JP6886142B2 - 腸内細菌叢改善剤及びその使用 - Google Patents
腸内細菌叢改善剤及びその使用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6886142B2 JP6886142B2 JP2017000245A JP2017000245A JP6886142B2 JP 6886142 B2 JP6886142 B2 JP 6886142B2 JP 2017000245 A JP2017000245 A JP 2017000245A JP 2017000245 A JP2017000245 A JP 2017000245A JP 6886142 B2 JP6886142 B2 JP 6886142B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- growth
- bacteria
- galactosyl
- intestinal
- bifidobacteria
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
- A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
- A23L33/125—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives containing carbohydrate syrups; containing sugars; containing sugar alcohols; containing starch hydrolysates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7016—Disaccharides, e.g. lactose, lactulose
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Virology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
本発明は、腸内細菌叢改善剤、腸内細菌叢改善用の医薬組成物、飲食品、ビフィズス菌の増殖促進方法、及びクロストリジウム・ディフィシルの増殖抑制方法に関する。
腸内常在菌叢のバランスの崩壊により様々な疾病が発生すること、又は様々な疾病に特徴的な腸内常在菌叢が報告されてきており、腸内細菌叢制御の重要性への認識が近年高まってきている。
例えば、偽膜性腸炎患者の腸管内ではクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ；Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）が異常増殖し、ディフィシル毒素を盛んに放出して炎症を誘発している。偽膜性腸炎は近年増加している疾患であるが、抗生剤が効果を示さないケースも多く、健常成人の糞便をカテーテル経由で十二指腸に注入する糞便移植が最も効果的な治療法である。
例えば、偽膜性腸炎患者の腸管内ではクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ；Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）が異常増殖し、ディフィシル毒素を盛んに放出して炎症を誘発している。偽膜性腸炎は近年増加している疾患であるが、抗生剤が効果を示さないケースも多く、健常成人の糞便をカテーテル経由で十二指腸に注入する糞便移植が最も効果的な治療法である。
また、従来の腸内細菌叢制御する方法としては、プロバイオティクス及びプレバイオティクスが挙げられる。プロバイオティクスは、腸内細菌叢のバランスを改善し、体に良い作用をもたらす生きた細菌を示す。一方、プレバイオティクスは、宿主による消化に対する耐性をもつこと、及びプロバイオティクス細菌の資化性の条件を満たす摂食可能な化合物を示す。
現在までに、オリゴ糖（例えば、ガラクトオリゴ糖、フラクトオリゴ糖、大豆オリゴ糖、乳果オリゴ糖、キシロオリゴ糖、イソマルオリゴ糖、ラフィノース、ラクチュロース、コーヒー豆マンノオリゴ糖、グルコン酸等）や食物繊維の一部（例えば、ポリデキストロース、イヌリン等）がプレバイオティクスとしての要件を満たす食品成分として認められている。プレバイオティクスの摂取により、乳酸菌及びビフィズス菌増殖促進作用、整腸作用、ミネラル吸収促進作用、炎症性腸疾患への予防及び改善作用、等の人の健康に有益な効果が報告されている。例えば、マンノオリゴ糖は、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）菌とラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）菌の両者を増殖させることが報告されている（例えば、特許文献１参照。）。
従来の偽膜性腸炎の治療において、素性の明らかでない常在菌が殆どを占める糞便の移植に伴って肥満となった例が報告される他、心理的抵抗の存在などの問題も多く、腸内細菌叢の制御法としては大きな改善の余地があった。
また、従来のプレバイオティクスでは、腸内常在菌による資化については考慮されておらず、多くの腸内常在菌に対して増殖促進効果を示していた。すなわち、従来のプレバイオティクスでは、ヒト腸管内で他の常在菌に資化されることで、プロバイオティクス細菌を特異的に増殖させ効率的に腸内細菌叢を改善することが困難な状況であった。
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、プロバイオティクス細菌を特異的に増殖可能な腸内細菌叢改善剤、及び腸内細菌叢改善用の医薬組成物を提供する。また、効率的なビフィズス菌の増殖促進方法及びクロストリジウム・ディフィシルの増殖抑制方法を提供する。
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ガラクトシル−β−１，４−ラムノース又はその類縁体がプロバイオティクス細菌を特異的に増殖し、さらに該プロバイオティクス細菌の増殖に伴い、クロストリジウム・ディフィシルの増殖を抑制させることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
［１］ガラクトシル−β−１，４−ラムノースを有効成分として含有することを特徴とする腸内細菌叢改善剤。
［２］［１］に記載の腸内細菌叢改善剤、並びに薬学的に許容できる担体及び希釈剤のうち少なくともいずれかを含むことを特徴とする腸内細菌叢改善用の医薬組成物。
［３］［１］に記載の腸内細菌叢改善剤を含むことを特徴とする腸内細菌叢改善用の飲食品。
［４］ヒト以外の哺乳動物において、日和見菌及び悪玉菌の増殖を促進させず、ビフィズス菌を特異的に増殖促進させるための、ガラクトシル−β−１，４−ラムノースの使用。
［５］前記ビフィズス菌がビフィドバクテリウム・インファンティスである［４］に記載の使用。
［６］クロストリジウム・ディフィシルを保菌するヒト以外の被検体にガラクトシル−β−１，４−ラムノースを投与し、日和見菌及び悪玉菌の増殖を促進させず、ビフィズス菌を特異的に増殖促進させる、クロストリジウム・ディフィシルの増殖抑制方法。
［１］ガラクトシル−β−１，４−ラムノースを有効成分として含有することを特徴とする腸内細菌叢改善剤。
［２］［１］に記載の腸内細菌叢改善剤、並びに薬学的に許容できる担体及び希釈剤のうち少なくともいずれかを含むことを特徴とする腸内細菌叢改善用の医薬組成物。
［３］［１］に記載の腸内細菌叢改善剤を含むことを特徴とする腸内細菌叢改善用の飲食品。
［４］ヒト以外の哺乳動物において、日和見菌及び悪玉菌の増殖を促進させず、ビフィズス菌を特異的に増殖促進させるための、ガラクトシル−β−１，４−ラムノースの使用。
［５］前記ビフィズス菌がビフィドバクテリウム・インファンティスである［４］に記載の使用。
［６］クロストリジウム・ディフィシルを保菌するヒト以外の被検体にガラクトシル−β−１，４−ラムノースを投与し、日和見菌及び悪玉菌の増殖を促進させず、ビフィズス菌を特異的に増殖促進させる、クロストリジウム・ディフィシルの増殖抑制方法。
本発明によれば、プロバイオティクス細菌を特異的に増殖可能な腸内細菌叢改善剤、及び腸内細菌叢改善用の医薬組成物を提供することができる。また、本発明によれば、効率的なビフィズス菌の増殖促進方法及びクロストリジウム・ディフィシルの増殖抑制方法を提供することができる。
≪腸内細菌叢改善剤≫
一実施形態において、本発明は、ガラクトシル−β−１，４−ラムノース若しくはその類縁体、又はそれらの薬学的に許容できる塩（以下、「ガラクトシル−β−１，４−ラムノース類」と称する場合がある。）を有効成分として含有する腸内細菌叢改善剤を提供する。
一実施形態において、本発明は、ガラクトシル−β−１，４−ラムノース若しくはその類縁体、又はそれらの薬学的に許容できる塩（以下、「ガラクトシル−β−１，４−ラムノース類」と称する場合がある。）を有効成分として含有する腸内細菌叢改善剤を提供する。
本実施形態の腸内細菌叢改善剤は、ガラクトシル−β−１，４−ラムノース類を含有し、該ガラクトシル−β−１，４−ラムノース類は、腸内常在菌及び悪玉菌には資化されず、プロバイオティクス細菌によってのみ資化される。すなわち、本実施形態の腸内細菌叢改善剤は、腸内常在菌及び悪玉菌に対して増殖促進効果を有さず、プロバイオティクス細菌のみを特異的に増殖させることができるため、腸内細菌叢を効果的に改善させることができる。さらに、プロバイオティクス細菌の増殖に伴い、クロストリジウム・ディフィシルの増殖及びディフィシル毒素の産生を抑制できるため、効果的に偽膜性腸炎の予防又は治療することができる。
なお、一般に、「腸内細菌叢」とは、腸内に常在する多種多様な細菌群を意味し、腸内細菌叢にはヒト一人当たり１５０種以上、重量にして１ｋｇ以上、細胞数にしてヒト細胞数を上回る数の細菌が含まれる。腸内細菌叢を構成する腸内常在菌の機能はその多くが不明であるが、免疫賦活能、短鎖脂肪酸生産能、整腸作用などを持つことが古くから知られている。ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌（乳酸菌）、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌（ビフィズス菌）等は善玉菌としてとらえられており、プロバイオティクスとして食品中に添加されているものも多い。
これに対して腸内に存在する悪玉菌としては、例えば、ウェルシュ菌、ブドウ球菌、有毒株である大腸菌（例えば、腸管病原性大腸菌、腸管侵入性大腸菌、毒素原性大腸菌、腸管出血性大腸菌（例えば、Ｏ１、Ｏ１８、Ｏ２６、Ｏ１１１、Ｏ１２８、Ｏ１５７等）の腸管内病原性大腸菌等）、クロストリジウム・ディフィシル等が挙げられる。これらの細菌が異常増殖し、腸内細菌叢のバランスが破綻した場合に、様々な疾病が発生する。
さらに、腸内細菌叢の多くを占める常在菌（日和見菌とも呼ばれる）、すなわち、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）属細菌や、非病原性のクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌はその宿主へ及ぼす影響が不明であり、腸内において豊富とは言えない栄養源を善玉菌と奪い合う競争関係にあることから、善玉菌の増殖には負の効果を持つと考えられる。
本明細書における「腸内細菌叢改善」とは、悪玉菌、日和見菌を増殖させず、善玉菌を特異的に増殖させることで、善玉菌優勢の腸内細菌叢を実現することを意味する。これにより悪玉菌の宿主への悪影響を抑制することで、疾病の改善及び健康増進が期待される。
これに対して腸内に存在する悪玉菌としては、例えば、ウェルシュ菌、ブドウ球菌、有毒株である大腸菌（例えば、腸管病原性大腸菌、腸管侵入性大腸菌、毒素原性大腸菌、腸管出血性大腸菌（例えば、Ｏ１、Ｏ１８、Ｏ２６、Ｏ１１１、Ｏ１２８、Ｏ１５７等）の腸管内病原性大腸菌等）、クロストリジウム・ディフィシル等が挙げられる。これらの細菌が異常増殖し、腸内細菌叢のバランスが破綻した場合に、様々な疾病が発生する。
さらに、腸内細菌叢の多くを占める常在菌（日和見菌とも呼ばれる）、すなわち、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）属細菌や、非病原性のクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌はその宿主へ及ぼす影響が不明であり、腸内において豊富とは言えない栄養源を善玉菌と奪い合う競争関係にあることから、善玉菌の増殖には負の効果を持つと考えられる。
本明細書における「腸内細菌叢改善」とは、悪玉菌、日和見菌を増殖させず、善玉菌を特異的に増殖させることで、善玉菌優勢の腸内細菌叢を実現することを意味する。これにより悪玉菌の宿主への悪影響を抑制することで、疾病の改善及び健康増進が期待される。
一般に、「プレバイオティクス」とは、宿主による消化に対する耐性をもつこと、及びプロバイオティクス細菌の資化性の条件を満たす摂食可能な化合物であり、腸におけるプロバイオティクス細菌の増殖を促進するものであると考えられている。
また、「プロバイオティクス」とは、微生物細胞の調製物（例えば、生存している微生物細胞等）又は微生物細胞の成分であり、有効量で投与される際に対象の健康又は健康状態（ｗｅｌｌ−ｂｅｉｎｇ）への有益な作用を提供することができるものを意味する。
本明細書における「プロバイオティクス」は、非病原性のものを示す。プロバイオティクスの健康上の利点は、消化管におけるヒト又は非ヒト動物の微生物叢の均衡の改善、及び／又は正常な微生物叢の回復に関連する点が挙げられる。
また、「プロバイオティクス」とは、微生物細胞の調製物（例えば、生存している微生物細胞等）又は微生物細胞の成分であり、有効量で投与される際に対象の健康又は健康状態（ｗｅｌｌ−ｂｅｉｎｇ）への有益な作用を提供することができるものを意味する。
本明細書における「プロバイオティクス」は、非病原性のものを示す。プロバイオティクスの健康上の利点は、消化管におけるヒト又は非ヒト動物の微生物叢の均衡の改善、及び／又は正常な微生物叢の回復に関連する点が挙げられる。
＜ガラクトシル−β−１，４−ラムノース＞
ガラクトシル−β−１，４−ラムノースは、Ｌ−ラムノースの４位水酸基にβ−Ｄ−ガラクトピラノースがグリコシド結合した構造の二糖である （ＣＡＳ番号：５２４８２−６８‐５） 。
ガラクトシル−β−１，４−ラムノースは、Ｌ−ラムノースの４位水酸基にβ−Ｄ−ガラクトピラノースがグリコシド結合した構造の二糖である （ＣＡＳ番号：５２４８２−６８‐５） 。
本明細書において、「ガラクトシル−β−１，４−ラムノース」の類縁体とは、ガラクトシル−β−１，４−ラムノースと分子生物学的な性質（プロバイオティクス細菌のみを特異的に増殖させる性質）及び構造が類似しているが、化合物中の一部の原子又は官能基が他の原子又は官能基に置換された化合物を意味する。具体的には、例えば、ガラクトシル−β−１，４−ラムノース中に存在する水素原子がハロゲン原子に置換された化合物、水酸基のうち少なくとも一つがアルコキシ基に置換された化合物等が挙げられる。前記ハロゲン原子としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。また、前記アルコシキ基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ブトキシ基等が挙げられる。
また、本実施形態の腸内細菌叢改善剤は、ガラクトシル−β−１，４−ラムノース又はその類縁体の薬学的に許容できる塩を含んでいてもよい。
本明細書において、「薬学的に許容できる」とは、被検動物に適切に投与された場合に、概して、副作用を起こさない程度を意味する。
塩としては、薬学的に許容できる酸付加塩又は塩基性塩が好ましい。
酸付加塩としては、例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸等の無機酸との塩；酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸等の有機酸との塩等が挙げられる。
塩基性塩としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化マグネシウム等の無機塩基との塩；カフェイン、ピペリジン、トリメチルアミン、ピリジン等の有機塩基との塩等が挙げられる。
酸付加塩としては、例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸等の無機酸との塩；酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸等の有機酸との塩等が挙げられる。
塩基性塩としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化マグネシウム等の無機塩基との塩；カフェイン、ピペリジン、トリメチルアミン、ピリジン等の有機塩基との塩等が挙げられる。
本実施形態の腸内細菌叢改善剤は、他の成分として、例えば、ＰＢＳ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等の緩衝液、アジ化ナトリウム、グリセロール等の添加剤を含んでいてもよい。
本実施形態の腸内細菌叢改善剤を用いて、腸内細菌叢を改善するための予防又は治療方法を提供することができる。
治療対象としては、特別な限定はなく、例えば、ヒト又はヒト以外の哺乳動物（例えば、サル、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、イヌ、ウマ、ウシ等）が挙げられ、中でも、ヒトが好ましい。
治療対象としては、特別な限定はなく、例えば、ヒト又はヒト以外の哺乳動物（例えば、サル、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、イヌ、ウマ、ウシ等）が挙げられ、中でも、ヒトが好ましい。
＜ガラクトシル−β−１，４−ラムノースの製造方法＞
ガラクトシル−β−１，４−ラムノースは、植物の細胞壁に存在する多糖であるラムノガラクツロナンＩ（ペクチンの一種）、又は乳酸菌等の微生物の菌体外多糖の構成要素として存在するが、植物又は乳酸菌等の微生物から大量に抽出及び分離することが難しかった。
しかしながら、本発明者らによって開発された、スクロースとＬ−ラムノースを原料とし、４種の酵素を組み合わせた複合酵素反応によりガラクトシル−β−１，４−ラムノースを大量に合成し得ることができる（参考文献：Nakajima M., et al., “Practical Preparation of D-Galactosyl-β1→4-Lrhamnose Employing the Combined Action of Phosphorylases”, Biosci. Biotechnol. Biochem., vol.74, no.8, p1652-1655, 2010.）。
具体的には、まずスクロースをスクロースホスホリラーゼ（第１の酵素）により加リン酸分解し、フラクトース及びグルコース１リン酸に分解する（第１の酵素反応）。次いで、得られたαグルコース１リン酸及びＵＤＰ−ガラクトースをＵＤＰ−グルコース−ヘキソース１リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（第２の酵素）の転移反応により、αガラクトース１リン酸及びＵＤＰ−グルコースに変換する（第２の酵素反応）。また、得られたＵＤＰ−グルコースはＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼ（第３の酵素）によりＵＤＰ−ガラクトースに変換させて（第３の酵素反応）、前記第２の酵素反応に再利用することができる。次いで、得られたガラクトース１リン酸及びＬ−ラムノースをガラクトシル−β−１，４−ラムノースホスホリラーゼ（第４の酵素）によりガラクトシル−β−１，４−ラムノースを製造することができる（第４の酵素反応）。４種の酵素反応を同じ反応液中で同時に行うと、触媒量のリン酸およびＵＤＰ−グルコース存在下にスクロース及びＬ−ラムノースを原料としてガラクトシル−β−１，４−ラムノースを生成させることができる。
ガラクトシル−β−１，４−ラムノースは、植物の細胞壁に存在する多糖であるラムノガラクツロナンＩ（ペクチンの一種）、又は乳酸菌等の微生物の菌体外多糖の構成要素として存在するが、植物又は乳酸菌等の微生物から大量に抽出及び分離することが難しかった。
しかしながら、本発明者らによって開発された、スクロースとＬ−ラムノースを原料とし、４種の酵素を組み合わせた複合酵素反応によりガラクトシル−β−１，４−ラムノースを大量に合成し得ることができる（参考文献：Nakajima M., et al., “Practical Preparation of D-Galactosyl-β1→4-Lrhamnose Employing the Combined Action of Phosphorylases”, Biosci. Biotechnol. Biochem., vol.74, no.8, p1652-1655, 2010.）。
具体的には、まずスクロースをスクロースホスホリラーゼ（第１の酵素）により加リン酸分解し、フラクトース及びグルコース１リン酸に分解する（第１の酵素反応）。次いで、得られたαグルコース１リン酸及びＵＤＰ−ガラクトースをＵＤＰ−グルコース−ヘキソース１リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（第２の酵素）の転移反応により、αガラクトース１リン酸及びＵＤＰ−グルコースに変換する（第２の酵素反応）。また、得られたＵＤＰ−グルコースはＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼ（第３の酵素）によりＵＤＰ−ガラクトースに変換させて（第３の酵素反応）、前記第２の酵素反応に再利用することができる。次いで、得られたガラクトース１リン酸及びＬ−ラムノースをガラクトシル−β−１，４−ラムノースホスホリラーゼ（第４の酵素）によりガラクトシル−β−１，４−ラムノースを製造することができる（第４の酵素反応）。４種の酵素反応を同じ反応液中で同時に行うと、触媒量のリン酸およびＵＤＰ−グルコース存在下にスクロース及びＬ−ラムノースを原料としてガラクトシル−β−１，４−ラムノースを生成させることができる。
得られたガラクトシル−β−１，４−ラムノースは、公知の手法によって、必要に応じて後処理を行い、ガラクトシル−β−１，４−ラムノースを取り出せばよい。すなわち、適宜必要に応じて、酵母等の微生物による処理、ろ過、洗浄、抽出、ｐＨ調整、脱水、濃縮等の後処理操作をいずれか単独で、又は２種以上組み合わせて行い、濃縮、結晶化、再沈殿、カラムクロマトグラフィー等により、ガラクトシル−β−１，４−ラムノースを取り出せばよい。また、取り出したガラクトシル−β−１，４−ラムノースは、さらに必要に応じて、結晶化、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、抽出、溶媒による結晶の撹拌洗浄等の操作をいずれか単独で、又は２種以上組み合わせて１回以上行うことで、精製してもよい。
ガラクトシル−β−１，４−ラムノースは、例えば、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法、質量分析法（ＭＳ）、赤外分光法（ＩＲ）等、公知の手法で構造を確認できる。
＜用途＞
本実施形態の腸内細菌叢改善剤は、例えば、後述に記載のとおり、腸内細菌叢改善用の医薬組成物、飲食品等に用いることができる。また、本実施形態の腸内細菌叢改善剤は、例えば、培地、又は培養用製剤等に用いることができる。本実施形態の腸内細菌叢改善剤を含む培養用製剤を培地に添加する、又は本実施形態の腸内細菌叢改善剤を含む培地を用いてプロバイオティクス細菌（好ましくは、ビフィズス菌）を培養することにより、効果的にプロバイオティクス細菌の増殖を促進することができる。
本実施形態の腸内細菌叢改善剤は、例えば、後述に記載のとおり、腸内細菌叢改善用の医薬組成物、飲食品等に用いることができる。また、本実施形態の腸内細菌叢改善剤は、例えば、培地、又は培養用製剤等に用いることができる。本実施形態の腸内細菌叢改善剤を含む培養用製剤を培地に添加する、又は本実施形態の腸内細菌叢改善剤を含む培地を用いてプロバイオティクス細菌（好ましくは、ビフィズス菌）を培養することにより、効果的にプロバイオティクス細菌の増殖を促進することができる。
≪腸内細菌叢改善用の医薬組成物≫
一実施形態において、本発明は、上述の腸内細菌叢改善剤、並びに薬学的に許容できる担体及び希釈剤のうち少なくともいずれかを含む腸内細菌叢改善用の医薬組成物を提供する。
一実施形態において、本発明は、上述の腸内細菌叢改善剤、並びに薬学的に許容できる担体及び希釈剤のうち少なくともいずれかを含む腸内細菌叢改善用の医薬組成物を提供する。
本実施形態の医薬組成物によれば、効果的に腸内細菌叢を改善し、腸内細菌叢に関連する疾患の予防又は治療を行うことができる。
例えば、腸内細菌叢において、抗生物質を長期間投与することで、該抗生物質に感受性を有する細菌は、減少し、一方で、抗生物質に耐性を有するクロストリジウム・ディフィシルは腸内で異常に増殖する。このクロストリジウム・ディフィシルは毒素を産生し、腸管内の炎症を誘発する。この疾病は「偽膜性腸炎」（又は、「クロストリジウム・ディフィシル誘発性腸炎」）と呼ばれている。
従来の偽膜性腸炎の治療方法としては、例えば、クロストリジウム・ディフィシルに有効な抗生物質（例えば、バンコマイシン、メトロニダゾール等）の投与、又はカテーテル経由で十二指腸に注入する糞便移植等が挙げられる。バンコマイシンの投与では、バンコマイシン耐性菌株の出現の可能性があり、またメトロニダゾール投与では、嘔気、金属味、神経症状等の副作用が生じる虞がある。また、糞便移植では、素性の明らかでない常在菌が殆どを占める糞便の移植に伴い、肥満となった例が報告される他、心理的抵抗の存在などの問題が多い。
これに対し、本実施形態の医薬組成物によれば、後述の実施例に示すとおり、善玉菌（特に、ビフィズス菌）の増殖を促進することで、クロストリジウム・ディフィシルの増殖を抑制し、さらに、クロストリジウム・ディフィシルの毒素の産生を抑制することができるため、偽膜性腸炎を効果的に予防又は治療することができる。
従来の偽膜性腸炎の治療方法としては、例えば、クロストリジウム・ディフィシルに有効な抗生物質（例えば、バンコマイシン、メトロニダゾール等）の投与、又はカテーテル経由で十二指腸に注入する糞便移植等が挙げられる。バンコマイシンの投与では、バンコマイシン耐性菌株の出現の可能性があり、またメトロニダゾール投与では、嘔気、金属味、神経症状等の副作用が生じる虞がある。また、糞便移植では、素性の明らかでない常在菌が殆どを占める糞便の移植に伴い、肥満となった例が報告される他、心理的抵抗の存在などの問題が多い。
これに対し、本実施形態の医薬組成物によれば、後述の実施例に示すとおり、善玉菌（特に、ビフィズス菌）の増殖を促進することで、クロストリジウム・ディフィシルの増殖を抑制し、さらに、クロストリジウム・ディフィシルの毒素の産生を抑制することができるため、偽膜性腸炎を効果的に予防又は治療することができる。
また、例えば、腸内細菌叢のうち、一部の悪玉菌は変異原物質や発癌性物質を生成又は活性化することで、発癌を促進する場合があり、一方、一部の善玉菌はそれらの物質を分化、不活性化、又は吸着等により除去する働きにより、癌の予防に役立つことが知られている。
また、例えば、腸内細菌叢が肥満やメタボリックシンドロームに深く関与していることを示す研究も報告されている。例えば、肥満とそうではなない組み合わせの一卵性双生児の腸内細菌叢を、細菌の有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列によって解析及び比較した研究では、肥満によって腸内細菌叢の多様性が減少していることが明らかとなっている。
また、例えば、腸内細菌叢は非消化性食餌成分を分解してエネルギー回収を向上させるという腸管における働きだけでなく、エンドトキシンによる全身の軽度な慢性炎症や各種のホルモンの分泌に対する影響を介して、肥満や糖尿病の発生に影響を与えていると考えられている。
また、例えば、最近の研究では、腸内細菌叢が自閉症やうつ等の精神疾患やストレスに対する応答、情動行動や学習等の脳機能に関連する現象にまで関わっていることを示唆する報告もされている。
よって、腸内細菌叢に関連する疾患としては、例えば、偽膜性腸炎；十二指腸癌、小腸癌、大腸癌（例えば、盲腸癌、結腸癌、直腸癌等）等の癌；肥満（特に、内臓脂肪型肥満）、高血圧症、脂質代謝異常症、糖尿病等のメタボリックシンドローム；自閉症、うつ病等の神経疾患等が挙げられる。中でも、本実施形態の医薬組成物は偽膜性腸炎の予防又は治療に用いられることが好ましい。
＜投与量・投与方法＞
本実施形態の医薬組成物は、被検動物（ヒト又は非ヒト動物を含む各種哺乳動物、好ましくはヒト）の年齢、性別、体重、症状、治療方法、投与方法、処理時間等を勘案して適宜調節される。
本実施形態の医薬組成物に含まれるガラクトシル−β−１，４−ラムノース類の投与量は、症状又は適用する疾患に応じて適宜調整すればよく、例えば、経口投与の場合、一般の成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり５００ｍｇ以上１５ｇ以下であればよく、１ｇ以上１０ｇ以下であることが好ましい。
本実施形態の医薬組成物は、被検動物（ヒト又は非ヒト動物を含む各種哺乳動物、好ましくはヒト）の年齢、性別、体重、症状、治療方法、投与方法、処理時間等を勘案して適宜調節される。
本実施形態の医薬組成物に含まれるガラクトシル−β−１，４−ラムノース類の投与量は、症状又は適用する疾患に応じて適宜調整すればよく、例えば、経口投与の場合、一般の成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり５００ｍｇ以上１５ｇ以下であればよく、１ｇ以上１０ｇ以下であることが好ましい。
投与回数としては、１週間平均当たり、１回〜数回投与することが好ましい。
投与形態としては、例えば、経腸的、または経口的に当業者に公知の方法が挙げられ、経口的投与が好ましい。
投与形態としては、例えば、経腸的、または経口的に当業者に公知の方法が挙げられ、経口的投与が好ましい。
＜組成成分＞
本実施形態の医薬組成物は、ガラクトシル−β−１，４−ラムノース類の他に、薬学的に許容されうる担体又は希釈剤を含んでいてもよい。
薬学的に許容されうる担体又は希釈剤は、賦形剤、稀釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味料、粘稠剤、矯味剤、溶解補助剤、添加剤等が挙げられる。これら担体の１種以上を用いることにより、液剤、カプセル剤、懸濁剤、乳剤、又はシロップ剤等の形態の医薬組成物を調製することができる。
また、担体としてコロイド分散系を用いることもできる。コロイド分散系は、ガラクトシル−β−１，４−ラムノース類の生体内安定性を高める効果や、特定の臓器、組織、又は細胞へ、ガラクトシル−β−１，４−ラムノース類の移行性を高める効果が期待される。コロイド分散系としては、ポリエチレングリコール、高分子複合体、高分子凝集体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、水中油系の乳化剤、ミセル、混合ミセル、リポソームを包含する脂質を挙げることができ、腸内へ、有効成分を効率的に輸送する効果のある、リポソームや人工膜の小胞が好ましい。
本実施形態の医薬組成物は、ガラクトシル−β−１，４−ラムノース類の他に、薬学的に許容されうる担体又は希釈剤を含んでいてもよい。
薬学的に許容されうる担体又は希釈剤は、賦形剤、稀釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味料、粘稠剤、矯味剤、溶解補助剤、添加剤等が挙げられる。これら担体の１種以上を用いることにより、液剤、カプセル剤、懸濁剤、乳剤、又はシロップ剤等の形態の医薬組成物を調製することができる。
また、担体としてコロイド分散系を用いることもできる。コロイド分散系は、ガラクトシル−β−１，４−ラムノース類の生体内安定性を高める効果や、特定の臓器、組織、又は細胞へ、ガラクトシル−β−１，４−ラムノース類の移行性を高める効果が期待される。コロイド分散系としては、ポリエチレングリコール、高分子複合体、高分子凝集体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、水中油系の乳化剤、ミセル、混合ミセル、リポソームを包含する脂質を挙げることができ、腸内へ、有効成分を効率的に輸送する効果のある、リポソームや人工膜の小胞が好ましい。
本実施形態の医薬組成物における製剤化の例としては、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤として経口的に使用されるものが挙げられる。
さらには、薬理学上許容される担体又は希釈剤、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤等と適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化されたものが挙げられる。
さらには、薬理学上許容される担体又は希釈剤、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤等と適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化されたものが挙げられる。
錠剤、カプセル剤に混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸のような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖、又はサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油、又はチェリーのような香味剤が用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記の材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。
本実施形態の医薬組成物は、単独で用いてもよく、その他の腸内細菌叢改善用の医薬組成物と組み合わせて用いてもよい。その他の腸内細菌叢改善用の医薬組成物としては、例えば、ビフィズス菌製剤、酪酸菌製剤、ラクトミン製剤、耐性乳酸菌製剤等の善玉菌を有効成分として含有する整腸剤；ペプシン、パンクレアチン等を有効成分として含有する動物性消化酵素剤、ジアスターゼ等を有効成分として含有する植物性消化酵素剤等の消化酵素剤を有効成分として含有する整腸剤等が挙げられる。
＜治療方法＞
本発明の一側面は、腸内細菌叢改善のための上述の腸内細菌叢改善剤を含む医薬組成物を提供する。
また、本発明の一側面は、治療的に有効量の上述の腸内細菌叢改善剤、並びに薬学的に許容されうる担体又は希釈剤を含む医薬組成物を提供する。
また、本発明の一側面は、前記医薬組成物を含む、腸内細菌叢改善剤を提供する。
また、本発明の一側面は、腸内細菌叢改善用の治療剤を製造するための腸内細菌叢改善剤の使用を提供する。
また、本発明の一側面は、上述の腸内細菌叢改善剤の有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む、腸内細菌叢改善のための治療方法を提供する。
本発明の一側面は、腸内細菌叢改善のための上述の腸内細菌叢改善剤を含む医薬組成物を提供する。
また、本発明の一側面は、治療的に有効量の上述の腸内細菌叢改善剤、並びに薬学的に許容されうる担体又は希釈剤を含む医薬組成物を提供する。
また、本発明の一側面は、前記医薬組成物を含む、腸内細菌叢改善剤を提供する。
また、本発明の一側面は、腸内細菌叢改善用の治療剤を製造するための腸内細菌叢改善剤の使用を提供する。
また、本発明の一側面は、上述の腸内細菌叢改善剤の有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む、腸内細菌叢改善のための治療方法を提供する。
≪飲食品≫
一実施形態において、本発明は、上述の腸内細菌叢改善剤を含む飲食品を提供する。
一実施形態において、本発明は、上述の腸内細菌叢改善剤を含む飲食品を提供する。
本実施形態の飲食品によれば、効果的に腸内細菌叢を改善することができる。また、ガラクトシル−β−１，４−ラムノースは二糖であり被検体（好ましくは、ヒト）に吸収されず、安全性の面からも毎日摂取することに問題が少ないと考えられ、安全でかつ腸内細菌叢の改善に有効な飲食品を提供することができる。
なお、本明細書において、「飲食品」とは、食品と飲料を合わせたものであり、主に加工食品を意味する。また、本実施形態の飲食品は、健康食品（特定保健用食品を含む）、機能性食品、健康飲料、機能性飲料を含む。
上述の腸内細菌叢改善剤を含む飲食品の形態は、固形状であっても液状であってもよく、上述の腸内細菌叢改善剤は広く食品一般に食品添加物として添加して用いることができる。
飲食品の種類としては、具体的には、清涼飲料（例えば、ミネラルウォーター、炭酸飲料、栄養飲料、スポーツドリンク、ココア飲料、果実飲料、乳飲料（乳児用調製粉乳、乳幼児用液体ミルクを含む。）、コーヒー飲料、茶系飲料、豆乳飲料、野菜飲料、アルコールテイスト飲料（例えば、ノンアルコールビール、ノンアルコールワイン等））、アルコール飲料（例えば、ビール、発泡酒、カクテル、チューハイ、焼酎、日本酒、ウィスキー、ブランデー、ワイン等）等の飲料（これらの飲料の濃縮原液及び調整用粉末を含む）；アイスクリーム、アイスシャーベット、かき氷等の冷菓；そば、うどん、スパゲッティ、はるさめ、ぎょうざの皮、しゅうまいの皮、中華麺、即席麺等の麺類；飴、チューインガム、キャンディー、グミ、ガム、キャラメル、チョコレート、錠菓、スナック菓子、ビスケット等の焼き菓子、ゼリー、ジャム、クリーム等の菓子類；かまぼこ、ハンバーグ、ハム、ソーセージ等の水産又は畜産加工食品；加工乳、発酵乳、ヨーグルト、バター、チーズ等の乳製品；サラダ油、てんぷら油、マーガリン、マヨネーズ、ショートニング、ホイップクリーム、ドレッシング等の油脂及び油脂加工食品；ソース、たれ等の調味料；スープ、シチュー、カレー、パン、ジャム、サラダ、惣菜、漬物等が挙げられ、これらに限定はされない。
飲食品の種類としては、具体的には、清涼飲料（例えば、ミネラルウォーター、炭酸飲料、栄養飲料、スポーツドリンク、ココア飲料、果実飲料、乳飲料（乳児用調製粉乳、乳幼児用液体ミルクを含む。）、コーヒー飲料、茶系飲料、豆乳飲料、野菜飲料、アルコールテイスト飲料（例えば、ノンアルコールビール、ノンアルコールワイン等））、アルコール飲料（例えば、ビール、発泡酒、カクテル、チューハイ、焼酎、日本酒、ウィスキー、ブランデー、ワイン等）等の飲料（これらの飲料の濃縮原液及び調整用粉末を含む）；アイスクリーム、アイスシャーベット、かき氷等の冷菓；そば、うどん、スパゲッティ、はるさめ、ぎょうざの皮、しゅうまいの皮、中華麺、即席麺等の麺類；飴、チューインガム、キャンディー、グミ、ガム、キャラメル、チョコレート、錠菓、スナック菓子、ビスケット等の焼き菓子、ゼリー、ジャム、クリーム等の菓子類；かまぼこ、ハンバーグ、ハム、ソーセージ等の水産又は畜産加工食品；加工乳、発酵乳、ヨーグルト、バター、チーズ等の乳製品；サラダ油、てんぷら油、マーガリン、マヨネーズ、ショートニング、ホイップクリーム、ドレッシング等の油脂及び油脂加工食品；ソース、たれ等の調味料；スープ、シチュー、カレー、パン、ジャム、サラダ、惣菜、漬物等が挙げられ、これらに限定はされない。
本実施形態の飲食品は、その種類に応じて通常使用される添加剤を適宜配合してもよい。添加剤としては、例えば、砂糖、果糖、異性化液糖、ブドウ糖、アスパルテーム、ステビア等の甘味料、クエン酸、リンゴ酸、酒石酸等の酸味料、デキストリン、澱粉等の賦形剤、結合剤、希釈剤、香料、緩衝剤、増粘剤、ゲル化剤、着色剤、安定剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、防腐剤等が挙げられる。
本実施形態の飲食品におけるガラクトシル−β−１，４−ラムノース類の配合量は、その生理作用や薬理作用が発揮できる量であればよく、上述の≪腸内細菌叢改善用の医薬組成物≫における経口投与での投与量及び対象飲食品の一般的な摂取量を考慮して、通常、成人１日当たりの摂取量が５００ｍｇ以上１５ｇ以下であればよく、１ｇ以上１０ｇ以下であることが好ましい。例えば、固形状食品の場合には０．５〜５０重量％、飲料等の液状食品の場合には０．１〜１０重量％であればよい。
≪ビフィズス菌の増殖促進方法≫
一実施形態において、本発明は、ガラクトシル−β−１，４−ラムノース若しくはその類縁体、又はそれらの薬学的に許容できる塩を投与するビフィズス菌の増殖促進方法を提供する。
一実施形態において、本発明は、ガラクトシル−β−１，４−ラムノース若しくはその類縁体、又はそれらの薬学的に許容できる塩を投与するビフィズス菌の増殖促進方法を提供する。
本実施形態のビフィズス菌の増殖促進方法によれば、効率的かつ効果的にビフィズス菌の増殖を促進することができる。
後述の実施例に示すとおり、ガラクトシル−β−１，４−ラムノースを各種ビフィズス菌に投与することにより、ビフィズス菌の増殖を促進することができたことから、ビフィズス菌の増殖にガラクトシル−β−１，４−ラムノースが有効であることが明らかとなった。
増殖が促進されるビフィズス菌としては、例えば、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ；Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス（Ｂ．ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂ．ｂｒｅｖｅ）、ビフィドバクテリウム・カテヌラータム（Ｂ．ｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ラクティス（Ｂ．ｌａｃｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓ）等が挙げられ、これらに限定されない。
中でも、ビフィズス菌としては、ビフィドバクテリウム・インファンティスが好ましい。ビフィドバクテリウム・インファンティスは乳幼児の腸内に存在するビフィズス菌であるため、例えば、ガラクトシル−β−１，４−ラムノース類を乳幼児用調製粉乳、又は乳幼児用液体ミルクに配合し、乳幼児に投与することで、ビフィドバクテリウム・インファンティスの増殖を効果的に促進することができる。
増殖が促進されるビフィズス菌としては、例えば、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ；Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス（Ｂ．ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂ．ｂｒｅｖｅ）、ビフィドバクテリウム・カテヌラータム（Ｂ．ｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ラクティス（Ｂ．ｌａｃｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓ）等が挙げられ、これらに限定されない。
中でも、ビフィズス菌としては、ビフィドバクテリウム・インファンティスが好ましい。ビフィドバクテリウム・インファンティスは乳幼児の腸内に存在するビフィズス菌であるため、例えば、ガラクトシル−β−１，４−ラムノース類を乳幼児用調製粉乳、又は乳幼児用液体ミルクに配合し、乳幼児に投与することで、ビフィドバクテリウム・インファンティスの増殖を効果的に促進することができる。
本実施形態のビフィズス菌の増殖促進方法において、ガラクトシル−β−１，４−ラムノース類を、上述の各種ビフィズス菌を腸内細菌叢に有する被検体に投与してもよく（インビボ系）、又は上述の各種ビフィズス菌に直接投与してもよい（インビトロ系）。
ガラクトシル−β−１，４−ラムノース類を被検体に投与する場合の投与量としては、上述の≪腸内細菌叢改善用の医薬組成物≫における経口投与での投与量と同様の量が挙げられる。
また、投与回数及び投与形態についても、上述の≪腸内細菌叢改善用の医薬組成物≫に例示されたものと同様のものが挙げられる。
また、投与回数及び投与形態についても、上述の≪腸内細菌叢改善用の医薬組成物≫に例示されたものと同様のものが挙げられる。
なお、被検体としては、哺乳動物であることが好ましい。前記哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ウサギ等のウサギ目、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の有蹄目、イヌ、ネコ等のネコ目、ヒト、サル、アカゲザル、カニクイザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジー等の霊長類等が挙げられ、これらに限定されない。中でも、本実施形態のビフィズス菌の増殖促進方法は、実験又は臨床用途で用いられることから、被検体は、マウス及びヒトが好ましい。
また、ガラクトシル−β−１，４−ラムノース類を培地等に添加し、上述の各種ビフィズス菌の増殖を促進させてもよい。これにより、得られるビフィズス菌は、必要に応じて飲食品、又はビフィズス菌製剤等に加工して、ヒト又は非ヒト動物が直接投与する等、プロバイオティクス用途に好適に用いられる。
ガラクトシル−β−１，４−ラムノース類を培地に添加する場合の投与量（培地に含まれる濃度）としては、０．１ｍｇ／Ｌ以上２０ｍｇ／Ｌ以下であることが好ましく、１ｍｇ／Ｌ以上１０ｍｇ／Ｌ以下であることがより好ましい。
ガラクトシル−β−１，４−ラムノース類の培地に含まれる濃度が上記範囲であることにより、効率的にビフィズス菌の増殖を促進させることができる。
ガラクトシル−β−１，４−ラムノース類の培地に含まれる濃度が上記範囲であることにより、効率的にビフィズス菌の増殖を促進させることができる。
ビフィズス菌の増殖に用いられる培地は、ビフィズス菌の培養に適した組成であればよく、栄養源として利用し得る炭素源、窒素源、ビタミン類、無機塩類等を含有するものであればよい。前記培地としては、例えば、ＴＯＳプロピオン酸寒天培地（ヤクルト薬品工業社製）等が挙げられ、これに限定されない。
また、ビフィズス菌の培養条件としては、嫌気条件下であることが好ましく、例えば、静置培養、振盪培養、又は攪拌培養等により培養を行えばよい。
培養温度は、例えば２０℃以上４０℃以下であればよい。
また、ビフィズス菌の培養条件としては、嫌気条件下であることが好ましく、例えば、静置培養、振盪培養、又は攪拌培養等により培養を行えばよい。
培養温度は、例えば２０℃以上４０℃以下であればよい。
≪クロストリジウム・ディフィシルの増殖抑制方法≫
一実施形態において、本発明は、クロストリジウム・ディフィシルを保菌する被検体にガラクトシル−β−１，４−ラムノース若しくはその類縁体、又はそれらの薬学的に許容できる塩を投与するクロストリジウム・ディフィシルの増殖抑制方法を提供する。
一実施形態において、本発明は、クロストリジウム・ディフィシルを保菌する被検体にガラクトシル−β−１，４−ラムノース若しくはその類縁体、又はそれらの薬学的に許容できる塩を投与するクロストリジウム・ディフィシルの増殖抑制方法を提供する。
本実施形態のクロストリジウム・ディフィシルの増殖抑制方法によれば、クロストリジウム・ディフィシルを保菌する被検体の腸内において、ビフィズス菌等の善玉菌の増殖が促進されることにより、クロストリジウム・ディフィシルの増殖が抑制されて腸内細菌叢のバランスを改善することができる。さらに、クロストリジウム・ディフィシルの毒素の産生を効果的に抑制することができる。
後述の実施例に示すとおり、ガラクトシル−β−１，４−ラムノースを、クロストリジウム・ディフィシルを含む糞便に投与することにより、ビフィズス菌が増殖することで、クロストリジウム・ディフィシルの増殖が抑制され、さらに毒素の産生を抑制できたことから、クロストリジウム・ディフィシルの増殖抑制にガラクトシル−β−１，４−ラムノースが間接的に作用することが明らかとなった。
ガラクトシル−β−１，４−ラムノース類を被検体に投与する場合の投与量としては、上述の≪腸内細菌叢改善用の医薬組成物≫における経口投与での投与量と同様の量が挙げられる。
また、投与回数及び投与形態についても、上述の≪腸内細菌叢改善用の医薬組成物≫に例示されたものと同様のものが挙げられる。
また、投与回数及び投与形態についても、上述の≪腸内細菌叢改善用の医薬組成物≫に例示されたものと同様のものが挙げられる。
クロストリジウム・ディフィシルを保菌する被検体としては、哺乳動物であることが好ましい。前記哺乳動物としては、上述の≪ビフィズス菌の増殖促進方法≫において例示されたものと同様のものが挙げられる。中でも、本実施形態のクロストリジウム・ディフィシルの増殖抑制方法は、実験又は臨床用途で用いられることから、被検体は、マウス及びヒトが好ましい。
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
（１）培地の調製
（１−１）Ｇｉｆｕ Ａｎａｅｒｏｂｉｃ Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＡＭ）（前培養用培地）の調製
ＧＡＭブイヨン（ニッスイ社製）と脱塩水とを混合してスターラーでよく溶かしてから、ＧＡＭブイヨンが５．９（ｗ／ｖ）％になるように脱塩水でメスアップした。次いで、前記５．９（ｗ／ｖ）％のＧＡＭを１ｍＬずつ４ｍＬ容バイアル瓶に分注し、その後１１５℃で１５分間オートクレーブした。蓋は半開きのまま素早く、嫌気条件下のアネロパック角型ジャー（三菱ガス化学社製）に入れ、終夜放置し、前培養用のＧＡＭを調製した。
（１）培地の調製
（１−１）Ｇｉｆｕ Ａｎａｅｒｏｂｉｃ Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＡＭ）（前培養用培地）の調製
ＧＡＭブイヨン（ニッスイ社製）と脱塩水とを混合してスターラーでよく溶かしてから、ＧＡＭブイヨンが５．９（ｗ／ｖ）％になるように脱塩水でメスアップした。次いで、前記５．９（ｗ／ｖ）％のＧＡＭを１ｍＬずつ４ｍＬ容バイアル瓶に分注し、その後１１５℃で１５分間オートクレーブした。蓋は半開きのまま素早く、嫌気条件下のアネロパック角型ジャー（三菱ガス化学社製）に入れ、終夜放置し、前培養用のＧＡＭを調製した。
（１−２）糖除去ＧＡＭの調製
次いで、ＧＡＭ糖分解用半流動培地（ニッスイ社製）２６．２５ｇと、約１００ｍＬの脱塩水とをスターラーバーを入れた２００ｍＬ容ビーカーに加え、脱塩水を２００ｍＬ程度まで加えながら撹拌し、粉末を溶解させた。その後、寒天を除くために、ろ紙を用いてろ過した。この際、ビーカーに残った液を洗いこむようにした。ろ液を脱塩水で４５０ｍＬにメスアップし、耐熱性瓶に入れ、１１５℃で１５分間オートクレーブした。蓋は半開きのまま素早く、嫌気条件下のアネロパック角型ジャーに入れ、終夜放置し、ＧＡＭ糖除去培地を調製した。
次いで、ＧＡＭ糖分解用半流動培地（ニッスイ社製）２６．２５ｇと、約１００ｍＬの脱塩水とをスターラーバーを入れた２００ｍＬ容ビーカーに加え、脱塩水を２００ｍＬ程度まで加えながら撹拌し、粉末を溶解させた。その後、寒天を除くために、ろ紙を用いてろ過した。この際、ビーカーに残った液を洗いこむようにした。ろ液を脱塩水で４５０ｍＬにメスアップし、耐熱性瓶に入れ、１１５℃で１５分間オートクレーブした。蓋は半開きのまま素早く、嫌気条件下のアネロパック角型ジャーに入れ、終夜放置し、ＧＡＭ糖除去培地を調製した。
（１−３）５（ｗ／ｖ）％糖溶液の調製
糖として、ガラクトシル−β−１，４−ラムノース（以下、「Ｇａｌ−β１，４−Ｒｈａ」と称する場合がある。）（公知の文献（参考文献：Nakajima M., et al., “Practical Preparation of D-Galactosyl-β1→4-Lrhamnose Employing the Combined Action of Phosphorylases”, Biosci. Biotechnol. Biochem., vol.74, no.8, p1652-1655, 2010.）を元に製造したものを使用。）、及びラクチュロース（以下、「Ｌａｔ」と称する場合がある。）（和光純薬社製）を用いた。
次いで、耐熱性瓶にＭｉｌｌｉＱ水を入れ、オートクレーブ（１２１度、２０分）した。次いで、オートクレーブ内の温度が９７℃まで下がったら直ちに、アネロパックと共に密閉容器に入れ、終夜放置し、酸素を除去した。次いで、各糖をエッペンチューブに５０ｍｇずつ秤量し、嫌気チャンバー内でオートクレーブしたＭｉｌｌｉＱ水を加え、全量を１ｍＬとした。次いで、ボルテックスミサーで溶解後、新しいエッペンチューブを用意し、０．２２μｍのフィルター（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、カタログ番号：ＳＬＧＶ０３３ＲＳ）と１ｍＬ用シリンジ（テルモ社製、コード番号：ＳＳ−０１Ｔ）とを用いてフィルトレーションし、５（ｗ／ｖ）％の２種類の糖溶液を調製した。
糖として、ガラクトシル−β−１，４−ラムノース（以下、「Ｇａｌ−β１，４−Ｒｈａ」と称する場合がある。）（公知の文献（参考文献：Nakajima M., et al., “Practical Preparation of D-Galactosyl-β1→4-Lrhamnose Employing the Combined Action of Phosphorylases”, Biosci. Biotechnol. Biochem., vol.74, no.8, p1652-1655, 2010.）を元に製造したものを使用。）、及びラクチュロース（以下、「Ｌａｔ」と称する場合がある。）（和光純薬社製）を用いた。
次いで、耐熱性瓶にＭｉｌｌｉＱ水を入れ、オートクレーブ（１２１度、２０分）した。次いで、オートクレーブ内の温度が９７℃まで下がったら直ちに、アネロパックと共に密閉容器に入れ、終夜放置し、酸素を除去した。次いで、各糖をエッペンチューブに５０ｍｇずつ秤量し、嫌気チャンバー内でオートクレーブしたＭｉｌｌｉＱ水を加え、全量を１ｍＬとした。次いで、ボルテックスミサーで溶解後、新しいエッペンチューブを用意し、０．２２μｍのフィルター（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、カタログ番号：ＳＬＧＶ０３３ＲＳ）と１ｍＬ用シリンジ（テルモ社製、コード番号：ＳＳ−０１Ｔ）とを用いてフィルトレーションし、５（ｗ／ｖ）％の２種類の糖溶液を調製した。
（１−４）各種の糖添加培地の調製
嫌気チャンバー（Ｂａｋｅｒ Ｒｕｓｋｉｎｎ社製、ＩｎｖｉｖＯ２）内で（窒素雰囲気下、酸素１%以内）、（１−２）で調製し糖除去ＧＡＭ３６mLに５％糖溶液を各４ｍＬずつ加え、２種類（Ｇａｌ−β１，４−Ｒｈａ、又はＬａｔ含有）の０．５（ｗ／ｖ）％糖添加培地を調製した。
嫌気チャンバー（Ｂａｋｅｒ Ｒｕｓｋｉｎｎ社製、ＩｎｖｉｖＯ２）内で（窒素雰囲気下、酸素１%以内）、（１−２）で調製し糖除去ＧＡＭ３６mLに５％糖溶液を各４ｍＬずつ加え、２種類（Ｇａｌ−β１，４−Ｒｈａ、又はＬａｔ含有）の０．５（ｗ／ｖ）％糖添加培地を調製した。
（２）各種の腸内細菌を用いた選択的増殖促進評価試験
本試験で用いた菌種は以下のとおりである。
・ヒト腸内常在菌最優勢種
Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ
Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ
Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｖｕｌｇａｔｕｓ
Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ
Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｏｖａｔｕｓ
Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃｏｍｅｓ
Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｔｏｒｑｕｅｓ
Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔａｌｉｓ
Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ
Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｅｎｔｒｉｏｓｕｍ
Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｒａｅｕｍ
Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｏｃｃｏｉｄｅｓ
・ガス壊疽菌
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ
・乳酸菌
Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ
Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ
・ビフィズス菌
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ. ｉｎｆａｎｔｉｓ
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｌｏｎｇｕｍ
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｉｓ
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ
本試験で用いた菌種は以下のとおりである。
・ヒト腸内常在菌最優勢種
Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ
Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ
Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｖｕｌｇａｔｕｓ
Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ
Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｏｖａｔｕｓ
Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃｏｍｅｓ
Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｔｏｒｑｕｅｓ
Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔａｌｉｓ
Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ
Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｅｎｔｒｉｏｓｕｍ
Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｒａｅｕｍ
Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｏｃｃｏｉｄｅｓ
・ガス壊疽菌
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ
・乳酸菌
Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ
Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ
・ビフィズス菌
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ. ｉｎｆａｎｔｉｓ
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｌｏｎｇｕｍ
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｉｓ
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ
まず、嫌気チャンバー内で、（１−１）で調製したＧＡＭ（前培養用培地）１ｍＬに滅菌した爪楊枝で上述のグリセロールストックした各種菌体を接種し、アネロパック角型ジャー内の嫌気条件下、３７℃で前培養した。次いで、９６ディープウェルプレートに８連マルチピペットで、（１−４）で調製した各種の糖添加培地、又はＮｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ用として糖の代わりに脱塩水を加えた糖除去ＧＡＭを各５００μＬずつ分注し、ガス透過性のマイクロプレート用シールをして、嫌気条件下のアネロパック角型ジャーに入れ、終夜放置した。９６マイクロプレート（各ウェル２００μＬ容）に、よく懸濁した上記各菌体の前培養液を５０μＬずつ分注し、これをマスタープレートとした。乾熱滅菌したコピープレート９６（Ｔｏｋｋｅｎ ＴＫ−ＣＰ９６）のピンを、マスタープレートの底まで差し込み、次に培地の入った９６ディープウェルプレートの底まで差し込むことで各菌体の接種を行った。９６ディープウェルプレートにガス透過性のマイクロプレート用シールを貼り、アネロパック角型ジャー内の嫌気条件下で培養した。２４時間培養後、培養液を８連マルチピペットにてピペッティングにより菌体を懸濁した後、各培養液５０μＬずつを９６マイクロプレートにサンプリングした。ここまでの操作は全て嫌気チャンバー内で行った。サンプリング液の入ったプレートを嫌気チャンバーから出し、サンプリング液に５％糖溶液の代わりに脱塩水を添加することで調製した糖除去ＧＡＭを１５０μＬずつ加えることで、各培養液を４倍希釈した。混合は８連マルチピペットによるピペッティングで行った。次いで、マイクロプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で６００ｎｍの吸光度（濁度）を測定した。ブランク測定は上述した未接種の糖除去ＧＡＭを用いて行った。また、糖除去ＧＡＭにグルコース添加した培地を用いたＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの培養液の濁度を光路長１ｃｍのキュベットを用いて測定し、マイクロプレートでの測定値を光路長１ｃｍのキュベットでの値に換算できる定数を算出した。この定数をすべての菌種の測定値に適用させて、濁度は光路長１ｃｍでの値として計算した。次いで、得られた計算値から、各菌体について、増殖促進倍率（＝糖ありの測定値／糖なしの測定値）を計算した。０．５（ｗ／ｖ）％のＧａｌ−β１，４−Ｒｈａを含む培地を用いて培養した結果を図１（Ａ）に、０．５（ｗ／ｖ）％のＬａｔを含む培地を用いて培養した図１（Ｂ）に示す。
図１（Ａ）から、Ｇａｌ−β１，４−Ｒｈａを含む培地による培養では、ヒト腸内常在菌の最優勢種、ガス壊疽菌、及び乳酸菌の増殖促進倍率は１倍前後であるのに対し、ビフィズス菌の増殖促進倍率は２倍以上、特にＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓでは約７倍であり、ビフィズス菌においてのみＧａｌ−β１，４−Ｒｈａが資化されることで選択的に増殖が促進されることが明らかとなった。
また、図１（Ｂ）から、Ｌａｔを含む培地による培養では、ビフィズス菌だけでなく、ヒト腸内常在菌の最優勢種、ガス壊疽菌、及び乳酸菌いずれにおいても、増殖促進倍率が２倍以上となる菌種も存在し、全ての菌においてＬａｔが資化されることで増殖が促進されることが確かめられた。
なお、Ｇａｌ−β１，４−Ｒｈａは、ガラクトースとラムノースとがβ１，４結合した二糖である。一方、Ｌａｔは、ガラクトースとフルクトースとがβ１，４結合した二糖である。上記のように、構造が非常に近しい二糖であっても、結合する単糖の種類が異なることで、腸内細菌における資化性が異なることが示唆された。
以上のことから、Ｇａｌ−β１，４−Ｒｈａは腸内常在菌及び悪玉菌に対して増殖促進効果を有さず、プロバイオティクス細菌のみを特異的に増殖させることができるため、腸内細菌叢を効果的に改善させることができることが示唆された。
また、図１（Ｂ）から、Ｌａｔを含む培地による培養では、ビフィズス菌だけでなく、ヒト腸内常在菌の最優勢種、ガス壊疽菌、及び乳酸菌いずれにおいても、増殖促進倍率が２倍以上となる菌種も存在し、全ての菌においてＬａｔが資化されることで増殖が促進されることが確かめられた。
なお、Ｇａｌ−β１，４−Ｒｈａは、ガラクトースとラムノースとがβ１，４結合した二糖である。一方、Ｌａｔは、ガラクトースとフルクトースとがβ１，４結合した二糖である。上記のように、構造が非常に近しい二糖であっても、結合する単糖の種類が異なることで、腸内細菌における資化性が異なることが示唆された。
以上のことから、Ｇａｌ−β１，４−Ｒｈａは腸内常在菌及び悪玉菌に対して増殖促進効果を有さず、プロバイオティクス細菌のみを特異的に増殖させることができるため、腸内細菌叢を効果的に改善させることができることが示唆された。
［実施例２］
（１）培地の調製
（１−１）Ｇｉｆｕ Ａｎａｅｒｏｂｉｃ Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＡＭ）（前培養用培地）の調製
実施例１の（１−１）と同様の方法を用いて、前培養用のＧＡＭを調製した。
（１）培地の調製
（１−１）Ｇｉｆｕ Ａｎａｅｒｏｂｉｃ Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＡＭ）（前培養用培地）の調製
実施例１の（１−１）と同様の方法を用いて、前培養用のＧＡＭを調製した。
（１−２）糖除去ＧＡＭの調製
実施例１の（１−２）と同様の方法を用いて、ＧＡＭ糖除去培地を調製した。
実施例１の（１−２）と同様の方法を用いて、ＧＡＭ糖除去培地を調製した。
（１−３）５（ｗ／ｖ）％糖溶液の調製
実施例１の（１−３）と同様の方法を用いて、５（ｗ／ｖ）％のＧａｌ−β１，４−Ｒｈａ溶液を調製した。
実施例１の（１−３）と同様の方法を用いて、５（ｗ／ｖ）％のＧａｌ−β１，４−Ｒｈａ溶液を調製した。
（１−４）糖添加培地の調製
実施例１の（１−４）と同様の方法を用いて、１種類（Ｇａｌ−β１，４−Ｒｈａ含有）の０．５（ｗ／ｖ）％糖添加培地を調製した。
実施例１の（１−４）と同様の方法を用いて、１種類（Ｇａｌ−β１，４−Ｒｈａ含有）の０．５（ｗ／ｖ）％糖添加培地を調製した。
（１−５）クロストリジア測定用培地の調製
クロストリジア測定用培地（日水製薬社製、コード番号：０５４０９）１４．０６ｇと２００ｍＬのＥｌｉｘ水とをスターラーバーを入れた５００ｍＬ容三角フラスコに加えた。スターラーで攪拌して溶解後、オートクレーブ（１２１℃、１５分）した。次いで、クリーンベンチ内でシャーレ１０枚に分注した。４０分間乾燥後、アネロパックと共に密閉し、４℃で保存し、クロストリジア測定用培地を調製した。
クロストリジア測定用培地（日水製薬社製、コード番号：０５４０９）１４．０６ｇと２００ｍＬのＥｌｉｘ水とをスターラーバーを入れた５００ｍＬ容三角フラスコに加えた。スターラーで攪拌して溶解後、オートクレーブ（１２１℃、１５分）した。次いで、クリーンベンチ内でシャーレ１０枚に分注した。４０分間乾燥後、アネロパックと共に密閉し、４℃で保存し、クロストリジア測定用培地を調製した。
（２）クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ；Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の生育抑制及びディフィシル毒素の生産抑制試験
（２−１）クロストリジウム・ディフィシル及びビフィドバクテリウム・インファンティスの共培養
まず、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ；Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）及びビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ；Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓ）について、それぞれグリセロールストックからＧＡＭプレートに滅菌した爪楊枝を用いて植菌及び画線し、３７℃嫌気条件下で４８時間以上培養した。次いで、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅは１コロニーを、Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓは１０コロニーを滅菌した爪楊枝を用いてバイアル瓶に入れた２ｍＬＧＡＭに植菌し、３７℃嫌気条件下で２６時間培養し、前培養液を得た。次いで、９６ディープウェルプレートに（１−４）で調製した０．５（ｗ／ｖ）％糖（Ｇａｌ−β１，４−Ｒｈａ）添加培地、又はコントロールとして（１−２）で調製した糖除去ＧＡＭを５００μＬずつ入れた。次いで、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ及びＢ．ｉｎｆａｎｔｉｓの前培養液を、ＧＡＭを用いて任意の倍率に希釈し、ＧＡＭをブランクとして波長６００ｎｍにおける吸光度を測定した。得られた値を用いて前培養液の吸光度がＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅについて０．５、Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓについて０．０５となるように糖除去ＧＡＭを用いて希釈した。次いで、０．５（ｗ／ｖ）％糖（Ｇａｌ−β１，４−Ｒｈａ）添加培地又は糖除去ＧＡＭが分注された９６ディープウェルプレートに、希釈したＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ及びＢ．ｉｎｆａｎｔｉｓの前培養液を１０μＬずつ植菌した（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの初期濁度は０．０１、Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓの初期濁度は０．００１であった）。また、コントロールとして、単菌培養（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのみ）のウェルには、０．５（ｗ／ｖ）％糖（Ｇａｌ−β１，４−Ｒｈａ）添加培地又は糖除去ＧＡＭが分注された９６ディープウェルプレートに、希釈したＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの前培養液を１０μＬずつ加えた。２００μＬにあわせた１２連のピペットマンで２０回ピペッティングし、懸濁した。ガス透過性のマイクロプレート用シール（４ｔｉｔｕｄｅ、Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｃｏｄｅ ４ｔｉ−０５１６／９６）を貼り、３７℃嫌気条件下で培養を開始した。
（２−１）クロストリジウム・ディフィシル及びビフィドバクテリウム・インファンティスの共培養
まず、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ；Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）及びビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ；Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓ）について、それぞれグリセロールストックからＧＡＭプレートに滅菌した爪楊枝を用いて植菌及び画線し、３７℃嫌気条件下で４８時間以上培養した。次いで、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅは１コロニーを、Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓは１０コロニーを滅菌した爪楊枝を用いてバイアル瓶に入れた２ｍＬＧＡＭに植菌し、３７℃嫌気条件下で２６時間培養し、前培養液を得た。次いで、９６ディープウェルプレートに（１−４）で調製した０．５（ｗ／ｖ）％糖（Ｇａｌ−β１，４−Ｒｈａ）添加培地、又はコントロールとして（１−２）で調製した糖除去ＧＡＭを５００μＬずつ入れた。次いで、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ及びＢ．ｉｎｆａｎｔｉｓの前培養液を、ＧＡＭを用いて任意の倍率に希釈し、ＧＡＭをブランクとして波長６００ｎｍにおける吸光度を測定した。得られた値を用いて前培養液の吸光度がＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅについて０．５、Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓについて０．０５となるように糖除去ＧＡＭを用いて希釈した。次いで、０．５（ｗ／ｖ）％糖（Ｇａｌ−β１，４−Ｒｈａ）添加培地又は糖除去ＧＡＭが分注された９６ディープウェルプレートに、希釈したＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ及びＢ．ｉｎｆａｎｔｉｓの前培養液を１０μＬずつ植菌した（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの初期濁度は０．０１、Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓの初期濁度は０．００１であった）。また、コントロールとして、単菌培養（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのみ）のウェルには、０．５（ｗ／ｖ）％糖（Ｇａｌ−β１，４−Ｒｈａ）添加培地又は糖除去ＧＡＭが分注された９６ディープウェルプレートに、希釈したＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの前培養液を１０μＬずつ加えた。２００μＬにあわせた１２連のピペットマンで２０回ピペッティングし、懸濁した。ガス透過性のマイクロプレート用シール（４ｔｉｔｕｄｅ、Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｃｏｄｅ ４ｔｉ−０５１６／９６）を貼り、３７℃嫌気条件下で培養を開始した。
（２−２）菌数の測定
次いで、共培養用又は単培養用溶液中の各菌種の菌数を調べる目的で、以下の操作を本培養開始から０時間、１７時間、２３時間、及び４７時間後に行った。
まず、９６ウェル滅菌プレートにオートクレーブ及び嫌気処理済みのＰＢＳを１８０μＬずつ入れた。次いで、（２−１）で培養した共培養又は単培養用培養液を２００μＬにあわせた１２連のピペットマンで２０回ピペッティングし、懸濁した。次いで、共培養又は単培養用培養液を２０μＬずつとり、９６ウェル滅菌プレートに用意しておいたＰＢＳに加えた。次いで、１５０μＬにあわせた１２連のピペットマンで１０回ピペッティングすることで希釈及び懸濁した。共培養又は単培養用培養液の希釈液をさらに２０μＬずつとり、ＰＢＳ １８０μＬに加え、同様に希釈及び懸濁を行った。この操作を繰り返すことにより、段階希釈を行った。予め滅菌済みビーズ（ニッポンジーン社製、Ｃｏｄｅ Ｎｏ．３１４−０６２５１）７個を入れておいたクロストリジア測定用培地にそれぞれの希釈液を５０μＬずつ添加した。１分間プレートを振り、移動するビーズを利用して希釈液を塗布した。次いで、希釈液を塗布したプレートをパウチ（三菱ガス化学社製、品番Ａ−９８）にアネロパックと共に密閉し、３７℃インキュベーターに入れ、４８時間以上培養した。次いで、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ及びＢ．ｉｎｆａｎｔｉｓ、それぞれのコロニー数をカウントした。得られたコロニー数について、下記式［１］を用いて、培養液１ｍＬあたりのコロニー数を算出した。結果を図２に示す。図２において、「Ｇａｌ−Ｒｈａ」とは、Ｇａｌ−β１，４−Ｒｈａを添加した培地を用いたことを意味する。
培養液１ｍＬあたりのコロニー数＝５０μＬあたりのコロニー数×希釈倍率×２０ ［１］
なお、４７時間後の共培養又は単培養用培養液を塗布後、残った共培養又は単培養用培養液をエッペンチューブにとり、遠心（１４，０００ｒｐｍ、２ｍｉｎ）後、上清２００μＬを新しいエッペンチューブに取り、−２５℃で保存した。
次いで、共培養用又は単培養用溶液中の各菌種の菌数を調べる目的で、以下の操作を本培養開始から０時間、１７時間、２３時間、及び４７時間後に行った。
まず、９６ウェル滅菌プレートにオートクレーブ及び嫌気処理済みのＰＢＳを１８０μＬずつ入れた。次いで、（２−１）で培養した共培養又は単培養用培養液を２００μＬにあわせた１２連のピペットマンで２０回ピペッティングし、懸濁した。次いで、共培養又は単培養用培養液を２０μＬずつとり、９６ウェル滅菌プレートに用意しておいたＰＢＳに加えた。次いで、１５０μＬにあわせた１２連のピペットマンで１０回ピペッティングすることで希釈及び懸濁した。共培養又は単培養用培養液の希釈液をさらに２０μＬずつとり、ＰＢＳ １８０μＬに加え、同様に希釈及び懸濁を行った。この操作を繰り返すことにより、段階希釈を行った。予め滅菌済みビーズ（ニッポンジーン社製、Ｃｏｄｅ Ｎｏ．３１４−０６２５１）７個を入れておいたクロストリジア測定用培地にそれぞれの希釈液を５０μＬずつ添加した。１分間プレートを振り、移動するビーズを利用して希釈液を塗布した。次いで、希釈液を塗布したプレートをパウチ（三菱ガス化学社製、品番Ａ−９８）にアネロパックと共に密閉し、３７℃インキュベーターに入れ、４８時間以上培養した。次いで、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ及びＢ．ｉｎｆａｎｔｉｓ、それぞれのコロニー数をカウントした。得られたコロニー数について、下記式［１］を用いて、培養液１ｍＬあたりのコロニー数を算出した。結果を図２に示す。図２において、「Ｇａｌ−Ｒｈａ」とは、Ｇａｌ−β１，４−Ｒｈａを添加した培地を用いたことを意味する。
培養液１ｍＬあたりのコロニー数＝５０μＬあたりのコロニー数×希釈倍率×２０ ［１］
なお、４７時間後の共培養又は単培養用培養液を塗布後、残った共培養又は単培養用培養液をエッペンチューブにとり、遠心（１４，０００ｒｐｍ、２ｍｉｎ）後、上清２００μＬを新しいエッペンチューブに取り、−２５℃で保存した。
図２から、糖除去ＧＡＭ又は０．５（ｗ／ｖ）％糖（Ｇａｌ−β１，４−Ｒｈａ）添加培地を用いてＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのみを単培養した場合、及び糖除去ＧＡＭを用いてＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ及びＢ．ｉｎｆａｎｔｉｓを共培養した場合では、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの増殖は抑制されず、同様の増殖の傾向が見られた。
これに対し、０．５（ｗ／ｖ）％糖（Ｇａｌ−β１，４−Ｒｈａ）添加培地を用いてＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ及びＢ．ｉｎｆａｎｔｉｓを共培養した場合では、培養１７時間時間後から、顕著なＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの増殖抑制効果が見られた。これは、培地に含まれるＧａｌ−β１，４−ＲｈａがＢ．ｉｎｆａｎｔｉｓのみによって資化され、Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓの増殖が促進されることによって、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの増殖が抑制されたためであると推測される。
これに対し、０．５（ｗ／ｖ）％糖（Ｇａｌ−β１，４−Ｒｈａ）添加培地を用いてＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ及びＢ．ｉｎｆａｎｔｉｓを共培養した場合では、培養１７時間時間後から、顕著なＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの増殖抑制効果が見られた。これは、培地に含まれるＧａｌ−β１，４−ＲｈａがＢ．ｉｎｆａｎｔｉｓのみによって資化され、Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓの増殖が促進されることによって、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの増殖が抑制されたためであると推測される。
［実施例３］
（１）培地の調製
（１−１）Ｇｉｆｕ Ａｎａｅｒｏｂｉｃ Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＡＭ）（前培養用培地）の調製
実施例１の（１−１）と同様の方法を用いて、前培養用のＧＡＭを調製した。
（１）培地の調製
（１−１）Ｇｉｆｕ Ａｎａｅｒｏｂｉｃ Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＡＭ）（前培養用培地）の調製
実施例１の（１−１）と同様の方法を用いて、前培養用のＧＡＭを調製した。
（１−２）糖除去ＧＡＭの調製
実施例１の（１−２）と同様の方法を用いて、ＧＡＭ糖除去培地を調製した。
実施例１の（１−２）と同様の方法を用いて、ＧＡＭ糖除去培地を調製した。
（１−３）５（ｗ／ｖ）％糖溶液の調製
実施例１の（１−３）と同様の方法を用いて、５（ｗ／ｖ）％のＧａｌ−β１，４−Ｒｈａ溶液を調製した。
実施例１の（１−３）と同様の方法を用いて、５（ｗ／ｖ）％のＧａｌ−β１，４−Ｒｈａ溶液を調製した。
（１−４）糖添加培地の調製
実施例１の（１−４）と同様の方法を用いて、１種類（Ｇａｌ−β１，４−Ｒｈａ含有）の０．５（ｗ／ｖ）％糖添加培地を調製した。
実施例１の（１−４）と同様の方法を用いて、１種類（Ｇａｌ−β１，４−Ｒｈａ含有）の０．５（ｗ／ｖ）％糖添加培地を調製した。
（１−５）クロストリジア測定用培地の調製
実施例２の（１−５）と同様の方法を用いて、クロストリジア測定用培地を調製した。
実施例２の（１−５）と同様の方法を用いて、クロストリジア測定用培地を調製した。
（２）糞便共存培養下におけるディフィシル毒素の産生抑制試験
（２−１）イムノクロマト法による試験
・Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ及びＢ．ｉｎｆａｎｔｉｓの糞便共存培養
まず、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ及びＢ．ｉｎｆａｎｔｉｓについて、それぞれグリセロールストックからＧＡＭプレートに滅菌した爪楊枝を用いて植菌及び画線し、３７℃嫌気条件下で４８時間培養した。次いで、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅは１コロニーを、Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓは１０コロニーを滅菌した爪楊枝を用いてバイアル瓶に入れた２ｍＬ ＧＡＭに植菌し、３７℃嫌気条件下で２４時間培養し、前培養液を得た。また、（１−４）で調製した０．５（ｗ／ｖ）％糖（Ｇａｌ−β１，４−Ｒｈａ）添加培地又は糖除去ＧＡＭを５００μＬずつ９６ディープウェルプレートに分注した。ガス透過性のマイクロプレート用シールを貼り、アネロパックと共に密閉容器に入れた。
次いで、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ及びＢ．ｉｎｆａｎｔｉｓの前培養液を、ＧＡＭを用いて任意の倍率に希釈し、ＧＡＭをブランクとして波長６００ｎｍにおける吸光度を測定した。前培養液の吸光度がＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅについて０．５、Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓについて０．０５となるように糖除去ＧＡＭを用いて希釈した。
（２−１）イムノクロマト法による試験
・Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ及びＢ．ｉｎｆａｎｔｉｓの糞便共存培養
まず、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ及びＢ．ｉｎｆａｎｔｉｓについて、それぞれグリセロールストックからＧＡＭプレートに滅菌した爪楊枝を用いて植菌及び画線し、３７℃嫌気条件下で４８時間培養した。次いで、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅは１コロニーを、Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓは１０コロニーを滅菌した爪楊枝を用いてバイアル瓶に入れた２ｍＬ ＧＡＭに植菌し、３７℃嫌気条件下で２４時間培養し、前培養液を得た。また、（１−４）で調製した０．５（ｗ／ｖ）％糖（Ｇａｌ−β１，４−Ｒｈａ）添加培地又は糖除去ＧＡＭを５００μＬずつ９６ディープウェルプレートに分注した。ガス透過性のマイクロプレート用シールを貼り、アネロパックと共に密閉容器に入れた。
次いで、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ及びＢ．ｉｎｆａｎｔｉｓの前培養液を、ＧＡＭを用いて任意の倍率に希釈し、ＧＡＭをブランクとして波長６００ｎｍにおける吸光度を測定した。前培養液の吸光度がＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅについて０．５、Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓについて０．０５となるように糖除去ＧＡＭを用いて希釈した。
次いで、採便シート（アトレータ社製、商品コード２０−１１００）と採便管（東洋器材科学社製、製品コード３２６００）とを用いて採便し、採便管のふたをゆるめた状態でアネロパックと共に密閉容器に入れ、運搬した。次いで、１５ｍＬ容ファルコンチューブに糞便を適量とり、秤量した。次いで、嫌気チャンバー内でオートクレーブ及び嫌気処理済みＰＢＳを用いて５倍希釈後、懸濁し、３７℃、嫌気状態で２〜５時間インキュベートした。次いで、糞便５倍希釈液をオートクレーブ及び嫌気処理済みＰＢＳを用いて任意の倍率に更に希釈し、ＰＢＳをブランクとして波長６００ｎｍにおける吸光度を測定した。得られた値を用いて糞便希釈液の吸光度が０．５となるようにＰＢＳを用いて希釈した。
次いで、０．５（ｗ／ｖ）％糖（Ｇａｌ−β１，４−Ｒｈａ）添加培地又は糖除去ＧＡＭが５００μＬずつ分注された９６ディープウェルプレートに、希釈したＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ及びＢ．ｉｎｆａｎｔｉｓの前培養液１０μＬずつ植菌した。また、コントロールとして、糞便とＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅとの共存培養のウェルには、糖除去ＧＡＭが５００μＬずつ分注された９６ディープウェルプレートに、希釈したＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの前培養液を１０μＬずつ加えた。さらに、希釈した糞便溶液を１０μＬずつ植菌した。（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの初期濁度は０．０１、Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓの初期濁度は０．００１、糞便希釈液の初期濁度は０．０１であった）。次いで、２００μＬに合わせた１２連のピペットマンで２０回ピペッティングし、懸濁した。ガス透過性のマイクロプレート用シールを貼り、３７℃嫌気条件下で２４時間培養した。
・濁度の算出
次いで、９６ディープウェルプレートを嫌気チャンバーから出し、各培養液を２００μＬに合わせたピペットマンで２０回ピペッティングし、懸濁した。培養液のうち２０μＬをとり、ＰＢＳを１８０μＬずつ入れた９６ウェルプレートに加えた。次いで、糖除去ＧＡＭをブランクとしてプレートリーダーで吸光度を測定した。また、水を添加した糖除去ＧＡＭにおいて糞便のみを植菌した培地について、ＰＢＳを用いて１０倍希釈し、濁度を光路長１ｃｍのキュベットを用いて測定した。マイクロプレートでの測定値を光路長１ｃｍのキュベットでの値に換算できる定数を算出した。この定数を用いて２４時間培養後の濁度を下記式［２］を用いて、算出した。
｛（プレートの値）−（プレートのブランク）｝×ファクター×１０ ［２］
次いで、９６ディープウェルプレートを嫌気チャンバーから出し、各培養液を２００μＬに合わせたピペットマンで２０回ピペッティングし、懸濁した。培養液のうち２０μＬをとり、ＰＢＳを１８０μＬずつ入れた９６ウェルプレートに加えた。次いで、糖除去ＧＡＭをブランクとしてプレートリーダーで吸光度を測定した。また、水を添加した糖除去ＧＡＭにおいて糞便のみを植菌した培地について、ＰＢＳを用いて１０倍希釈し、濁度を光路長１ｃｍのキュベットを用いて測定した。マイクロプレートでの測定値を光路長１ｃｍのキュベットでの値に換算できる定数を算出した。この定数を用いて２４時間培養後の濁度を下記式［２］を用いて、算出した。
｛（プレートの値）−（プレートのブランク）｝×ファクター×１０ ［２］
・イムノクロマト法によるディフィシル毒素の検出
次いで、懸濁した培養液のうち４００μＬずつをエッペンチューブにとり、遠心（１４，０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）後、新しいエッペンチューブに上清をとった。これとクロストリジウム ディフィシルキット ＧＥテスト イムノクロマト−ＣＤ ＴＯＸ Ａ／Ｂ「ニッスイ」（日水製薬社製、ｃｏｄｅ０７８５１）を用いて、ディフィシル毒素検出試験をキットの添付文書に従って行った。具体的には、まず、テストプレートと検体希釈液とを常温に戻し、検体希釈液に前記上清を５０μＬ加えた。懸濁した後、試料ろ過フィルターを装着した。次いで、テストプレートの検体添加部に３滴添加し、２０分間静置した。残った菌体及び上清は−８０℃で保存した。結果を図３に示す。
次いで、懸濁した培養液のうち４００μＬずつをエッペンチューブにとり、遠心（１４，０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）後、新しいエッペンチューブに上清をとった。これとクロストリジウム ディフィシルキット ＧＥテスト イムノクロマト−ＣＤ ＴＯＸ Ａ／Ｂ「ニッスイ」（日水製薬社製、ｃｏｄｅ０７８５１）を用いて、ディフィシル毒素検出試験をキットの添付文書に従って行った。具体的には、まず、テストプレートと検体希釈液とを常温に戻し、検体希釈液に前記上清を５０μＬ加えた。懸濁した後、試料ろ過フィルターを装着した。次いで、テストプレートの検体添加部に３滴添加し、２０分間静置した。残った菌体及び上清は−８０℃で保存した。結果を図３に示す。
図３から、糞便とＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅとの共存培養、並びに糞便とＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ及びＢ．ｉｎｆａｎｔｉｓとの共存培養では、ディフィシル毒素が検出された。一方、糞便とＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ及びＢ．ｉｎｆａｎｔｉｓとをＧａｌ−β１，４−Ｒｈａ添加培地を用いて共存培養した場合では、ディフィシル毒素の検出量が大幅に減少していた。
（２−２）ＥＬＩＳＡ法による試験
・Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ及びＢ．ｉｎｆａｎｔｉｓの糞便共存培養
３検体の糞便（糞便１〜３）を用いた以外は、上述の（２−１）の「イムノクロマト法による試験」の「・Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ及びＢ．ｉｎｆａｎｔｉｓの糞便共存培養」と同様の方法を用いて、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ及びＢ．ｉｎｆａｎｔｉｓの糞便共存培養を行った。
・Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ及びＢ．ｉｎｆａｎｔｉｓの糞便共存培養
３検体の糞便（糞便１〜３）を用いた以外は、上述の（２−１）の「イムノクロマト法による試験」の「・Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ及びＢ．ｉｎｆａｎｔｉｓの糞便共存培養」と同様の方法を用いて、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ及びＢ．ｉｎｆａｎｔｉｓの糞便共存培養を行った。
・ＥＬＩＳＡ法によるディフィシル毒素の検出
次いで、９６ディープウェルプレートを嫌気チャンバーから出し、ＥＬＩＳＡ法を用いてディフィシル毒素検出試験を行った。用いたキットはＥＬＩＳＡ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ｔｏｘｉｎ Ａ ａｎｄ Ｂ ｉｎ ｓｔｏｏｌ −Ｆｏｒ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｕｓｅ−（ｔｇｃＢＩＯＭＩＣＳ社製、Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｃｏｄｅ：ＴＧＣ−Ｅ００１−１）であり、添付されていた取扱い説明書に従って試験を行った。具体的には、まず、ＥＬＩＳＡキットを常温に戻した。次いで、エッペンチューブにｄｉｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒを４５０μＬ入れた。次いで、各培養液を２００μＬに合わせたマルチピペットマンで２０回ピペッティングし、懸濁した。懸濁した培養液５０μＬずつをエッペンチューブに加え、ボルテックスミキサーで混合した。次いで、遠心（２５００×ｇ、５ｍｉｎ）し、粒子を落とした。次いで、１０×Ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ：滅菌水＝９：１となるように混合し、希釈した。次いで、必要な分のウェルだけ（８単位ずつ）とり、残りのウェルはアルミバッグに戻した。
次いで、９６ディープウェルプレートを嫌気チャンバーから出し、ＥＬＩＳＡ法を用いてディフィシル毒素検出試験を行った。用いたキットはＥＬＩＳＡ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ｔｏｘｉｎ Ａ ａｎｄ Ｂ ｉｎ ｓｔｏｏｌ −Ｆｏｒ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｕｓｅ−（ｔｇｃＢＩＯＭＩＣＳ社製、Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｃｏｄｅ：ＴＧＣ−Ｅ００１−１）であり、添付されていた取扱い説明書に従って試験を行った。具体的には、まず、ＥＬＩＳＡキットを常温に戻した。次いで、エッペンチューブにｄｉｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒを４５０μＬ入れた。次いで、各培養液を２００μＬに合わせたマルチピペットマンで２０回ピペッティングし、懸濁した。懸濁した培養液５０μＬずつをエッペンチューブに加え、ボルテックスミキサーで混合した。次いで、遠心（２５００×ｇ、５ｍｉｎ）し、粒子を落とした。次いで、１０×Ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ：滅菌水＝９：１となるように混合し、希釈した。次いで、必要な分のウェルだけ（８単位ずつ）とり、残りのウェルはアルミバッグに戻した。
次いで、エッペンチューブの溶液、ｔｈｅ ｔｏｘｉｎ Ａ／Ｂ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｍｉｘ、又はｄｉｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ）をそれぞれのウェルに１００μＬずつ入れた。次いで、それぞれのウェルにｔｈｅ ａｎｔｉ ｔｏｘｉｎ Ａ／Ｂ−ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅを５０μＬずつ入れ、室温で６０分間インキュベートした。次いで、それぞれのウェルを希釈済みのｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒを２００μＬずつ入れて満たし、ごみ箱に向けて振り捨てた。さらにキムタオルに叩きつけ、液体を飛ばした。次いで、ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒを入れて捨てるこの操作をさらに４回繰り返すことで洗浄した。洗浄後、液体が完全になくなるまでキムタオルに叩きつけた。次いで、各ウェルにｓｕｂｓｔｒａｔｅを１００μＬずつ加え、優しくタップすることで混合し、室温で１０分間インキュベートした。次いで、Ｓｔｏｐ ｒｅａｇｅｎｔを５０μＬずつ加え、反応を停止させた。次いで、Ｓｔｏｐ ｓｏｌｕｔｉｏｎを加えることにより、色が青色から黄色へと変化した。これを、ブランクを空気として４５０ｎｍ及び６２０ｎｍで吸光度を測定した。結果を図４に示す。
なお、残った各培養液をエッペンチューブに３００μＬずつとり、遠心（１４，０００ ｒｐｍ、２ｍｉｎ）し、上清を新しいエッペンチューブにとった。上清及び菌体は−８０℃で保存した。
なお、残った各培養液をエッペンチューブに３００μＬずつとり、遠心（１４，０００ ｒｐｍ、２ｍｉｎ）し、上清を新しいエッペンチューブにとった。上清及び菌体は−８０℃で保存した。
図４から、糞便１〜３において、糞便とＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅとの共存培養、並びに糞便とＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ及びＢ．ｉｎｆａｎｔｉｓとの共存培養では、約８０〜１６０ｍｇ／ｍＬのディフィシル毒素が検出された。一方、糞便１〜３において、糞便とＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ及びＢ．ｉｎｆａｎｔｉｓとをＧａｌ−β１，４−Ｒｈａ添加培地を用いて共存培養した場合では、約２０〜４０ｍｇ／ｍＬとディフィシル毒素の検出量が１／５〜１／４程度まで大幅に減少していた。
また、糞便１〜３において、糞便とＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅとをＧａｌ−β１，４−Ｒｈａ添加培地を用いて共存培養した場合においても、ディフィシル毒素が約２０〜１００ｍｇ／ｍＬと減少傾向が見られた。これは、個人差はあるものの被検体の糞便中に含まれるビフィズス菌がＧａｌ−β１，４−Ｒｈａにより増殖することで、クロストリジウム・ディフィシルの増殖及びディフィシル毒素の産生が抑制されたためであると推察された。
以上のことから、ガラクトシル−β−１，４−ラムノースは腸内常在菌及び悪玉菌に対して増殖促進効果を有さず、ビフィズス菌（特に、Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓ）のみを特異的に増殖させることができ、さらに、該ビフィズス菌（特に、Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓ）の増殖に伴い、クロストリジウム・ディフィシルの増殖及びディフィシル毒素の産生を抑制できることが確かめられた。
また、糞便１〜３において、糞便とＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅとをＧａｌ−β１，４−Ｒｈａ添加培地を用いて共存培養した場合においても、ディフィシル毒素が約２０〜１００ｍｇ／ｍＬと減少傾向が見られた。これは、個人差はあるものの被検体の糞便中に含まれるビフィズス菌がＧａｌ−β１，４−Ｒｈａにより増殖することで、クロストリジウム・ディフィシルの増殖及びディフィシル毒素の産生が抑制されたためであると推察された。
以上のことから、ガラクトシル−β−１，４−ラムノースは腸内常在菌及び悪玉菌に対して増殖促進効果を有さず、ビフィズス菌（特に、Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓ）のみを特異的に増殖させることができ、さらに、該ビフィズス菌（特に、Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓ）の増殖に伴い、クロストリジウム・ディフィシルの増殖及びディフィシル毒素の産生を抑制できることが確かめられた。
本発明によれば、腸内常在菌及び悪玉菌に対して増殖促進効果を有さず、プロバイオティクス細菌のみを特異的に増殖させることができるため、腸内細菌叢を効果的に改善させることができる。さらに、プロバイオティクス細菌の増殖に伴い、クロストリジウム・ディフィシルの増殖及びディフィシル毒素の産生を抑制できるため、効果的に偽膜性腸炎の予防又は治療することができる。
Claims (6)
- ガラクトシル−β−１，４−ラムノースを有効成分として含有することを特徴とする腸内細菌叢改善剤。
- 請求項１に記載の腸内細菌叢改善剤、並びに薬学的に許容できる担体及び希釈剤のうち少なくともいずれかを含むことを特徴とする腸内細菌叢改善用の医薬組成物。
- 請求項１に記載の腸内細菌叢改善剤を含むことを特徴とする腸内細菌叢改善用の飲食品。
- ヒト以外の哺乳動物において、日和見菌及び悪玉菌の増殖を促進させず、ビフィズス菌を特異的に増殖促進させるための、ガラクトシル−β−１，４−ラムノースの使用。
- 前記ビフィズス菌がビフィドバクテリウム・インファンティスである請求項４に記載の使用。
- クロストリジウム・ディフィシルを保菌するヒト以外の被検体にガラクトシル−β−１，４−ラムノースを投与し、日和見菌及び悪玉菌の増殖を促進させず、ビフィズス菌を特異的に増殖促進させる、クロストリジウム・ディフィシルの増殖抑制方法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2017000245A JP6886142B2 (ja) | 2017-01-04 | 2017-01-04 | 腸内細菌叢改善剤及びその使用 |
| PCT/JP2017/047236 WO2018128163A1 (ja) | 2017-01-04 | 2017-12-28 | 腸内細菌叢改善剤及びその使用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2017000245A JP6886142B2 (ja) | 2017-01-04 | 2017-01-04 | 腸内細菌叢改善剤及びその使用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2018108968A JP2018108968A (ja) | 2018-07-12 |
| JP6886142B2 true JP6886142B2 (ja) | 2021-06-16 |
Family
ID=62791285
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2017000245A Active JP6886142B2 (ja) | 2017-01-04 | 2017-01-04 | 腸内細菌叢改善剤及びその使用 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP6886142B2 (ja) |
| WO (1) | WO2018128163A1 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102470808B1 (ko) * | 2020-11-02 | 2022-11-28 | 주식회사 바이오미 | 염증성 장질환 예방 또는 치료용 조성물 |
| CN112852670B (zh) * | 2021-01-26 | 2022-08-09 | 青岛东海药业有限公司 | 一种婴儿双歧杆菌dh231及其发酵产物、应用和微生态制剂 |
| CN112980737B (zh) * | 2021-04-01 | 2022-07-01 | 江南大学 | 一株促进动物双歧杆菌增殖的青春双歧杆菌及其应用 |
| CN115282159A (zh) * | 2022-04-13 | 2022-11-04 | 中国海洋大学 | 鼠李聚糖硫酸酯在制备预防和/或治疗炎症所致肠黏膜o-糖链结构异常疾病产品中的应用 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ITMI20110793A1 (it) * | 2011-05-09 | 2012-11-10 | Probiotical Spa | Ceppi di batteri probiotici e composizione sinbiotica contenente gli stessi destinata alla alimentazione dei neonati. |
| JP6678483B2 (ja) * | 2016-03-15 | 2020-04-08 | 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 | オリゴ糖の製造方法 |
-
2017
- 2017-01-04 JP JP2017000245A patent/JP6886142B2/ja active Active
- 2017-12-28 WO PCT/JP2017/047236 patent/WO2018128163A1/ja active Application Filing
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2018128163A1 (ja) | 2018-07-12 |
| JP2018108968A (ja) | 2018-07-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11566219B2 (en) | Bifidobacterium bacteria and composition including novel bifidobacterium bacteria | |
| CA2965663C (en) | Activated bifidobacteria and methods of use thereof | |
| CN1802101B (zh) | 异麦芽酮糖醇(1,6gps和1,1gpm混合物)作为生产用于治疗肠道疾病的药物及其他用途的益生元的应用 | |
| EP2117355B1 (en) | Method of improving skills with a composition comprising non-digestible saccharide | |
| JP6886142B2 (ja) | 腸内細菌叢改善剤及びその使用 | |
| JP7280243B2 (ja) | 栄養組成物並びに該栄養組成物を用いた飲食品組成物及び調製粉乳 | |
| JP2010521136A (ja) | 腸内細菌叢改善用組成物 | |
| JP7240327B2 (ja) | 新規ビフィドバクテリウム属細菌及び当該細菌を含む組成物 | |
| AU2019237674B2 (en) | Composition for enhancing breast milk component | |
| RU2303058C2 (ru) | Средство для лечения кишечных инфекций, осложненных дисбактериозом "биобаланс-к" | |
| JP2004051530A (ja) | 腸内菌叢改善剤及びそれを含有する飲食品 | |
| JP2019097544A (ja) | 新規ビフィドバクテリウム属細菌及び当該細菌を含む組成物 | |
| KR102146706B1 (ko) | 비피도박테리움 애니멀리스 서브스페시스 락티스 HY8002와 비피도박테리움 아돌레센티스 HY8502의 유산균 조합을 이용한 진세노사이드 Rd가 강화된 발효홍삼 농축액을 유효성분으로 함유하는 알레르기성 비염을 개선하기 위한 조성물 | |
| WO2017057535A1 (ja) | デオキシコール酸低減剤 | |
| EP3892331A1 (en) | Composition for suppressing norovirus infection | |
| Marks | Successful probiotic bifidobacteria | |
| JP6978621B1 (ja) | 組成物 | |
| US20230248787A1 (en) | Probiotic strain selected by targeted in vivo enrichment to aid with healthy lactose digestion | |
| WO2023068374A1 (en) | Composition for promoting the assimilation of an oligosaccharide | |
| WO2024024906A1 (ja) | ビフィドバクテリウム・ブレーベのオリゴ糖資化促進用組成物 | |
| JP2008290972A (ja) | ビフィズス菌選択的増殖促進剤 | |
| WO2022255441A1 (ja) | 組成物 | |
| JP2023062563A (ja) | 栄養組成物 | |
| JP2024513429A (ja) | ビフィズス菌を刺激するための栄養組成物 | |
| CN112384227A (zh) | 含有不可消化寡糖的发酵配方物 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170216 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170309 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20191129 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20200929 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20201130 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20201130 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20210406 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20210430 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6886142 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |