CN118256358A - 植物内生真菌阿达青霉jsnl-zj87菌株、生防菌剂及其应用 - Google Patents
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- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/30—Microbial fungi; Substances produced thereby or obtained therefrom
- A01N63/36—Penicillium
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01P—BIOCIDAL, PEST REPELLANT, PEST ATTRACTANT OR PLANT GROWTH REGULATORY ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR PREPARATIONS
- A01P3/00—Fungicides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
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Abstract
本发明属于植物病害生防技术领域，公开了一种植物内生菌阿达青霉菌株、生防菌剂及其应用，所述阿达青霉菌株命名为阿达青霉(Penicillium adametzii)JSNL‑ZJ87，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.40489。该菌株具有显著抑制多种植物病原菌和促进植物生长的能力，病原菌包括灰葡萄孢菌、终极腐霉、旋柄腐霉、刺腐霉、畸雌腐霉、瓜果腐霉、茄腐镰刀菌、尖孢镰刀菌、暹罗炭疽菌、胶孢炭疽菌、大豆疫霉和立枯丝核菌中的一种或多种，适用于植物病害生物防治，可用于生产具有防治多种植物病害的生物杀菌剂产品。
Description
技术领域
本发明属于植物病害生防技术领域，涉及植物内生真菌阿达青霉JSNL-ZJ87菌株、生防菌剂及其应用。
背景技术
灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)引起的灰霉病是一种重要的植物病害，该病原菌可侵染草莓、葡萄、黄瓜、番茄、韭菜、辣椒、蓝莓、丝瓜等1200多种植物。灰霉病分布广、扩展速度快、危害严重，给全球果蔬的产量和品质带来巨大损失，在全球十大植物病害中排名第二位。以草莓灰霉病为例，灰霉病是草莓开花后危害最严重的一种真菌性病害，该病害主要侵染果实，也侵染叶片、果梗、花萼、花瓣及叶柄，造成花及果实腐烂，感病品种的病果率一般在30％-60％，严重的情况下甚至绝收，给草莓生产造成巨大的损失。
根腐病是一种危害严重的世界性土传植物根部病害，其病原菌种类较多，国内外已报道的病原菌有：腐霉属(Pythium spp.)、镰刀菌属(Fusa rium spp.)、丝核菌属(Rhizoctonia sp.)、炭疽菌属(Colletotrichum sp.)、拟盘多毛孢属(Pestalotiopsissp.)、疫霉属(Phytophthora sp.)和大茎点霉属(Macrophoma sp.)等。植物根腐病的发病率高，病原菌较活跃，极易在株间传播，防治困难，易造成植物大面积死亡，具有“植物癌症”之称。目前在生产中只能预防，暂无有效根治手段，因此植物根腐病也成为世界各地面临的较为棘手的病害。
现有技术中植物灰霉病和根腐病的防治主要包括以下方式：1、选育抗病品种，该方式是防控植物灰霉病和根腐病最经济有效的途径，但由于引起该病害的病原菌寄主范围广、产孢量大、繁殖速度快、致病群体复杂，致使品种抗性容易丧失，育种困难。2、化学防治，该方式虽然能够在一定程度上防治植物灰霉病和根腐病，但是大量使用化学药剂给生态环境和食品安全带来极大威胁，还会导致病原菌抗药性不断增强，出现农药防治无效的现象。
植物内生菌被定义为生活在植物组织内但不会引起疾病症状的微生物，是影响植物生长、营养和健康的关键因素之一，可以帮助植物获得营养物质，抑制植物病原菌以及抵抗生物和非生物胁迫。由于植物内生真菌来源于植物，对植物安全、对环境友好且不易产生抗药性，使用这些微生物防治植物病害有利于保持生态平衡。因此，植物内生真菌是促进有机农业的新型化合物的来源。
综上所述，现有技术还缺少一种预防植物灰霉病和根腐病的绿色、高效的益生菌。
发明内容
针对上述存在的问题，本发明提供了一种能够有效防治植物灰霉病和根腐病的生防菌阿达青霉(Penicillium adametzii)JSNL-ZJ87及其应用。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
第一方面，本发明提供了一种植物内生真菌JSNL-ZJ87，所述植物内生真菌JSNL-ZJ87的分类命名为阿达青霉(Penicillium adametzii)，分离自镇江市句容市边城镇健康草莓根部。该菌株已于2023年01月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC NO.40489，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
第二方面，本发明还提供了一种植物灰霉病和根腐病的生防菌剂，所述生防菌剂的活性成分包括所述的植物内生真菌JSNL-ZJ87的菌丝或分生孢子、或胞外分泌物。
第三方面，本发明还提供了一种所述的生防菌剂的制备方法，所述制备方法包括，将所述的保藏号为CGMCC NO.40489的植物内生真菌JSNL-ZJ87接种在无菌培养基中置于22-28℃黑暗条件下培养数天。
第四方面，本发明还提供了一种防治植物灰霉病和根腐病的微生物农药，所述微生物农药的活性成分包含第一方面所述的植物内生真菌JSNL-ZJ87或第二方面所述的生防菌剂。
第五方面，本发明还提供了第一方面所述的植物内生真菌JSNL-ZJ87、第二方面所述的生防菌剂或第四方面所述的微生物农药在抑制病原菌生长中的应用，其特征在于，所述病原菌为灰葡萄孢菌、终极腐霉、旋柄腐霉、刺腐霉、畸雌腐霉、瓜果腐霉、茄腐镰刀菌、尖孢镰刀菌、暹罗炭疽菌、胶孢炭疽菌、大豆疫霉和立枯丝核菌中的一种或多种。
第六方面，本发明还提供了第一方面所述的植物内生真菌JSNL-ZJ87、第二方面所述的生防菌剂或第四方面所述的微生物农药在防治灰霉病和根腐病中的应用。
在某些实施例中，所述灰霉病为草莓灰霉病，所述根腐病为草莓根腐病、大豆根腐病。
在某些实施例中，所述灰霉病为由灰葡萄孢菌引起的灰霉病。
在某些实施例中，所述根腐病为豆科、草莓、瓜类、茄科、香蕉、棉、大白菜及花卉等多种植物的根腐病，优选地所述根腐病为草莓根腐病、大豆根腐病。
在某些实施例中，所述根腐病包括由病原菌终极腐霉、旋柄腐霉、刺腐霉、畸雌腐霉、瓜果腐霉、茄腐镰刀菌、尖孢镰刀菌、暹罗炭疽菌、胶孢炭疽菌、大豆疫霉和立枯丝核菌中的一种或多种引起的根腐病。
第七方面，本发明还提供了一种灰霉病和根腐病的防治方法，所述方法包括向植物生长环境中施用第一方面所述的植物内生真菌JSNL-ZJ87、第二方面所述的生防菌剂或第四方面所述的微生物农药。
在某些实施例中，所述植物生长环境为植物苗下胚轴生长处、根部或叶部。
在某些实施例中，所述植物优选为草莓或大豆。
与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：
1)本发明提供的生防菌阿达青霉(Penicillium adametzii)JSNL-ZJ87能够显著抑制病原菌灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、终极腐霉(Pythium ultimum)、旋柄腐霉(P.helicoides)、刺腐霉(P.spinosum)、畸雌腐霉(P.irregulare)、瓜果腐霉(P.aphanidermatum)、茄腐镰刀菌(Fusarium solani)、尖孢镰刀菌(F.oxysporum)、暹罗炭疽菌(Colletotrichum siamense)、胶孢炭疽菌(C.gloeosporioides)、大豆疫霉(Phytophthora sojae)和立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)的菌丝生长。
2)本发明提供的生防菌阿达青霉(Penicillium adametzii)JSNL-ZJ87能够明显降低草莓灰霉病和大豆根腐病的病害严重度，其出芽率、株高和鲜重等生长指标显著提高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为实施例1中阿达青霉(Penicillium adametzii)JSNL-ZJ87对不同病原菌的拮抗效果图；
图2为实施例1中阿达青霉(Penicillium adametzii)JSNL-ZJ87对不同病原菌的抑制活性；
图3为实施例2中阿达青霉(Penicillium adametzii)JSNL-ZJ87胞外代谢物对不同病原菌的影响；
图4为实施例3中阿达青霉(Penicillium adametzii)JSNL-ZJ87对大豆植株生长的影响；
图5为实施例4中阿达青霉(Penicillium adametzii)JSNL-ZJ87对Botrytiscinerea导致的草莓灰霉病的影响；
图6为实施例4中阿达青霉(Penicillium adametzii)JSNL-ZJ87对Pythiumultimum导致的大豆根腐病的影响；
图7为实施例4中阿达青霉(Penicillium adametzii)JSNL-ZJ87对Pythiumultimum导致的大豆根腐病的株高、出芽数量的影响。
图8为实施例4中阿达青霉(Penicillium adametzii)JSNL-ZJ87对Pythiumultimum导致的大豆根腐病的影响。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。
如本发明中所述，术语“生防菌”指有益微生物，可以防治植物病害，主要有细菌、真菌和放线菌。
如本发明中所述，术语“灰葡萄孢菌”分类地位：真菌界(Fungi)、子囊菌门(Ascomycota)、锤舌菌纲(Leotiomycete)、柔膜菌目(Helotial es)、核盘菌科(Sclerotiniaceae)、孢盘菌属(Botryotinia)。宿主范围广泛，可侵染豆科、蔷薇科、菊科、葫芦科、茄科、石蒜科和百合科等植物，在发病部位形成灰黑色霉层，给全球果蔬的产量和品质带来巨大损失。
如本发明中所述，术语“终极腐霉”“旋柄腐霉”“刺腐霉”“畸雌腐霉”“瓜果腐霉”分类地位：藻物界(Chromista)、卵菌门(Oomycota)、霜霉目(Peronosporales)、腐霉科(Pythiacea)、腐霉属(Pythium)。主要通过土壤传播并具有广泛的宿主范围，可侵染豆科、菊科、葫芦科、茄科和蔷薇科植物。它们通常侵染幼苗的根和种子，并引起猝倒、种子腐烂、根腐和果实腐烂等症状，造成严重的农业经济损失。
如本发明中所述，术语“暹罗炭疽菌”“胶孢炭疽菌”分类地位：真菌门(Eumycota)、半知菌亚门(Deuteromyeotina)、腔孢纲(Coelomyce tes)、黑盘孢目(Melanconiales)、黑盘孢科(Melanconiaceae)、炭疽属(Colletotrichum)。在世界范围内广泛分布，种类多，可侵染花卉、果树、蔬菜、大田作物等。侵染草莓后会产生根冠腐烂的现象，随着病情扩展，也会在植株匍匐茎、叶片、叶柄、花和果实上表现出发病现象。
如本发明中所述，术语“尖孢镰刀菌”“茄腐镰刀菌”属半知菌类(Imperfectifungi)、从梗孢目(Moniliales)、瘤座孢科(Tuberculariaceae)、镰刀菌属(Fusarium)，是一种世界性分布的土传病原真菌，寄主范围广泛，可引起豆科、草莓、瓜类、茄科、香蕉、棉、大白菜及花卉等多种植物根腐病的发生。
如本发明中所述，术语“大豆疫霉”分类地位：藻物界(Chromista)、卵菌门(Oomycota)、霜霉目(Peronosporales)、黑盘孢科(Melanconiac eae)、疫霉属(Phytophthora)。主要分布在美国、加拿大、巴西、阿根廷、日本、澳大利亚、英国、匈牙利、尼日利亚、印度、中国、埃及、以色列、南非、德国、瑞士、新西兰等国家。大豆疫霉引起的大豆疫霉根腐病在世界各地大豆种植区广泛发生，造成大量的经济损失。
如本发明中所述，术语“立枯丝核菌”属半知菌类(Imperfecti fungi)、无孢目(Agonomycetales)、无孢科(Agonomycetaceae)、丝核菌属(Rhi zoctonia)，是一种寄主范围广、腐生性强、全世界广泛分布的植物土传病原真菌。
实施例1阿达青霉(Penicillium adametzii)JSNL-ZJ87的筛选
1、分离潜在的生防菌
1.1、获取试验材料：从田间(江苏农博园)选取长势良好的健康草莓植株，取其根部组织。
1.2、草莓根部内生真菌的分离及培养：剪取草莓根部组织，混匀，称取2g，进行表面消毒。为确保清除所有附生微生物，加入100mL无菌水和2滴吐温20，25℃、220rpm震荡20min，无菌水处理20s，70％(v/v)乙醇浸泡30s，2.5％(v/v)次氯酸钠溶液浸泡2min，最后用无菌水冲洗3-4遍，用无菌吸水纸吸干表面水分。在无菌条件下将根系进一步剪成较小的小段(约0.3cm)，每个样品随机选取5段放置在含有氨苄(50mg/L)和利福平(50mg/L)的PDA平板培养基上。将培养皿密封，25℃、黑暗条件下培养1-2d。当菌丝体从叶片组织中出现时，将生长在培养基边缘的小块培养基连同菌丝体一起小心地转移到一个新的PDA平板上。
2、平板对峙法筛选拮抗菌
采用PDA平板对峙法，在直径9cm的含有15mL的PDA培养基平板距离边缘2cm处分别对称接种培养3-5d的灰霉病病原菌、根腐病病原菌菌株菌饼(直径5mm)和供试内生真菌菌饼(直径5mm)，以只接种灰霉病病原菌、根腐病病原菌菌株菌饼的平板作为对照。置于25℃、黑暗条件下培养。5-10d后测量各根腐病病原菌菌落半径并计算抑制率。抑制率按照公式计算：抑制率＝(对照组菌落半径-处理组菌落半径)/对照组菌落半径×100％。
最终筛选得到1株在平板上对灰霉病和根腐病病原菌均有很好拮抗活性的菌株，具体表现为强烈的抑制病原菌菌丝生长，编号为JSNL-ZJ87。
如图1所示，与对照相比，实验组各病原菌菌株的菌落明显更小，JSN L-ZJ87对灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、终极腐霉(Pythium ultimum)、旋柄腐霉(P.helicoides)、刺腐霉(P.spinosum)、畸雌腐霉(P.irregul are)、瓜果腐霉(P.aphanidermatum)、茄腐镰刀菌(Fusarium solani)、尖孢镰刀菌(F.oxysporum)、暹罗炭疽菌(Colletotrichumsiamense)、胶孢炭疽菌(C.gloeosporioides)、大豆疫霉(Phytophthora sojae)和立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)的抑制率分别为61.88％、75.81％、70.81％、75.64％、74.19％、52.21％、66.89％、57.84、50.38％、56.41、58.67％和54.82％，说明上述灰霉病和根腐病病原菌的菌丝生长均受到了抑制。
如图2所示，光学显微观察结果显示：对照组病原菌菌丝外形规则，内含物在菌丝细胞壁内分布均一、生长顺直；与JSNL-ZJ87对峙培养后，B.cinerea、F.solani、F.oxysporum、C.gloeosporioides和R.solani菌丝内部物质凝聚、较混乱分布，菌丝粗细不均变畸形，不能正常生长。
3、筛选所得菌株的分子生物学鉴定
3.1、采用TIANGEN公司的试剂盒(DP320-03)提取菌株JSNL-ZJ87的基因组DNA。
3.2、分别扩增基因组DNA的ITS基因和BenA基因。DNA扩增采用30μL的反应体积，包含15μL 2×EasyTaq PCR SuperMix(+dye)，引物F/R各1μL(10μM)，2μL模板DNA和11μLddH2O，PCR扩增程序条件如下：94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火45s，72℃延伸60s，共35个循环；最后72℃延伸10min。
3.3、扩增所得PCR产物经过1％琼脂糖凝胶电泳后，紫外灯下观察，将有目标条带的PCR产物送至上海生工生物有限公司测序，测序结果为：步骤2筛选得到的菌株JSNL-ZJ87的ITS基因序列为SEQ ID NO.1，Ben A基因序列为SEQ ID NO.2。
3.4、在NCBI数据库网站上比对SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2两条序列。比对结果如表1所示。根据表1结果可以推定本发明的生防菌JSNL-ZJ87为Penicillium adametzii，命名为阿达青霉(Penicillium adametzii)JSNL-ZJ87。
表1SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2序列比对结果
实施例2阿达青霉(Penicillium adametzii)JSNL-ZJ87胞外代谢物对灰霉病和根腐病病原菌的影响
1、将灰葡萄孢菌(B.cinerea)、终极腐霉(P.ultimum)、旋柄腐霉(P.helicoides)、刺腐霉(P.spinosum)、畸雌腐霉(P.irregulare)、茄腐镰刀菌(F.solani)、尖孢镰刀菌(F.oxysporum)、暹罗炭疽菌(C.siamense)、胶孢炭疽菌(C.gloeosporioides)与阿达青霉(Penicillium adametzii)JSNL-ZJ87分别接种于直径9cm的含有15mLPDA培养基的培养皿中，置于25℃培养箱，避光培养3-5d。用打孔器(直径5mm)在菌落边缘打孔，制备菌碟。
2、菌株JSNL-ZJ87分泌的胞外代谢物的获取
在直径6cm的PDA培养基平板上覆上一层水系滤膜(孔径0.22μm，直径5cm)，使滤膜与PDA平板表面紧贴。随后在滤膜上接阿达青霉(Penicillium adametzii)JSNL-ZJ87菌碟(直径5mm)，对照用空白PDA培养基代替JSNL-ZJ87菌碟(直径5mm)，25℃黑暗条件下培养。
3、培养2d后用镊子小心将滤膜连同其上阿达青霉(Penicillium adametzii)JSNL-ZJ87培养物移除，对照撕掉滤膜和空白PDA块，制得含JSNL-ZJ87胞外代谢物的平板和空白PDA平板。
4、在超净工作台中用接种针挑取各病原菌菌碟(直径5mm)接种于上述制得的平板中，注意菌丝面朝下，各设3个重复。
5、将接种后的平板放入25℃培养箱，避光培养2-3d，用十字交叉法测量菌落大小。抑制率按照公式计算：抑制率＝(对照组菌落直径-处理组菌落直径)/对照组菌落直径×100％。
结果如图3所示，与对照相比，实验组各病原菌菌株的菌落明显更小，菌株JSNL-ZJ87分泌的胞外代谢物对Pythium ultimum、P.spinosum、P.irregulare和P.helicoides的抑制率均达到了100％，对F.solani、Botrytis cinerea、C.gloeosporioides、F.oxysporum和C.siamense的抑制率分别为57.78％、47.37％、32.35％、36.72％和30.69％，说明JSNL-ZJ87分泌的胞外代谢物对上述病原菌的菌丝生长均有一定的抑制作用。
实施例3阿达青霉(Penicillium adametzii)JSNL-ZJ87对植物自身生长的影响
1、将菌株JSNL-ZJ87接种于直径9cm的培养皿中(内含15ml PDA培养基)，25℃、避光培养7d。
2、选择直径为12cm的盆钵，将培养7天的阿达青霉(Penicillium adametzii)JSNL-ZJ87的培养基切成0.5cm×0.5cm的平板块。试验设置2组，对照组为：每个盆钵加入2个0.5cm×0.5cm的PDA平板块；实验组为：每个盆钵加入2个0.5cm×0.5cm的阿达青霉(Penicillium adametzii)JSNL-ZJ87的平板块。用无菌水和灭菌的蛭石将各种平板块混合均匀，加入盆钵到1/3处，每盆均匀撒布10颗大豆种子(中黄37)，再覆盖一层薄的菌丝块与蛭石的混合物。每个处理设置3个重复。
3、用无菌水隔天浇灌各组大豆，10d后统计其发芽率、株高和鲜重。
结果如图4和表2所示。
表2大豆出苗率、株高及鲜重统计结果
其中，表中出苗率、株高和鲜重的数值表达方式为：平均值±标准误差。
从图4和表2数据可知，实验组的株高和鲜重明显优于对照组，可见阿达青霉(Penicillium adametzii)JSNL-ZJ87对大豆植株存在促生作用。
实施例4阿达青霉(Penicillium adametzii)JSNL-ZJ87对由B.cinerea引起的草莓灰霉病、由P.irregulare引起的草莓根腐病和由P.ultimum引起的大豆根腐病的影响
1、菌株JSNL-ZJ87诱导草莓对灰霉病产生抗性
1.1、将阿达青霉(Penicillium adametzii)JSNL-ZJ87和B.cinerea分别接种于直径9cm的含有15mLPDA培养基的培养皿中，置于25℃培养箱，避光培养5d。用打孔器(直径5mm)在B.cinerea和JSNL-ZJ87菌落边缘打孔，制备菌碟。
1.2、选取健康草莓叶片，用自来水洗净，再用70％(v/v)乙醇表面消毒2次，最后用无菌水冲洗叶片表面3次，用灭菌的接种针在叶背左右两侧各轻刺3-5下，将上述JSNL-ZJ87的菌碟贴放在叶片右侧伤口上，菌丝面朝下，左侧用PDA空白培养基打菌碟(直径5mm)作为对照，用无菌湿脱脂棉保湿。接种过的叶片放在消过毒的托盘中，托盘内铺两层无菌纱布并用无菌水淋湿，用保鲜膜覆盖密封托盘保湿。25℃、黑暗条件下放置24h。
1.3、将叶片两侧的JSNL-ZJ87和PDA空白培养基菌碟去掉，换上B.cinerea菌碟，菌丝面朝下，换上新的无菌湿脱脂棉，保鲜膜覆盖密封托盘保湿。25℃、黑暗条件下放置3d。
查看草莓叶片发病情况，用十字交叉法记录病斑直径，计算平均值。
结果如图5和表3所示。
表3B.cinerea接种草莓叶片病斑直径统计结果
其中，表中菌落直径的数值表达方式为：平均值±标准误差。
如图5所示，叶片正面左侧为接种菌株JSNL-ZJ8724 h后又接种B.cinerea菌株，右侧为接种空白PDA24 h后又接种B.cinerea菌株，可见实验组的病斑明显小于对照组，说明实验组的草莓叶片产生了对B.cinerea的抗性。
2、菌株JSNL-ZJ87对由P.irregulare引起的草莓根腐病的影响
2.1、将阿达青霉(Penicillium adametzii)JSNL-ZJ87和P.irregulare分别接种于直径9cm的含有15mLPDA培养基的培养皿中，置于25℃培养箱，避光培养5d和3d。
2.2、准备两个无菌托盘，各铺上两层无菌纱布并用无菌水湿润。选择3株长势一致、健康的草莓苗(品种为红颜)，用剪刀将其根部剪整齐，用打孔器(直径5mm)在长满JSNL-ZJ87和P.irregulare的培养基边缘打取菌饼。试验设置2组，对照组为：将3块P.irregulare和3块空白PDA菌饼贴在草莓根部两侧，用无菌湿润吸水纸包裹，外面再用无菌锡箔纸包紧，放置在托盘中；实验组为：将3块P.irregulare和3块JSNL-ZJ87菌饼贴在草莓根部两侧，用无菌湿润吸水纸包裹，外面再用无菌锡箔纸包紧，放置在托盘中。每组设三个重复。
2.3、用保鲜膜密封，放在25℃下进行培养，接种5d后记录发病情况。
结果如图6所示。
从图6可知，阿达青霉(Penicillium adametzii)JSNL-ZJ87能够显著降低草莓根腐病的病害严重度，表明JSNL-ZJ87对P.irregulare导致的草莓根腐病有预防或防治的作用。
3、菌株JSNL-ZJ87对由P.ultimum引起的大豆根腐病的影响
3.1、将阿达青霉(Penicillium adametzii)JSNL-ZJ87和P.ultimum分别接种于直径9cm的含有15mLPDA培养基的培养皿中，置于25℃培养箱，避光培养5d。
3.2、在JSNL-ZJ87菌落边缘切取3mm×3mm的菌丝块，无菌条件下将10块菌丝块转移到400mLPDB液体培养基中，25℃、震荡或静止培养21d。
3.3、选择直径为12cm的盆钵，试验设置2组，实验组为：每个盆钵加入400mL JSNL-ZJ87的菌悬液和2个0.5cm×0.5cm的P.ultimum的平板块；对照组为：每个盆钵加入400mLPDB液体培养基和2个0.5cm×0.5cm的P.ultimum的平板块，每个处理设置3个重复。
3.4、将以上处理分别和灭菌的蛭石混合均匀，加入盆钵到2/3处，向每个盆钵中10颗大豆(品种为东生1号)，再分别覆盖一层薄的蛭石混合物。
3.5、用无菌水每隔一天浇灌各组大豆，播种9d后统计大豆的发芽率、株高和鲜重。
结果如图7、图8和表4所示。
表4大豆出苗率、株高及鲜重统计结果
从图7和图8可知，实验组的株高、出芽数量、根长、茂盛程度明显优于对照组，可见，阿达青霉(Penicillium adametzii)JSNL-ZJ87对P.ultimum导致的大豆根腐病有预防或防治的作用。
除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。
Claims (10)
1.一种植物内生真菌JSNL-ZJ87，其特征在于，所述植物内生真菌JSNL-ZJ87的分类命名为阿达青霉(Penicillium adametzii)，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.40489。
2.一种植物灰霉病和根腐病的生防菌剂，其特征在于，所述生防菌剂的活性成分包括权利要求1所述的植物内生真菌JSNL-ZJ87的菌丝或分生孢子、或胞外代谢物。
3.一种权利要求2所述的生防菌剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括，将权利要求1中所述的保藏号为CGMCC NO.40489的植物内生真菌JSNL-ZJ87接种在无菌培养基中置于22-28℃黑暗条件下培养数天。
4.一种防治植物灰霉病和根腐病的微生物农药，其特征在于，所述微生物农药的活性成分包含权利要求1所述的植物内生真菌JSNL-ZJ87或权利要求2所述的生防菌剂。
5.权利要求1所述的植物内生真菌JSNL-ZJ87、权利要求2所述的生防菌剂或权利要求4所述的微生物农药在抑制病原菌生长中的应用，其特征在于，所述病原菌为灰葡萄孢菌、终极腐霉、旋柄腐霉、刺腐霉、畸雌腐霉、瓜果腐霉、茄腐镰刀菌、尖孢镰刀菌、暹罗炭疽菌、胶孢炭疽菌、大豆疫霉和立枯丝核菌中的一种或多种。
6.权利要求1所述的植物内生真菌JSNL-ZJ87、权利要求2所述的生防菌剂或权利要求4所述的微生物农药在防治灰霉病和根腐病中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述灰霉病为草莓灰霉病，所述根腐病为草莓根腐病、大豆根腐病。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述灰霉病为由灰葡萄孢菌引起的灰霉病。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述根腐病包括由病原菌终极腐霉、旋柄腐霉、刺腐霉、畸雌腐霉、瓜果腐霉、茄腐镰刀菌、尖孢镰刀菌、暹罗炭疽菌、胶孢炭疽菌、大豆疫霉和立枯丝核菌中的一种或多种引起的根腐病。
10.一种灰霉病和根腐病的防治方法，其特征在于，所述方法包括向植物生长环境中施用权利要求1所述的植物内生真菌JSNL-ZJ87、权利要求2所述的生防菌剂或权利要求4所述的微生物农药。
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