CN110129239B - 具有多种防病作用的贝莱斯芽孢杆菌及其应用、生防菌剂 - Google Patents
具有多种防病作用的贝莱斯芽孢杆菌及其应用、生防菌剂 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及具有多种防病作用的贝莱斯芽孢杆菌及其应用、生防菌剂，属于植物病害防治技术领域。本发明中从新疆野苹果健康枝条中分离筛选到1株具抑菌活性的贝莱斯芽孢杆菌MS012；其对葡萄座腔菌、胶孢炭疽菌、苹果拟茎点霉、小麦纹枯病菌、小麦全蚀病菌、番茄灰霉病菌、小麦赤霉病菌、君子兰茎基腐病菌、南天竹炭疽病菌以及解淀粉欧文氏菌都具有均具有显著的拮抗作用，抑菌对象具广谱性；为苹果树等植物病害的生物防治提供了新的微生物资源。
Description
技术领域
本发明涉及具有多种防病作用的贝莱斯芽孢杆菌及其应用、生防菌剂，属于植物病害防治技术领域。
背景技术
目前，应用的生防菌主要包括芽孢杆菌(Bacillus spp.)、假单胞杆菌(Pseudomonas spp.)、链霉菌(Streptomyces spp.)以及其它一些有益细菌，其中芽孢杆菌的应用最广泛。芽孢杆菌广泛存在于空气、水和土壤等环境中，广泛应用于植物病害的生物防治，通过产生抑菌蛋白或抗菌肽等发挥其生防作用。例如，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)F3能够产生一种抑制桃褐腐病菌(Monilinia fructicola)的抗菌蛋白(ZhaoXY,Zhao XM,Wei YM,Shang QX,Liu ZP.isolation and identification of a novelantifungal protein from a rhizobacterium Bacillus subtilis strain F3.Journalof Phytopathology,2012,161(1):43-48.)；蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)能够对梨黑斑病菌(Altrnaria alternata)和柑橘绿霉菌(Penicillium digitatum)具有较强的抑菌活性(Yehia HM,Salmen SH,Alharbi SA,Khiyami MA,Wainwright M,Alharbi NS,Chinnathambi A.Antifungal protein 35kDa produced by Bacillus cereus inhibitsthe growth of some molds and yeasts.Journal of Pure and Applied Microbiology,2013,7:401-406.)；张荣胜等利用解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefuciens)防治水稻条斑病，防效为60％以上(张荣胜,陈思宇,王晓宇,罗楚平,刘永锋,陈志谊.解淀粉芽胞杆菌Lx-11防治水稻细菌性条斑病应用技术研究.中国生物防治学报,2013,29(4):595-600.)。
贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)作为一种新型的生防芽孢杆菌，由Ruiz-García等发现并命名(Ruiz-García C,Béjar V,Martínez-Checa F,Llamas I,QuesadaE.Bacillus velezensis sp.nov.,a surfactant-producing bacterium isolated fromthe river Vélez in Málaga,southern Spain.International Journal of Systematicand Evolutionary Microbiology,2005,55(1):191-195.)。已有的报道显示，贝莱斯芽孢杆菌能够对棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae Kleb)(王伟,李术娜,李红亚,王全,朱宝成.大丽轮枝菌拮抗细菌菌株12-51的筛选鉴定与抗菌物性质分析.中国农学通报,2009,25(19):14-19.)、白菜黑斑病菌(Alternaria brassicae)(杜淑涛,李术娜,朱宝成.白菜黑斑病拮抗细菌Bacillus velezensis DL-59的筛选鉴定及田间防效实验.河北农业大学学报,2010,33(6):51-56.)、番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea Pers)(索雅丽,李术娜,李红亚,王全,王树香,朱宝成.番茄灰霉病菌颉颃菌株的筛选及功能基因的分析.中国植保导刊,2010,30(8):7-10.)、兰花枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cattleyae)(连彩,郭晓军,朱宝成,王建明,张超,曹晓璐,姚娜.兰花枯萎病拮抗细菌的筛选与鉴定.华北农学报,2012,27(2):222-225.)、草莓枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.fragariae)(NamMH,Park MS,Kim HG,Yoo SJ.Biological control of strawberry Fusarium wiltcausedby Fusarium oxysporum f.sp.fragariae using Bacillus velezensis BS87 andRK1 formulation.Journal of Microbiology and Biotechnology,2009,19(5):520-524.)、莴苣根腐病菌(Pythium)(Kanjanamaneesathian M,Wiwattanapatapee R,RotniamW,Pengnoo A,Wongpetkhiew W,Tanmala V.Application of a suspension concentrateformulation of Bacillus velezensis to control root rot of hydroponically-grown vegetables.New Zealand Plant Protection,2013,66:229-234.)以及小麦全蚀病菌(Gaeumannomyces graminis var.tritic)(Chen L,Heng JY,Qin SY,Bian K.Acomprehensive understanding of the biocontrol potential of Bacillusvelezensis LM2303 against Fusarium head blight.PLoS One,2018,13(6):e0198560.)等多种植物病原菌具有拮抗作用。贝莱斯芽孢杆菌产生的次生代谢产物主要包括脂肽类和聚酮类化合物，脂肽类和聚酮类化合物的合成功能基因有srfAA、bmyB、ituC和fenD等(索雅丽等，2010)。
目前，关于贝莱斯芽孢杆菌对果树等多种病害同时具有拮抗防治作用的报道较少。
发明内容
本发明的目的是提供具有多种防病作用的贝莱斯芽孢杆菌，该菌株能够拮抗10种植物病原菌。
本发明还提供了上述贝莱斯芽孢杆菌的应用，为植物病害的防治提供了一种新的途径。
本发明还提供了具有多种防病作用的生防菌剂，其能够抑制植物病害的发生。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
具有多种防病作用的贝莱斯芽孢杆菌，该菌株为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)MS012，保藏编号为CCTCC NO:M 2019267。
本发明中从新疆野苹果(Malus sieversii)健康枝条中分离筛选到1株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)MS012；其对多种植物病原菌具有特异的拮抗作用，为苹果树等植物病害的生物防治提供了新的微生物资源。
上述的具有多种防病作用的贝莱斯芽孢杆菌在拮抗植物致病菌中的应用。具体的，所述植物致病菌为葡萄座腔菌、胶孢炭疽菌、和/或苹果拟茎点霉。
本发明中通过实验发现贝莱斯芽孢杆菌MS012对葡萄座腔菌的抑菌率为83.62±1.31％，对胶孢炭疽菌的抑菌率为76.78±6.26％，对苹果拟茎点霉的抑菌率达到80.30±2.00％，能很好的抑制3种苹果枝干病害病原菌菌丝的生长。
具体的，所述植物致病菌为小麦纹枯病菌、小麦全蚀病菌、番茄灰霉病菌、小麦赤霉病菌、君子兰茎基腐病菌、和/或南天竹炭疽病菌。
本发明中通过实验发现贝莱斯芽孢杆菌MS012对南天竹炭疽病菌抑菌率为91.17％，对番茄灰霉病菌抑菌率为84.72％，对小麦纹枯病菌、小麦全蚀病菌、君子兰茎基腐病菌、小麦赤霉病菌抑菌率分别为78.27％、77.88％、64.79％和18.69％，对6种植物病原菌生长均具有抑制作用。
具体的，所述植物致病菌为解淀粉欧文氏菌。发明中通过实验发现贝莱斯芽孢杆菌MS012对解淀粉欧文氏菌具有明显的抑制作用，因此可以用于拮抗解淀粉欧文氏菌。
一种具有多种防病作用的生防菌剂，包括生防菌和辅料，所述生防菌为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)MS012，保藏编号为CCTCC NO:M 2019267。
本发明中的贝莱斯芽孢杆菌MS012能够拮抗植物病原菌，因此可以添加其他辅料作为生防菌剂使用。
附图说明
图1为本发明试验例2中贝莱斯芽孢杆菌MS012对葡萄座腔菌平板对峙结果图；
图2为本发明试验例2中贝莱斯芽孢杆菌MS012对胶孢炭疽菌平板对峙结果图；
图3为本发明试验例2中贝莱斯芽孢杆菌MS012对苹果拟茎点霉平板对峙结果图；
图4为本发明试验例4中贝莱斯芽孢杆菌MS012对南天竹炭疽病菌平板对峙结果图；
图5为本发明试验例4中贝莱斯芽孢杆菌MS012对番茄灰霉病菌平板对峙结果图；
图6为本发明试验例4中贝莱斯芽孢杆菌MS012对小麦纹枯病菌平板对峙结果图；
图7为本发明试验例4中贝莱斯芽孢杆菌MS012对小麦全蚀病菌平板对峙结果图；
图8为本发明试验例4中贝莱斯芽孢杆菌MS012对君子兰茎基腐病菌平板对峙结果图；
图9为本发明试验例4中贝莱斯芽孢杆菌MS012对小麦赤霉病菌平板对峙结果图；
图10为本发明试验例5中贝莱斯芽孢杆菌MS012对解淀粉欧文氏菌的平板抑制图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。除特殊说明的之外，各实施例及试验例中所用的设备和试剂均可从商业途径得到。以下试验例中使用的供试病原菌有葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)、胶孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)、苹果拟茎点霉(Phomopsis mali)、小麦纹枯病菌(Rhizoctoniacerealis)、小麦全蚀病菌(Gaeumannomyces graminis)、番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)、小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、君子兰茎基腐病菌(Fusariumoxysporum)、南天竹炭疽病菌(Colletotrichum karstii)、解淀粉欧文氏菌(Erwiniaamylovora)。
其中葡萄座腔菌、胶孢炭疽菌、苹果拟茎点霉，以及小麦纹枯病菌病菌、小麦全蚀病菌、番茄灰霉病菌、小麦赤霉病菌、君子兰茎基腐病菌、南天竹炭疽病菌均由本发明团队采集于洛阳市大田发病植株，纯化分离后通过科赫氏法则验证，经微观形态观察和分子生物学鉴定，现保存于河南科技大学林学院林业生物技术实验室。解淀粉欧文氏菌(Erwiniaamylovora)菌株由洛阳市出入境检验检疫局技术中心提供。
葡萄座腔菌、胶孢炭疽菌、苹果拟茎点霉，君子兰茎基腐病菌、南天竹炭疽病菌的ITS rDNA序列被克隆测序，已提交Genbank数据库，对应的序列号分别为：MH250045、MH156052、MH250047、MF471668、KX987162。小麦纹枯病菌、小麦全蚀病菌、番茄灰霉病菌、小麦赤霉病菌的ITS rDNA序列被克隆测序，暂未提交Genbank数据库，对应的序列分别如SEQID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。
具有多种防病作用的贝莱斯芽孢杆菌的实施例1
本实施例中具有多种防病作用的贝莱斯芽孢杆菌，该菌株为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)MS012，保藏编号为CCTCC NO:M 2019267；保藏日期：2019年04月17日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉.武汉大学(湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心)。
具有多种防病作用的贝莱斯芽孢杆菌在拮抗植物致病菌中的应用的实施例1
本实施例中所用的菌株为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)MS012，保藏编号为CCTCC NO:M 2019267。植物致病菌为葡萄座腔菌、胶孢炭疽菌、和/或苹果拟茎点霉。
具有多种防病作用的贝莱斯芽孢杆菌在拮抗植物致病菌中的应用的实施例2
本实施例中所用的菌株为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)MS012，保藏编号为CCTCC NO:M 2019267。植物致病菌为小麦纹枯病菌、小麦全蚀病菌、番茄灰霉病菌、小麦赤霉病菌、君子兰茎基腐病菌、和/或南天竹炭疽病菌。
具有多种防病作用的贝莱斯芽孢杆菌在拮抗植物致病菌中的应用的实施例3
本实施例中所用的菌株为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)MS012，保藏编号为CCTCC NO:M 2019267。植物致病菌为解淀粉欧文氏菌。
具有多种防病作用的生防菌剂的实施例1
本实施例中的具有多种防病作用的生防菌剂，包括生防菌和辅料，所述生防菌为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)MS012，保藏编号为CCTCC NO:M 2019267。辅料可以是本领域常用的辅料。
试验例1
本发明从新疆野苹果(Malus sieversii)健康枝条中分离筛选到1株贝莱斯芽孢杆菌MS012，为苹果树等植物病害的生物防治提供了新的微生物资源。
1、贝莱斯芽孢杆菌MS012形态特征
贝莱斯芽孢杆菌MS012在NA培养基和PDA培养基上28℃恒温培养2d，观察记录菌落形态(如表1所示)。菌体为杆状，有芽孢，周生鞭毛。
表1贝莱斯芽孢杆菌MS012菌落特征
2、贝莱斯芽孢杆菌MS012生理生化特征
贝莱斯芽孢杆菌MS012的生理生化特征见表2。
表2贝莱斯芽孢杆菌MS012生理生化特征
注：+表示阳性；一表示阴性。
试验例2贝莱斯芽孢杆菌MS012对3种苹果病原的抑菌活性测定
采用平板对峙方法，检测贝莱斯芽孢杆菌MS012的抑菌作用。将MS012接种于PDA液体培养基中，28℃、180r·min-1振荡培养24h备用。采用平板对峙法，以葡萄座腔菌、胶孢炭疽菌、苹果拟茎点霉3种病原菌为供试菌，用打孔器分别打取7mm菌饼接种于PDA平板中央，在距离菌饼25mm处等距离取4个点放置4mm直径的无菌滤纸圆片，每个滤纸片添加MS012菌液3μL。以添加3μL无菌水做为对照。28℃培养当对照病原菌菌丝长满培养皿时，记录抑菌对峙处理中病原菌直径并拍照。抑菌率＝[(对照菌落半径-处理菌落半径)/(对照菌落半径-菌饼半径)]×100％。
平板对峙法检测贝莱斯芽孢杆菌MS012对3种苹果病原菌的抑菌作用(图1-图3，左侧照片为对照病原，右侧照片为MS012对病原抑制效果)。菌株MS012对葡萄座腔菌的抑菌率为83.62±1.31％(见图1)；对胶孢炭疽菌的抑菌率为76.78±6.26％(见图2)；对苹果拟茎点霉的抑菌率为80.30±2.00％(见图3)。
试验例3贝莱斯芽孢杆菌MS012对苹果枝条无致病性
选择健康的红富士苹果两年生枝条，截成40cm长的枝段，经75％酒精表面消毒，无菌水冲洗3次，自然晾干后顶端用石蜡封顶。每个枝条作3处烫伤，将筛选出的内生细菌菌株10μL(108cfu/mL)滴于烫伤处。待菌液自然晾干后，用无菌湿润的脱脂棉附在伤口处，保鲜膜包裹，下端插入自来水中，于28℃培养箱中培养，湿度不低于80％。伤口滴加10μL无菌水作为阴性对照，伤口放置苹果拟茎点霉菌饼的作为阳性对照。观察接种部位发病情况，25d后统计枝条伤口发病数量，计算发病率，发病率＝(发病伤口数/总的伤口数)×100％。对筛选出抑菌作用强的7株内生细菌进行致病性分析，阳性对照发病率为100％，阴性对照组和菌株MS012发病率为0，结果证实贝莱斯芽孢杆菌MS012对苹果枝条不具有致病性。
试验例4贝莱斯芽孢杆菌MS012具有抑菌广谱性
将MS012接种于PDA液体培养基中，28℃、180r·min-1振荡培养24h备用。采用平板对峙法，以小麦纹枯病菌、小麦全蚀病菌、番茄灰霉病菌、小麦赤霉病菌、君子兰茎基腐病菌、南天竹炭疽病菌6种病原菌为指示菌，用打孔器分别打取7mm菌饼接种于PDA平板中央，在距离菌饼25mm处等距离取4个点放置4mm直径的无菌滤纸圆片，每个滤纸片添加MS012菌液3uL。以添加3uL无菌水做为对照。28℃培养当对照病原菌菌丝长满培养皿时，记录抑菌对峙处理中病原菌直径并拍照。
结果如图4-9所示，左侧照片为对照病原，右侧照片为MS012对病原抑制效果；结果表明，贝莱斯芽孢杆菌MS012具有广泛的抑菌谱，对南天竹炭疽病菌病菌抑菌率为91.17％(见图4)，对番茄灰霉病菌抑菌率为84.72％(见图5)，对小麦纹枯病菌、小麦全蚀病菌、君子兰茎基腐病菌、小麦赤霉病菌抑菌率分别为78.27％(见图6)、77.88％(见图7)、64.79％(见图8)和18.69％(见图9)。MS012对多种植物病原菌表现出具有良好的抑菌活性，该菌株抑菌具有广谱性。
试验例5贝莱斯芽孢杆菌MS012对解淀粉欧文氏菌抑菌作用强
解淀粉欧文氏菌在NA培养基中28℃、180r·min-1振荡培养至OD值1.0，取100μL菌液涂布到NA固体培养基上。每个固体培养基平板表明放置3个4mm直径的无菌滤纸片，设置3皿重复。贝莱斯芽孢杆菌MS012在NA培养基中28℃、180r·min-1振荡培养至OD值2.0，取3μL菌液加到每个滤纸片上。取3μL无菌水加到每个滤纸片上做为空白对照。平板放置28℃培养箱中，滤纸片周围出现明显的抑菌圈(见图10，左侧照片为空白对照，右侧照片为MS012产生的明显抑菌圈)，24h后十字交叉法测量抑菌圈的直径，统计抑菌圈直径平均统计为15.2mm。结果表明，贝莱斯芽孢杆菌MS012对解淀粉欧文氏菌抑菌作用强。
<110> 河南科技大学
<120> 具有多种防病作用的贝莱斯芽孢杆菌及其应用、生防菌剂
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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Claims (3)
1.具有多种防病作用的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis），其特征在于：该菌株为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）MS012，保藏编号为CCTCC NO:M 2019267。
2.如权利要求1所述的具有多种防病作用的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）在拮抗植物致病菌中的应用，所述植物致病菌为葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）、胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）和/或苹果拟茎点霉（Phomopsis mali）；或所述植物致病菌为小麦纹枯病菌（Rhizoctonia cerealis）、小麦全蚀病菌（Gaeumannomyces graminis）、君子兰茎基腐病菌（Fusarium oxysporum）和/或南天竹炭疽病菌（Colletotrichum karstii）。
3.一种具有多种防病作用的生防菌剂，其特征在于：包括生防菌和辅料，所述生防菌为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）MS012，保藏编号为CCTCC NO:M 2019267。
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