进一步的，所述的青贮原料为紫花苜蓿。

第五方面，本发明提供了一种所述的植物乳植杆菌EL6在制备青贮饲料中的应用。

与现有技术相比，本发明至少可实现如下有益效果之一：

(1)本发明所述的植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)EL6为革兰氏染色阳性菌，为葡萄糖兼型发酵，具有耐酸、生长速度快等优点，对类黄酮存在生物转化能力，能够显著提高苜蓿青贮中类黄酮的含量，促进了结合态类黄酮的释放和转化；

(2)本发明所述的植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)EL6相对于其他常规乳酸菌，能够显著提升苜蓿青贮时类黄酮的转化效率，提高青贮后苜蓿中类黄酮的种类和含量，定向提供品质优良且富含类黄酮的功能性苜蓿青贮；

(3)利用本发明所述的植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)EL6可以改善青贮饲料的发酵品质，成本低、安全、可靠、易于利用。

本发明中，上述各技术方案之间还可以相互组合，以实现更多的优选组合方案。本发明的其他特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分优点可从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。

具体实施方式

本发明的一个具体实施例，公开了一种植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)EL6，其菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC No.27566，保藏日期为2023年06月06日。

于一个实施方式中，所述的植物乳植杆菌EL6包含SEQ ID NO.1所示的16S rDNA。

于一个实施方式中，所述的植物乳植杆菌EL6从苜蓿中分离培养得到。

具体地，所述的植物乳植杆菌EL6的分离培养过程包括：

将新鲜的苜蓿进行消毒处理，研磨，加入8.5％的无菌生理盐水，取上清液，移至MRS培养基中培养。

于一个实施方式中，所述的植物乳植杆菌EL6菌株的生长温度为15-45℃，进一步的，生长温度为30-35℃，例如，生长温度为15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃。

本发明的另一个具体实施例，公开了一种青贮饲料添加剂，包括所述的植物乳植杆菌EL6。

本发明的另一个具体实施例，公开了一种青贮饲料，包括所述的植物乳植杆菌EL6。

于一个实施方式中，还包括苜蓿青贮饲料，优选的，所述的苜蓿青贮饲料为紫花苜蓿青贮饲料。

本发明的另一个具体实施例，公开了一种青贮饲料的制备方法，包括：将青贮原料与所述的植物乳植杆菌EL6混合发酵，得到所述的青贮饲料。

于一个实施方式中，所述的青贮原料为紫花苜蓿。

于一个优选的实施例，所述的紫花苜蓿青贮饲料的具体制备方法如下：

(1)将待发酵的紫花苜蓿原料切碎并混合均匀；

(2)向紫花苜蓿原料中加入所述的植物乳植杆菌EL6；

(3)将添加了植物乳植杆菌EL6的原料真空密封后贮藏。

于一个实施方式中，步骤(1)中，所述的苜蓿原料且碎至2-3cm。

于一个实施方式中，步骤(3)中，贮藏的温度为20-25℃，贮藏6天后pH值降至为4.08-4.35。

于一个实施方式中，所述的植物乳植杆菌EL6与苜蓿原料的质量比≥1.0×10⁶CFU/g。

进一步的方案，所述的植物乳植杆菌EL6与苜蓿原料的质量比1.0×10⁶～2.0×10⁶CFU/g。

本发明的另一个具体实施例，公开了一种所述的植物乳植杆菌EL6在制备青贮饲料中的应用。

需要说明的，本发明所述的植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)EL6相对于其他常规乳酸菌，能够提升苜蓿青贮时类黄酮的转化效率，提高青贮后苜蓿中类黄酮的种类和含量，定向提供品质优良且富含类黄酮的功能性苜蓿青贮。

以下结合具体的实施例，进行解释说明本发明的技术方案。

本发明中的苜蓿取自内蒙古自治区呼伦贝尔市中国科学院生态草牧业鄂温克试验站(东经：116.33°，北纬：39.98°)的初花期紫花苜蓿。

实施例1

菌株EL6的分离和筛选

1、将新鲜的苜蓿材料装入无菌采样袋中带回实验室，在超净工作台无菌环境下称取5-10g整株苜蓿计重后进行表面消毒操作：依次将其浸入70％乙醇90s，3.25-4％次氯酸钠120s，70％乙醇30S，无菌水冲洗3次并使用无菌滤纸吸净表面水分，最后一次冲洗的无菌水涂布做为对照，将消毒后的材料放入灭菌研钵进行研磨(加入少许灭菌的石英砂有助于研磨，碳酸钙做缓冲)，将组织研碎后加入9ml的8.5％无菌生理盐水充分搅拌，然后静置3min，取上清液(记为10^-1浓度梯度)1mL并按10倍稀释度依次稀释至10^-3，分别取各梯度稀释液100uL在MRS固体培养基上进行平板涂布，将平板放入厌氧袋后置于30℃或37℃培养箱培养。

其中，MRS培养基为：蛋白胨(Proteose peptone NO.3)10.0g；牛肉膏(Beefextract)10.0g；酵母提取物(Yeast extract)5.0g；葡萄糖(Dextrose)20.0g；吐温(Polysorbate 80)1mL；柠檬酸铵(Ammonium citrate)2.0g；醋酸钠(NaAc)5.0g；硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)0.1g；硫酸锰(MnSO₄·4H₂O)0.05g；磷酸氢二钾(K₂HPO₄)2.0g；蒸馏水(H₂O)1000mL，固体培养基再加15g/L琼脂(Agar)，121℃，灭菌20min。长出菌落后挑取单菌落反复进行平板划线分离，直到得到单菌落，将单菌落用接种针接种至MRS固体培养基试管斜面，于4℃冰箱保存。

2、革兰氏染色法：挑一环水于载玻片中央，再用接种环挑取少量上述培养的菌株与玻片上的水滴均匀混合并涂成薄的菌膜自然干燥；玻片向上在微火上固定：结晶紫初染1min后用水充分淋洗(动作轻柔，避免水流直接冲击菌块)。滴加碘液媒染1-2min：用95％乙醇脱色并水洗：番红复染1-2min水洗；自然干燥；1000倍油镜观察：蓝紫色为革兰氏阳性菌，红色为革兰氏阴性菌。

进行革兰氏染色和细胞形状观察，依据其在MRS肉汤内24h的OD₆₀₀nm值及pH值筛选出生长速度快且产酸能力强的内生乳酸菌(菌株EL6)，并做详细的生长曲线及相关生理指标测定。

结果表明，菌株EL6为革兰氏阳性，兼型发酵的杆菌，生长速度快，产酸能力强，耐酸、耐盐性强，生理生化特性见表1。

其中，生理生化特性具体的测试方法如下：

过氧化氢酶实验：用枪头吸取3％(体积分数)过氧化氢溶液于平板上，用接种环挑取菌少许，与过氧化氢溶液充分混合，2-3min后观察有气泡产生的为阳性，无为阴性。

乳酸菌产酸和生长速率的测定及筛选：将已分离纯化的菌株接种到3mL的MRS液体培养基中，置于30℃，250rpm摇床过夜培养约14-16h。按1％(V/V)的接种量转入新的3mLMRS液体培养基中，于30℃，250rpm摇床培养，分别在接种时间后0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24h测定MRS液体培养基的pH值，在波长600nm下测定吸光度值。每株菌每个时间点需要做3个重复，且培养菌的试管需要同种规格。

温度耐受性试验：按1％(V/V)的接种量分别转入新的MRS液体培养基中，分别置于4℃、15℃、45℃的恒温培养中培养2天。

pH耐受性试验：按1％(V/V)的接种量接种到pH为3.0、3.5、4.0、4.5、9.0的MRS液体培养基30℃培养2天(用2.0M的NaOH或者1.0M的HCL调节)。

耐盐性：将乳酸菌接种到NaCl含量分别为3％、6.5％的MRS液体培养基中后置于30℃培养箱中培养2天，观察乳酸菌生长状况。

对比例1

菌株L3的分离和筛选

将新鲜的苜蓿材料装入无菌采样袋中带回实验室，并在超净工作台无菌环境下称取20g整株苜蓿于180mL无菌生理盐水中，摇床180r/min室温振荡2h，得到浓度为100g·L^-1的原液，记为10^-1梯度，然后取该原液1mL加入含有9mL灭菌蒸馏水的试管振荡均匀，使其终浓度为10g·L^-1，记为10^-2梯度，使用该方法依次稀释至10^-4梯度，分别取各梯度稀释液100uL在MRS固体培养基上进行平板涂布，置于30℃或37℃培养箱培养。其中，MRS培养基配方与实施例1相同。长出菌落后挑取单菌落反复进行平板划线分离，直到得到单菌落L3，将单菌落用接种针接种至MRS固体培养基试管斜面，于4℃冰箱保存。

本对比例的菌株L3的生理生化特性测试方法与实施例1相同，菌株L3的生理生化特性结果见表1。

表1菌株EL6和菌株L3的生理生化特性

注：w:OD₆₀₀nm＜0.5；+:0.5≤OD₆₀₀nm＜1；++:1≤OD₆₀₀nm＜1.5；+++:1.5≤OD₆₀₀nm，-:OD₆₀₀nm＜0.5。

将实施例1筛选菌株EL6和对比例1筛选的菌株L3进行16S rDNA基因同源性分析

分别将菌株在5mL的MRS培养基中35℃培养过夜，菌液移入1.5mL的离心管中，10000rpm/min离心3min-5min收集菌，用TE 0.1(10mmol/LTris-HCL，0.1mmol/L EDTA，pH8.0)清洗两次，再用TIANamp Bacteria DNAKit(TIANGEN BIOTECH CO.,LTD,Beijing,China)试剂盒提取DNA，在OD₆₀₀ nm处检测其吸光值。然后，进行PCR扩增，16S rDNA的扩增引物为27f和1492r(Monis et al,2005)，PCR反应为95℃(5min)-94℃(30s)-55℃(1min)-72℃(1.5min)-72℃(10min)，其中94℃(30s)-55℃(1min)-72℃(1.5min)反应循环30次。

扩增产物送美吉生物科技有限公司(中国)测序，结果在NCBI的基因库中比对，找出与此菌亲缘相近的标准菌株植物乳杆菌等，用DNAman软件分析，将筛选菌株的16S rDNA的部分序列(约1400bp-1500bp)与标准菌进行相似度分析，菌株EL6的16S rDNA见SEQ IDNO.1，菌株EL6与植物乳杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)相似度超过99％，结合生理生化指标，判定菌株EL6与植物乳杆菌属同一种。菌株L3的16S rDNA见SEQ ID NO.2，菌株L3与戊糖片球菌相似度超过99％，结合生理生化指标，判断菌株L3与戊糖片球菌属同一种。

本发明所述的植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)EL6即为实施例1筛选分离得到的菌株EL6，戊糖乳杆菌(Lactobacilluspentosus)L3即为对比例1筛选分离得到的菌株L3。

应用例1

植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)EL6在青贮饲料中的应用试验

将苜蓿切短至2cm～3cm，苜蓿原料的营养成分如表1所示，混合均匀，分别接种实施例1得到的植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)EL6、对比例1得到的戊糖乳杆菌(Lactobacilluspentosus)L3，CK组不添加植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)EL6，每克新鲜材料分别加入菌株EL6和L3约1×10⁶CFU/g。均匀混合完毕后的苜蓿装入28cm×35cm的聚乙烯青贮袋，每个处理装4袋，每袋约500g，用真空密封机抽气、密封，置于室温20-25℃贮藏，发酵7天、15天和60天后开启，取样分析苜蓿青贮饲料发酵品质和营养成分，结果如表2-4所示。添加菌株EL6和L3青贮60天后类黄酮含量的变化如表5所示。

另外，苜蓿青贮饲料及原料成分分析方法如下：

取苜蓿青贮饲料样品各20g，加入180mL蒸馏水并搅拌均匀，用组织捣碎机将其搅碎1min，然后用四层纱布过滤，滤掉草渣得到的浸出液用于pH值、乳酸、乙酸、丙酸和氨态氮含量的测定。用pH计测定苜蓿青贮饲料浸出液的pH值(pHS-3C，中国上海)；乳酸、乙酸、丙酸含量用高效液相色谱仪分析分析，色谱柱：KC-811column，检测器：SPD-M10AVP，检测波长：210nm；流动相：3mmol/L高氯酸，流速：1mL/min，进样量：5uL，柱温50℃；氨态氮采用苯酚次氯酸钠比色法测定(Broderick和Kang，1980)；苜蓿原料和青贮饲料的干物质含量用烘干法测定，样品混匀后置于65℃鼓风干燥箱中烘干48h左右直至质量恒定，测定干物质含量；烘干的样品经植物粉碎机粉碎后过筛用于粗蛋白、粗脂肪、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量的测定；粗蛋白用凯氏定氮法测定，粗脂肪用石油醚提取法(AOAC，2010)测定，中性和酸性洗涤纤维含量用范氏洗涤纤维法(Van Soest等，1991)测定。

青贮饲料类黄酮靶向代谢分析样品的制备方法为：将苜蓿青贮饲料样品真空冷冻干燥，用球磨仪研磨(30Hz,1.5min)至粉末状，称取20mg，加入10μL浓度为4000nmol/L的内标混合工作液和500μL 70％的甲醇，超声30min，4℃,12000r/min离心5min，取上清液，过0.22um滤膜于进样瓶中，用于LC-MS/MS分析。色谱质谱采集条件为：使用超高效液相色谱(ExionLC^TMAD)和串联质谱(6500+)。液相条件为：色谱柱：WatersACQUITY UPLCHSS T3 C18柱(1.8μm,100mm×2.1mm i.d.)；A流动相为超纯水加0.05％的甲酸，B相为乙腈加0.05％的甲酸；流速0.35mL/min，柱温40℃，进样量2μL。洗脱梯度：0minA/B90:10(V/V)，1minA/B 80:20(V/V)，9min 30:70(V/V)，12.5min A/B 5:95(V/V)，13.5min 5:95(V/V)，13.6min 90:10(V/V)，15min90:10(V/V)。基于标准品构建Metware Database数据库，对质谱检测的数据进行定性分析。利用三重四级杆质谱的多反应监测模式进行定量分析。

表2青贮前苜蓿原料的营养成分

注：FM：鲜物质，DM：干物质。

表3植物乳植杆菌EL6添加剂对苜蓿青贮发酵品质的影响

注：ND，低于检测水平；T:Treatment；DM:干物质；TN:总氮。

表4植物乳植杆菌EL6添加剂对苜蓿青贮营养成分的影响

注：FM：鲜物质，DM：干物质。

表5与自然青贮苜蓿相比添加EL6和L3青贮60天后显著提高的类黄酮含量

从表2-5中可以看出，与对照组相比，植物乳植杆菌EL6添加剂可以提高苜蓿青贮中的乳酸、乙酸、丙酸的含量并降低其pH值，在干物质以及粗蛋白保存方面也有较好的效果。与青贮原料相比，添加植物乳植杆菌EL6可以显著提高21种类黄酮物质的含量，与添加戊糖乳杆菌(Lactobacilluspentosus)L3相比，添加植物乳植杆菌EL6可以显著提高18种类黄酮物质的含量，因此，所述的植物乳植杆菌EL6是一种既可以提高苜蓿青贮品质又能高效转化类黄酮的新型功能性添加剂，具有多效、强效、低成本等特点。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种保藏编号为CGMCCNo.27566的植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)EL6。

2.根据权利要求1所述的植物乳植杆菌EL6，其特征在于，所述的植物乳植杆菌EL6包含SEQ ID NO.1所示的16SrDNA。

3.根据权利要求1所述的植物乳植杆菌EL6，其特征在于，所述的植物乳植杆菌EL6从苜蓿中分离培养得到。

4.一种青贮饲料添加剂，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述的植物乳植杆菌EL6。

5.一种青贮饲料，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述的植物乳植杆菌EL6。

6.根据权利要求5所述的青贮饲料，其特征在于，还包括苜蓿青贮饲料；

优选的，苜蓿青贮饲料为紫花苜蓿青贮饲料。

7.一种青贮饲料的制备方法，其特征在于，包括：将青贮原料与权利要求1-3任一项所述的植物乳植杆菌EL6混合发酵，得到所述的青贮饲料。

8.根据权利要求7所述的青贮饲料的制备方法，其特征在于，所述的植物乳植杆菌EL6与青贮原料的质量比≥1.0×10⁶CFU/g。

9.根据权利要求7或8所述的青贮饲料的制备方法，其特征在于，所述的青贮原料为紫花苜蓿。

10.一种权利要求1-3任一项所述的植物乳植杆菌EL6在制备青贮饲料中的应用。