CN113684137B - 一种玄参内生真菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种玄参内生真菌及其应用，所述的内生真菌是从玄参科玄参属植物玄参Scrophularia ningpoensis活体中采用内生真菌分离纯化技术分离获得的，分类命名为小丛壳菌目刺盘孢属果生刺盘孢菌D90(Colletotrichum fructicola)，于2021年4月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC No.21949。本发明同时发明公开了所诉内生真菌的用途：能抑制玄参叶斑病病原菌的生长，诱导玄参超氧阴离子与过氧化氢酶含量积累，降低玄参根腐病病情指数28.77％。本发明的内生真菌对玄参叶斑病防治效果明显，为玄参叶类病害的生物防治领域带来了广阔的应用前景。

Description

一种玄参内生真菌及其应用
技术领域
本发明涉及植物病害防控技术领域，具体地说，是一种玄参内生真菌及其应用。
背景技术
中药玄参系玄参科玄参属植物玄参Scrophularia ningpoensis Hemsl.的干燥根，别名元参、黑参等，是浙江省著名道地药材“浙八味”之一，主产浙江、湖北、安徽、四川、陕西等地。玄参始载于《神农本草经》，具有清热凉血，滋阴降火，解毒散结的功效，常用于热病伤阴，舌绛烦渴，津伤便秘等症，主要含有环烯醚萜苷类、苯丙素苷类等活性成分，具有抗炎、保护心血管、保肝等药理活性。
玄参叶斑病是由草茎点霉菌Phoma herbarum引起的叶部病害，常年发病率在10％左右，严重时可达50％以上，严重阻碍了玄参产业健康发展。玄参叶斑病现有的防治措施主要分为化学防治和农业防治两方面。化学防治主要包括喷施50％多菌灵可湿性粉剂、60％代森锰锌或75％百菌清粉剂等药剂，对玄参叶斑病有一定的防治效果。农业防治主要包括加强田间管理，合理选地整地来降低病害的发生率。然而，这些措施易造成农药残留，危害人体健康，对环境也会造成极大的破坏，难从源头上断绝或防治病害的发生。
植物内生真菌广泛存在于植物体内，对宿主植物无明显的危害作用。研究发现内生真菌及其次生代谢产物具有增强植物抗病性、促进植物生长发育等作用，近年来，利用有益微生物抑制病原菌生存的生物防治措施是目前研究植物病害防治的有效方法之一，具有不污染环境、对人体毒性较小以及病虫不易产生抗药性等优点。研究最多的生防菌为木霉属真菌(包括哈茨木霉和深绿木霉等)和芽孢杆菌属(包括枯草芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌等)，这些生防菌对抗植物病害方面具有重要的作用。因此，植物内生真菌是植物病害防控技术领域重要的微生物资源。
但是，关于玄参内生真菌防治玄参叶斑病的应用研究目前鲜有报道。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种玄参内生真菌及其应用。
本发明的第一方面，提供了一种植物内生真菌，是从玄参科玄参属植物玄参(Scrophularia ningpoensis Hemsl.)活体中采用内生真菌分离纯化技术分离获得的，命名为小丛壳菌目刺盘孢属果生刺盘孢菌D90(Colletotrichum fructicola)。该菌株已保藏，菌株保藏编号为CGMCC No.21949，保藏日期为2021年4月9日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编为100101。
本发明所述的内生真菌的固体培养特征为：
在土豆葡萄糖琼脂培养基(PDA)上26℃黑暗培养，菌株生长速度较快，菌体呈绒毛状，菌落内外分层明显，内圈大部，呈淡绿色，外圈小部，呈白色，见图1。
本发明所述的内生真菌的ITS扩增碱基序列如SEQ ID NO.1所示，将测序结果于NCBI网站进行序列比对(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，同果生刺盘孢菌Colletotrichum fructicola(MN841836.1)同源性达99.41％。用MEGA 7.0软件做序列比对，用邻接法(Neighbor-joining，NJ)分析，随机挑选1个序列，重复比对1000次。本发明所述内生真菌的系统进化树见图2。
本发明的第二方面，提供了上述内生真菌的应用，包括抑制玄参叶斑病病原菌生长、缓解玄参叶斑病病情、增强玄参抗病性。
上述应用，通过施用D90孢子悬浮液能有效缓解玄参叶斑病病情、增强玄参抗病性，所述孢子悬浮液首先是在PDA固体培养基上进行D90菌株活化，然后打取5mm菌饼放入PDB液体培养基中于摇床中黑暗培养，一周后无菌纱布过滤，调整孢子浓度所得，固体培养基(PDA)的配方是：200g土豆，20g葡萄糖，1000mL蒸馏水，15g琼脂，pH自然。液体培养基(PDB)的配方是：200g土豆，20g葡萄糖，1000mL蒸馏水，pH自然。
进一步地，主要通过以下技术方案来实现的：(1)取上述的内生真菌菌种，在无菌条件下，用接种针挑取少量菌丝，接入已灭菌的土豆葡萄糖培养基(配方为土豆200g，葡萄糖20g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH自然)，26℃，65％湿度条件下暗培养7d；(2)无菌条件下，用5mm的打孔器打取上述菌株菌落边缘的菌块，转接于含有50mL的PDB培养基中，于26℃，180rpm的摇床培养7d，四层纱布过滤，除掉菌丝，吸取100μL孢子悬浮液，用血球计数板观察，调整孢子浓度为107cfu/mL，即得D90孢子悬浮液。(3)采用喷施的方法对患有叶斑病的玄参叶片进行施用所述孢子悬浮液，施用量为1mL/次/d，接种周期为7d，能有效缓解玄参叶斑病病情、增强玄参抗病性。
本发明优点在于：
本发明所述的内生真菌果生刺盘孢菌D90，通过液体培养基制备的活体孢子悬浮液，能有效缓解玄参叶斑病病情。果生刺盘孢菌对玄参叶斑病的生物防治作用在农业领域内的推广具有巨大的价值。
附图说明
图1：果生刺盘孢菌D90(Colletotrichum fructicola)在PDA固体培养基上的菌落形态图。
图2：基于ITS4和ITS5引物扩增的D90(Colletotrichum fructicola)系统进化树(NJ法)；
图3：果生刺盘孢菌D90(C.fructicola)有效缓解玄参叶斑病病情，其中，a为叶片表型结果图；b,不同处理组别叶片损伤面积统计图，PH+Positive drug表示病原菌+80％代森锰锌1000倍液处理组，PH+Positive fungus表示病原菌+哈茨木霉处理组，PH+D90表示病原菌+D90菌处理组，PH+Water表示病原菌+无菌水处理组，D90+Water表示D90菌+无菌水处理组，Water表示无菌水+无菌水处理组；
图4：果生刺盘孢菌D90(C.fructicola)对玄参叶斑病病原菌草茎点霉菌的抑制作用结果图；
图5：果生刺盘孢菌D90(C.fructicola)孢子悬浮液提高玄参叶片CAT酶活性与超氧阴离子含量结果图，其中：a，CAT酶活性、b，超氧阴离子含量(**P<0.01，*P<0.05)。
具体实施方式
本发明的内生真菌是从浙江临安天目山的玄参活体中分离得到的菌株。下面结合具体实施例及附图对本发明作进一步说明。
实施例1：
所述的内生真菌按以下步骤分离获得：用清水快速冲洗玄参根表面的泥土和杂质，冲洗干净后，滤纸吸干表面的水分，按照75vol％乙醇1min，2.5vol％次氯酸钠5min，75vol％乙醇1min进行表面消毒，消毒后，用滤纸吸干表面，用消毒后的剪刀将根剪切成小的组织块(0.5cm×0.5cm)，随机挑取各8个组织块，每4个为一组置于含有青霉素(50mg/L)PDA培养基的平板中。密封后25℃培养，定期观察内生真菌菌丝的生长和菌落的形成，经过不断分离纯化培养至单一菌落。根据菌丝的形态和群落的培养特征将单一菌落的内生真菌划分为不同的形态型。最终得到本发明的内生真菌菌株D90，如图1所示，在土豆葡萄糖琼脂培养基(PDA)上26℃黑暗培养，菌株生长速度较快，菌体呈绒毛状，菌落内外分层明显，内圈大部，呈淡绿色，外圈小部，呈白色，于4℃低温保存。
取D90菌株的冻存管，在无菌条件下，用接种针挑取适量菌丝置于新配制的PDA培养基中活化，26℃遮光培养至成熟，用以ITS序列扩增及分子鉴定。采用Takara9770A试剂盒对分离出的内生真菌进行基因组DNA提取。PCR扩增采用引物ITS4(5’-GGAAGTAAAAGTCGTAAGG-3’)和ITS5(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)进行PCR扩增。PCR反应体系(50μL)组成为：模板DNA，2μL；引物ITS4，1μL；引物ITS5，1μL；2×TapPCR MasterMix(含染液)，25μL；ddH2O，21μL。PCR反应循环条件：95℃初始变性3min；94℃变性40s；52℃退火50s；72℃延伸1min；变性-退火-延伸循环35次；最后72℃延伸10min。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后送上海生工生物有限公司进行序列测定。以PCR产物测得序列作为靶序列，在NCBI中的GenBank数据库搜索同源序列，下载与形态型序列最相似的参考序列，用邻接法(Neighbor-joining，NJ)用于系统发育分析，来确定待鉴定菌株的系统发育地位，如图2所示，同果生刺盘孢菌Colletotrichum fructicola(MN841836.1)同源性达99.41％。本发明的内生真菌分类命名为果生刺盘孢菌D90(Colletotrichum fructicola)，于2021年4月9日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.21949。
实施例2：
取D90菌株的冻存管，在无菌条件下，用接种针挑取少许菌丝置于新制的PDA培养基中活化，26℃遮光培养至成熟，用5mm的打孔器打取菌落边缘的菌块，转接于含有50mL的PDB培养基中，于28℃、180r/min的摇床培养一周，四层纱布过滤，除掉菌丝，血球计数板观察，调整孢子浓度为107cfu/mL，即得D90孢子悬浮液；接种病原菌草茎点霉菌Phomaherbarum 48h后，处理组各喷施1mL D90孢子悬浮液和1mL蒸馏水，以等体积的1000倍液代森锰锌和107cfu/mL哈茨木霉为阳性对照，以只喷施蒸馏水为阴性对照，持续4d，每组n＝30。调查统计玄参叶片病斑面积占比及病情指数，用血球计数法检测病原菌数量，并计算病情指数(DI)＝[∑(病级株数×代表数值)/株数总和×发病最高级代表数值]×100。结果如图3和表1所示，发现施用孢子悬浮液可以缓解玄参叶斑病病情，其中玄参叶斑面积(LLA)和病情指数分别为1.923±0.079cm2和22.77％，与叶斑病模型组相比分别降低了45.18％和27.49％。
表1：不同处理组的病情指数
Figure BDA0003228535100000041
取玄参叶斑病病原菌草茎点霉菌Phoma herbarum，用真菌打孔器将成熟菌落打成0.5×0.5cm的菌饼，病原菌放至中心位置，以120°的夹角划线，将内生真菌D90接种至离中心点2cm位置，进行平板对峙试验。结果发现内生真菌D90在离体条件下能有效抑制玄参叶斑病病原菌草茎点霉菌Phoma herbarum，抑制率为83.3±3.0％，如图4所示。
实施例3：
取玄参无菌苗健康叶片，以实施例2相同方式，分别设接种病原菌草茎点霉菌、草茎点霉菌+D90和无菌水的3个处理组，在D90处理后4d采集各处理样本，每组处理取样量0.05g，平行重复三次。叶片采集后，立即装入1.5mL冻存管中，迅速冻存于液氮中，待测。
植物组织匀浆液的制备：(1)取组织块(0.02g-0.05g)，最少可到2-5mg在冰冷的PBS中漂洗，滤纸拭干，称重，置于离心管中；(2)用移液管取遇冷的匀浆介质(0.9％氯化钠溶液)，按重量(g):体积(mL)＝1:4的比例加入装有组织液的离心管中，用剪刀剪碎组织块(在冰上操作)；(3)匀浆的方式选用反复冻融，将装有组织块的离心管置于液氮中30s，然后置于37摄氏度水浴锅中溶解，反复进行4次左右；(4)将制备好的20％植物组织匀浆液用离心机4℃4000转离心10-15min，将离心好的匀浆留上清液弃沉淀进行测定。CAT酶活性的测定：取上述获得的叶片组织匀浆液，采用CAT试剂盒(南京建成生物工程研究所，A064-1)进行检测，每个样本平行重复三次；超氧阴离子含量的测定：取上述获得的叶片组织匀浆液，采用超氧阴离子(O2-)A052试剂盒进行检测(南京建成生物工程所)，每个样本平行重复三次。结果发现D90孢子悬浮液可以提高玄参叶片中植物抗病性增强的指标：CAT酶活性、超氧阴离子含量，说明激发了植物的活性氧免疫反应，可以提供玄参叶片的抗病性。如图5所示。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
序列表
<110> 浙江中医药大学
<120> 一种玄参内生真菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 512
<212> DNA
<213> Colletotrichum fructicola
<400> 1
ctactgctga cgcggagggt cattactgag tttacgctct ataacccttt gtgaacatac 60
ctatcactgt tgcttcggcg ggtagggtct ccgcgaccct cccggcctcc cgcctccggg 120
cgggtcggcg cccgccggag gataaccaaa ctctgattta acgacgtttc ttctgagtgg 180
tacaagcaaa taatcaaaac ttttaacaac ggatctcttg gttctggcat cgatgaagaa 240
cgcagcgaaa tgcgataagt aatgtgaatt gcagaattca gtgaatcatc gaatctttga 300
acgcacattg cgcccgccag cattctggcg ggcatgcctg ttcgagcgtc atttcaaccc 360
tcaagctctg cttggtgttg gggccctaca gctgatgtag gccctcaaag gtagtggcgg 420
accctcccgg agcctccttt gcgtagtaac tttacgtctc gcactgggat ccggagggac 480
tcttgccgta aaacccccca attttccaaa gg 512

Claims (8)

1.一种玄参内生真菌，其特征在于，所述的内生真菌是从玄参科玄参属植物玄参活体中分离所得，分类命名为果生刺盘孢菌（Colletotrichum fructicola）D90，该菌株于2021年4月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCC No. 21949。
2.一种权利要求1所述玄参内生真菌的应用，其特征在于，所述玄参内生真菌D90能抑制玄参叶斑病病原菌生长、缓解玄参叶斑病病情、增强玄参抗病性。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述玄参叶斑病的病原菌为草茎点霉菌（Phoma herbarum）。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，通过内生真菌D90制备的孢子悬浮液按照喷施的方式对玄参发病叶片进行施用能缓解玄参叶斑病病情、增强玄参抗病性。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述孢子悬浮液是按照以下步骤制备：
（1）取所述的内生真菌菌种，在无菌条件下，用接种针挑取菌丝，接入已灭菌的PDA培养基中，于26 ℃，65%湿度条件下进行暗培养7 d；
（2）无菌条件下，用已灭菌的5 mm打孔器打取菌落边缘的菌块，转接于含有50 mL的PDB培养基中，于26 ℃，180 rpm的摇床培养7 d，过滤，除掉菌丝，血球计数板观察，调整孢子浓度为107 cfu/mL，即得。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述PDA培养基的配方是：土豆200 g，葡萄糖20 g，琼脂15 g，蒸馏水1000 mL，pH自然，PDB培养基的配方是：土豆200 g，葡萄糖20 g，蒸馏水1000 mL，pH自然。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述孢子悬浮液的施用量为1 mL/次/d，持续4 d。
8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，缓解玄参叶斑病病情、增强玄参抗病性表现为病情指数下降及超氧阴离子、过氧化氢酶含量的积累，病情指数（DI）采用公式DI=[Σ(病级株数×代表数值)/株数总和×发病最高级代表数值]×100计算。
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