KR102200332B1 - 유충호르몬 안타고니스트 및 살충 활성을 가지는 스트렙토마이세스 아비코엔시스 mjm10673 균주의 배양액 및 이의 용도 - Google Patents

유충호르몬 안타고니스트 및 살충 활성을 가지는 스트렙토마이세스 아비코엔시스 mjm10673 균주의 배양액 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본원은 유충호르몬 Met(Methoprene-tolerant) 수용체 조절을 통해 유충호르몬에 대한 길항작용을 할 수 있는 스트렙토마이세스 아비코엔시스(Streptomyces abikoensis) MJM10673 균주 배양액의 해충 방제용 조성물 및 그 용도를 개시한다. 본원에 따른 균주의 배양액은 방선균 유래 곤충 성장 조절제로서 곤충에는 특이적으로 작용하여 살충효과를 가지면서도 식물체 자체에는 무해한 친환경 살충제인 동시에 곤충의 호르몬과 동일한 작용기작과 작용점을 가지므로 곤충이 이에 대한 저항성을 획득하기 어렵다는 장점을 가진다.

Description

유충호르몬 안타고니스트 및 살충 활성을 가지는 스트렙토마이세스 아비코엔시스 MJM10673 균주의 배양액 및 이의 용도 {Streptomyces abikoensis MJM10673 having insect juvenile hormone antagonist and insecticidal activities and uses thereof}
본원은 유충호르몬 안타고니스트 및 살충 활성을 가지는 스트렙토마이세스 아비코엔시스 (Streptomyces abikoensis) MJM10673 균주 및 그 용도에 관한 것이다.
해충은 농작물을 가해하여 경제적인 피해를 입힐 뿐만 아니라 사람에게 질병을 일으키는 다양한 병원체를 매개함으로써 인류에게 심각한 영향을 미치고 있다.
특히 모기는 다양한 병원체를 매개함으로써 인류에게 말라리아, 뇌염, 뎅기열 등 심각한 피해를 끼치고 있다. 모기를 방제하기 가장 많이 사용된 화학 농약은 잔류 등을 통한 환경 오염과 인축에 대한 독성 및 저항성 해충 출현 등의 문제 때문에, 친환경 농약에 대한 수요가 날로 증가하고 있다.
곤충 성장 조절제(Insect growth regulator, IGR)는 대상 해충에 특이적으로 작용하고 환경에 대한 독성이 매우 적기 때문에 화학 농약의 대안으로 떠오르고 있다. 곤충 성장 조절제는 세계적으로 약 6조 500억 원의 시장을 형성하고 있으며, 작용 기작에 따라 유충호르몬 유사체, 탈피호르몬 아고니스트 및 키틴합성 저해제의 세 가지로 구분된다. 이 중 유충호르몬은 곤충의 발달과 생식 및 그 밖의 다양한 생리작용을 조절하는 중요한 역할을 하기 때문에, 유충호르몬 아고니스트(agonist) 및 안타고니스트(antagonist)를 포함한 유충호르몬 기반의 곤충 성장 조절제는 곤충의 내분비계를 교란함으로써 유충 시기에 비정상적인 발달과 치사를 유도할 수 있어 곤충 방제, 특히 모기 유충 방제에 효과적으로 사용될 수 있다.
근래에 식물 및 미생물을 이용한 새로운 환경친화형 살충제를 개발하기 위한 연구가 전 세계적으로 활발히 진행되고 있다. 특히 방선균은 생장 중에 항생제와 같은 2차 대사산물을 생산하며, 방선균 유래의 2차 대사산물이 유충의 생장을 저해하며 살충 활성을 갖는다는 연구가 수행되었다. 그 예로는 대상 해충인 담배거세미나방(Spodoptera litura)에 대하여 유충의 정상적인 성장을 방해하며 살충 활성을 나타내는 방선균 유래의 2차 대사산물(Talwinder Kaur et al. Insecticidal and growth inhibitory potential of Streptomyces hydrogenans DH16 on major pest of India, Spodoptera litura (Fab.) (Lepidoptera: Noctuidae). BMC Microbiology. 14:227. 2014)을 들 수 있다.
대한민국 공개특허 제10-2016-0017334호는 "유충호르몬의 안타고니스트 스크리닝 방법과 살충제용 조성물"에 관한 것으로, 곤충의 유충호르몬 수용체인 Methoprene-tolerant(Met)과 CYC 또는 SRC로 형질전환된 형질전환체를 이용한 안타고니스트 스크리닝 방법 및 이를 이용한 살충제용 조성물이 개시되어 있다.
대한민국 등록특허 제10-1720472호는 "식물체 유래의 유충호르몬 아고니스트 또는 안타고니스트를 포함하는 Met 수용체 조절을 통한 해충방제 조성물 및 방법"에 관한 것으로, 상기 Met과의 상호작용을 통하여 유충호르몬의 아고니스트 또는 안타고니스트로 작용할 수 있는 식물체 유래의 신규 곤충 성장 조절제를 이용한 살충제용 조성물 및 방제법이 개시되어 있다.
대한민국 등록특허 제10-1101783호는 "항균활성과 살충력이 우수한 신규한 스트렙토마이세스속 균주 및 이의 배양방법과 배양물을 이용한 제제"에 관한 것으로,'식물병원균 및 해충에 대하여 우수한 항균활성과 살충력을 갖는 스트렙토마이세스속 균주의 배양 방법과 이를 이용한 제제의 제조법이 개시되어 있다.
대한민국 등록특허 제10-1852462호는 "유충호르몬 안타고니스트 및 살충 활성을 가지는 스트렙토마이세스 속 AN120537 균주 및 이의 용도"에 관한 것으로 해충에 대하여 유충호르몬 안타고니스트 활성 및 살충활성을 갖는 스트렙토마이세스속 균주의 배양 방법 및 배양체 추출물을 통한 해충 방제법이 개시되어 있다.
그러나 현재 상용화된 곤충 성장 조절제에 대한 저항성을 나타내는 해충이 출현하기 시작하면서 보다 신규하고 효과적이며 친환경적인 다양한 곤충 성장 조절제의 개발이 필요하다.
본원은 유충호르몬 안타고니스트 활성과 파리목 해충에 대하여 동시에 살충 활성을 갖는 스트렙토마이세스 아비코엔시스 MJM10673 균주 및 그 배양액을 이용한 해충 퇴치 또는 방제 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
한 양태에서 본원은 국립농업과학원 미생물은행에 KACC 92292P로 기탁된, 스트렙토마이세스 아비코엔시스 MJM10673 균주에 관한 것이다.
다른 양태에서 본원에 따른 스트렙토마이세스 아비코엔시스 MJM10673 균주의 배양액을 포함하는 유충호르몬 안타고니스트 조성물을 제공한다.
또 다른 양태에서 본원에 따른 스트렙토마이세스 아비코엔시스 MJM10673 균주의 배양액을 포함하는 Met 수용체 조절용 조성물을 제공한다.
또 다른 양태에서 본원에 따른 스트렙토마이세스 아비코엔시스 MJM10673 균주의 배양액을 포함하는 유충호르몬에 대한 안타고니스트 활성을 통한, 해충 방제용 조성물을 제공한다.
본원에 따른 조성물은 유충호르몬에 대한 안타고니스트 활성을 통해 효과를 발휘하기 때문에, 유충호르몬과 Met(Methoprene-tolerant) 수용체 단백질을 발현하는 해충에 적용될 수 있으며, 특히 파리목 해충에 적용될 수 있다.
또 다른 양태에서 본원은 본원에 따른 스트렙토마이세스 아비코엔시스 MJM10673 균주의 배양액을 해충, 해충의 유충 또는 해충의 알; 식물의 전부 또는 일부, 또는 식물의 종자; 또는 해충 또는 식물의 서식지와 접촉시키는 단계를 포함하는, 해충 방제 방법에 관한 것이다.
또 다른 양태에서 본원은 스트렙토마이세스 아비코엔시스 MJM10673 균주의 배양액을 해충, 해충의 유충 또는 해충의 알에 처리하는 단계를 포함하는, 상기 해충에서 유충호르몬 수용체인 Met(Methoprene-tolerant) 수용체를 조절하는 하는 방법을 제공한다.
일 구현예에서 상기 해충은 파리목의 해충이다.
본원에 따른 스트렙토마이세스 아비코엔시스 MJM10673 균주의 배양액은 곤충의 유충호르몬 안타고니스트 활성을 가지고 있으며, 기존의 IGR 계열의 물질과는 다른 살충 메카니즘을 가지는 유충호르몬 안타고니스트 활성을 이용함으로써 기존의 살충제에 저항성을 가지는 해충의 방제에 효과적으로 사용될 수 있다.
또한, 본 균주의 균체에는 유충호르몬 안타고니스트 활성이 없는 반면에 배양액에서만 유충호르몬 안타고니스트 활성이 있다. 이와 같이 본 균주는 유충호르몬 안타고니스트 활성 및 살충 활성 물질이 배양액으로 분비되므로, 균체로부터 유충호르몬 안타고니스트 활성 및 살충 활성 물질을 회수하기 위한 별도의 과정이 필요없는 큰 이점이 있다.
본원에 따른 방선균 배양액은 곤충에 특이적으로 작용하여 대상 해충에 대하여 살충효과를 가지면서도 해충이 서식하는 서식지의 동물 또는 식물체 자체에는 전혀 무해한 친환경 살충제인 동시에 곤충의 호르몬과 동일한 작용기작과 작용점을 가지므로 곤충이 이에 대한 저항성을 획득하기 어려워 기존의 살충제에 저항성을 가지는 해충의 방제에 효과적으로 사용될 수 있다는 장점을 가진다.
도 1은 본원에 따른 스트렙토마이세스 아비코엔시스 MJM10673 균주 배양액의 유충호르몬 안타고니스트 활성 평가 결과이다.
도 2는 본원에 따른 스트렙토마이세스 아비코엔시스 MJM10673 균주 배양액의 항이스트 활성 평가 결과이다.
도 3은 본원에 따른 스트렙토마이세스 아비코엔시스 MJM10673 균주 배양액의 흰줄숲모기 유충에 대한 살충 활성 결과이다.
도 4는 본원에 따른 스트렙토마이세스 아비코엔시스 MJM10673 균주 배양액의 빨간집모기 3령 유충에 대한 살충 활성 결과 이다.
도 5는 본원에 따른 스트렙토마이세스 아비코엔시스 MJM10673 균주 배양액의 구피에 대한 어류 급성 독성 활성 결과이다.
본원은 곤충의 유충호르몬의 안타고니스트 및 살충 활성을 가지는 신규한 스트렙토마이세스 아비코엔시스 MJM10673 균주 및 활성의 발견에 근거한 것이다.
따라서 한 양태에서 본원은 2019년 11월 25일자로 국립농업과학원 미생물은행에 KACC 92292P로 기탁된, 스트렙토마이세스 아비코엔시스 MJM10673 균주에 관한 것이다.
본원에 따른 스트렙토마이세스 아비코엔시스 MJM10673 균주는 우리나라에서 자생하는 미생물로서 강화도 지역의 토양으로부터 분리하였고, 16s rRNA 유전자 염기서열에 기초한 분자계통학적 분석 결과, 스트렙토마이세스 아비코엔시스(Streptomyces abikoensis) NRBC 13860과 99.79% 유사도(EZ-taxon blasting 결과)를 보였다. 이에 상기에서 분리된 균주를 스트렙토마이세스 아비코엔시스 MJM10673 균주라고 명명하였으며, 2019년 11월 25일자로 국립농업과학원 미생물은행에 기탁하여 KACC 92292P를 부여받았다.
본원에 따른 균주는 특히 그 배양액이 곤충의 유충호르몬에 대한 안타고니스트 활성을 가진다. 본원에 따른 균주의 균체에는 유충호르몬 안타고니스트 활성이 없는 반면에 배양액에서만 유충호르몬 안타고니스트 활성이 있다.
이에 다른 양태에서 본원에 개시된 스트렙토마이세스 아비코엔시스 MJM10673 균주의 배양액을 포함하는 유충호르몬 안타고니스트 조성물에 관한 것이다.
본원의 '유충 호르몬(Juvenile Hormone, JH)'은 곤충의 발생과정 동안에 주기적으로 외골격을 벗는 변태과정을 조절하며, 성체의 경우 암컷이 정상적으로 알을 생산하는 데 관여하는 물질로, 수용체를 통해서 작용하며, 수용체는 곤충의 체내에 존재하면서 유충 호르몬을 감지하고 인식하여 호르몬이 그 역할을 할 수 있도록 수행하는 단백질이다.
본원의 '안타고니스트'는 유충호르몬 수용체에 결합해서 그 물질이 갖는 작용을 저해하는 물질로, 유충호르몬의 활성을 방해하여 비정상적인 곤충의 변태를 유도하거나 정상적인 알의 분화를 막아 곤충의 생식을 방해하는 물질을 말한다. 본원에 따른 곤충의 유충호르몬 안타고니스트는 유충의 정상적인 탈피를 억제하거나, 성충의 난소 발달을 저해하여 정상적인 산란을 방해함으로써 해충 방제를 위한 살충제로 이용될 수 있다.
본원에 따른 균주 스트렙토마이세스 아비코엔시스 MJM10673 균주는 배양되어 그 배양액이 사용된다.
본원에서 '배양액'이란, 약 1.0Х106 ~ 약 2.0Х106 cfu/ml 농도의 본원에 따른 균체를 액체 배지에 접종하여 6~7일 동안 배양한 후, 균체를 제거한 배양여액 또는 배양액을 의미한다.
본원에 따른 배양액 제조에 사용될 수 있는 액체 배지 및 조성은 스트렙토마이세스 아비코엔시스가 성장할 수 있는 배지라면 제한되지 않으며, 예를 들면 M3, GSS 배지, Fishmeal 배지, Bennett's 배지가 사용될 수 있으며, 상기 배지는 시중에서 구입가능하다.
일 구현예에서 본원에 따른 균주의 배양액의 제조를 위한 균주의 배양 방법은 본원 실시예에 기재된 것을 참조할 수 있다.
일 구현예에서 배양액은 균체는 포함하지 않는다. 균체는 효과가 없는 반면에 배양액에서만 효과가 나타나는 것으로, 유충호르몬 안타고니스트 활성 및 살충 활성 물질이 배양액으로 분비되기 때문에, 균체는 배양액에 포함되지 않는다.
본원에 따른 스트렙토마이세스 아비코엔시스 MJM10673 균주의 배양액은 본 이론으로 한정하는 것은 아니나, Met과 이의 파트너인 CYC와의 이합체 형성을 방해함으로써 유충의 비정상적인 발달을 유도하거나 성충의 번식(reproduction)을 억제하여 해충을 방제할 수 있다. 또한 해충 알의 부화율에도 영향을 미치며, 알에 처리한 경우 부화한 유충의 발달에도 영향을 미쳐, 방제에 효과적으로 사용될 수 있다.
일 구현예에서는 본원에 따른 스트렙토마이세스 아비코엔시스 MJM10673 균주의 배양액은 JH의 수용체로서 Met을 조절한다. Met은 유충호르몬의 수용체로서 (Jindra, M., Palli, S.R. & Riddiford, L. M. The juvenile hormone signaling pathway in insect development. Annu. Rev. Entolol 58, 181-204, 2013), 유충호르몬에 의존적인 방식으로 Ftz-F1-interacting steroid receptor coactivator(FISC) 또는 Cycle(CYC)과 이합체를 형성한다 (Li, M., Mead, E. A. & Zhu, J. Heterodimer of two bHLH-PAS proteins mediates juvenile hormone-induced gene expression. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 638-643, 2011).
본원에 따른 스트렙토마이세스 아비코엔시스 MJM10673 균주의 배양액 살충제는 방제가 필요한 해충 자체, 그 유충 또는 알, 또는 방제가 필요한 지역, 서식지 또는 식물의 전부 또는 일부에 적용될 수 있다.
본원에 따른 균주의 배양액은 유충호르몬의 수용체인 Met에 작용하여 유충호르몬에 대한 안타고니스트 활성을 가진다.
그런데 곤충의 유충호르몬은 곤충 종에 따라 서로 다른 것이 아니라 대부분 거의 동일한 화학구조를 가지고 있으며, 유충호르몬의 수용체 단백질인 Met도 거의 유사한 특성을 가지고 있다. 따라서 본원에 따른 균주 배양액의 유충호르몬 안타고니스트 활성은 유충호르몬과 Met 수용체 단백질을 가지는 곤충에 일반적으로 효과가 있다.
본원에 따른 균주의 배양액 또는 이를 포함하는 조성물이 사용되는 해충(pest)은 기생(colonizing), 손상유발, 또는 감염 등을 통해 식물 또는 동물에 해를 입히는 무척추 동물 또는 미생물을 일컫는 것이다. 해충은 또한 숙주에 손상을 입히거나 질병을 퍼뜨리고, 숙주와 영양분을 두고 경쟁관계에 있는 개체이다.
본원에 따른 다른 구현예에서는 특히 식물체와 연관된 해충으로 곰팡이, 박테리아, 곤충, 거미류, 선충, 민달팽이, 달팽이 등 및 이들 해충의 알 또는 유충을 또한 포함한다. 본원에 따른 다른 구현 예에서는 농작물, 자연환경 및/또는 가정용 해충 및 이들의 알 및 유충을 또한 포함하는 것이다.
본원에 따른 일 구현예에서 해충은 유충호르몬과 Met 수용체 단백질을 발현하는 위생 해충 및 농업해충을 포함한다.
본원에 따른 다른 구현예에서는 파리목뿐만 아니라 국내에서 주로 문제가 되고 있는 나비목, 노린재목, 딱정벌레목, 총채벌레목 등의 다양한 해충들을 포함하며, 이들 해충들은 모두 유충호르몬과 Met 수용체 단백질을 가지고 있다. 예를 들면 이집트숲모기(Aedes aeypti), 흰줄숲모기(Aedes albopictus), 빨간집모기(Culex pipiens), 작은뿌리파리(Bradysia agrestis), 파밤나방(Spodoptera exigua), 배추좀나방(Plutella xylostella), 담배거세미나방(Spodoptera litura), 미국흰불나방(Hyphantria cunea), 왕담배나방(Helicoverpa armigera), 화랑곡나방(Plodia interpunctella), 이화명나방(Chilo suppressalis), 혹명나방(Cnaphalocrocis medinalis), 옥수수조명나방(Ostrinia furnacalis), 톱다리개미허리노린재(Riptortus clavatus), 벼물바구미(Lissorhoptrus oryzophilus), 벼멸구(Nilaparvata lugens), 애멸구(Laodelphax striatellus), 목화진딧물(Aphis gossypii), 복숭아혹진딧물(Myzus persicae), 오이총채벌레(Thrips palmi), 꽃노랑총채벌레(Frankliniella occidentalis), 또는 담배가루이(Bemisia tabaci)등 유충호르몬이 존재하는 절지동물과, 또는 상기 해충의 알 또는 유충을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니며, 본원에 따른 조성물이 작용할 수 있는 유충호르몬 수용체와 조력체를 가진 모든 곤충에 적용될 수 있다.
일 구현예에서는 파리목의 해충을 포함하며 예를 들면 이집트 숲모기(Aedes aeypti), 흰줄숲모기(Aedes albopictus), 토고숲모기(Aedes togoi), 하토리숲모기(Aedes hatorii), 제물포숲모기(Aedes chemulpoensis), 등줄숲모기(Aedes dorsalis), 서울숲모기(Aedes seoulensis), 금빛숲모기(Aedimorphus vexans nipponii), 빨간집모기(Culexpipiens), 작은빨간집모기(Culex tritaeniorhynchus), 지하집모기(Culex pipiens molestus), 줄다리집모기(Culex vagans), 잭손집모기(Culex jacksoni), 미메티쿠스집모기(Culex mimeticus), 중국얼룩날개모기 (Anopheles sinensis), 큰검정들모기(Armigeres subalbatus), 광릉왕모기(Toxorhynchites christophi), 긴얼룩다리모기(Tripteroides bambusa), 또는 반점날개늪모기(Mansonia uniformis)를 들 수 있다.
본원에 따른 살충제가 적용될 수 있는 식물은 식물 전체 또는 그 부분으로 예를 들면 뿌리, 줄기, 잎, 및 종자는 물론 식물체의 세포 또는 조직에 적용될 수 있다. 본원에 따른 살충제가 적용될 수 있는 작물은 곡물(밀, 보리, 호밀, 귀리, 쌀, 사탕 수수 등), 비트(사탕무 및 사료 사탕무), 목초(과수원 잔디, 김의 털, 등), 과일류(사과, 배, 자두, 복숭아, 아몬드, 체리, 딸기, 라스베리, 블랙 베리), 콩과 식물(콩, 렌즈 콩, 완두콩, 콩), 오일 식물(유채, 겨자, 양귀비, 올리브, 해바라기, 코코넛, 피마자 오일 플랜트, 코코아 콩, 땅콩 등), 오이 식물(오이, 참외, 멜론 등), 섬유 식물(면, 아마, 대마, 황마), 감귤류의 과일(귤, 오렌지, 레몬, 자몽 등), 야채(시금치, 상추, 아스파라거스, 양배추, 양파, 토마토, 감자, 파프리카 등), 녹나무과(아보카도, 당근, 계피, 녹나무), 활엽수와 침엽수(예를 들어, 린든 - 트리, 주목 나무, 떡갈 나무, 오리 나무, 포플러, 자작 나무, 전나무, 낙엽송, 소나무), 또는 옥수수, 담배, 견과류, 커피, 사탕 수수, 차, 덩굴, 홉, 바나나, 천연 고무와 같은 식물, 또는 관상용 식물을 포함한다. 또한 본원에 따른 조성물이 적용되는 식물 또는 작물은 식재된 또는 성장하는 작물 및 수확된 작물 둘 다를 포함하는 것이다.
본원에서 살충제에 의한 해충의 퇴치, 조절, 방제 또는 제어는 표적하는 병해충의 박멸 또는 병해충을 물리적으로 또는 이의 성장 또는 행동을 억제, 방해 하는 것을 포함한다. 따라서, 해충을 박멸하는 것은 물론, 생식력이 없는 곤충의 생성을 통한 정자 또는 난자의 생성을 방지, 또는 곤충의 유전자에 손상을 가하여 정자 또는 난자가 성체로 발달될 수 없게 하는 것을 포함한다.
본 발명의 해충 방제용 또는 살충제용 조성물은 상기 균주의 배양액을 유효성분으로 포함하지만, 그 외 통상의 살충제용 조성물에 포함되는 부형제, 첨가제를 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 가소제, 착색제, 증백제, 계면활성제, 분산제, 유화제, 유동화제 등을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 살충제용 조성물은 통상의 살충제, 또는 농약 제형으로 제제화될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 살충제용 조성물은 유제, 액제, 수화제, 수용제, 분제, 입제, 훈증제, 도포제 등으로 제형화 될 수 있다. 구체적으로, 화학식 1 내지 8의 화합물을 적정 방법으로 포함시켜 농약 제제로 제제화한다. 이들 조성물 제형은 문헌 ["Catalogue of pesticide formulation types and international coding system", Technical Monograph No. 2, 6th Ed. May 2008, CropLife International]에 정의되어 있다. 조성물은 문헌 [Mollet and Grubemann, Formulation technology, Wiley VCH, Weinheim, 2001; 또는 Knowles, New developments in crop protection product formulation, Agrow Reports DS243, T&F Informa, London, 2005]에 기재된 바와 같은 공지된 방식으로 제조된다.
구체적으로, 균주의 배양액에 계면활성제, 증량제, 붕해제, 영양제 등을 혼합하고 분쇄하여 수화제로 사용하거나 용해시켜 액제로 제제화할 수 있다. 계면활성제로는 폴리카르복실레이트(polycarboxylate), 소듐 리그노설포네이트(sodium lignosulfonate), 칼슘 리그노설포네이트 소듐 다이알킬 설포석시네이트(sodium dialkyl sulfosuccinate), 소듐 알킬 설포네이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 페닐 에테르, 소듐 트리폴리포스페이트(sodium tripolyphosphate), 소듐 알킬 아릴 설포네이트(sodium alkyl aryl sulfonate), 폴리옥시에틸렌 알킬 페닐 에테르(polyoxyethylene alkyl phenyl ether), 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 포스포릭 에스테르(polyoxyethylene aryl phosphoric ester), 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 에테르(polyoxyethylene alkyl aryl ether), 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 폴리머(polyoxyethylene alkyl aryl polymer), 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 폴리머 스페셜, 폴리옥시알킬온 알킬 페닐 에테르(polyoxyalkylone alkyl phenyl ether), 폴리옥시에틸렌 노닐 페닐 에테르(polyoxyethylene nonyl phenyl ether), 소듐 설포네이트 나프탈렌 포름알데히드(sodium sulfonate naphthalene formaldehyde), 트리톤 100 및 트윈 80으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 사용할 수 있다. 계면활성제의 예는 문헌 [McCutcheon's, Vol.1:Emulsifiers & Detergents, McCutcheon's Directories, Glen Rock, USA, 2008 (International Ed. or North American Ed.)]에 열거되어 있다. 붕해제로는 벤토나이트, 탈크, 카올린, 칼슘카보네이트 등을 사용할 수 있고, 증량제로는 황토, 규조토, 덱스트린, 포도당, 전분 중 하나 또는 둘 이상을 사용할 수 있다.
본 발명의 해충 방제용 또는 살충제용 조성물은 필요한 경우 살충 유효량의 화합물을 추가로 포함할 수 있고, 예를 들어 농약 제제 당 사용량이 0.01 내지 100(mg/kg) 이 될 수 있다. 상기 용어 "유효량"은 재배 식물 상에서 유충을 방제하는데 충분하거나 물질의 보호에 충분하고, 처리된 식물에 실질적인 손상을 초래하지 않는 조성물 또는 화합물의 양을 의미한다. 이러한 양은 넓은 범위 내에서 달라질 수 있고, 다양한 인자, 예컨대 방제할 해충 종, 처리된 재배 식물 또는 물질, 기후 조건 및 사용되는 특정 화합물에 따라 좌우된다. 제제화할 경우 사용 시기는 해충 발생시 상시적으로 사용할 수 있다.
다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 스트렙토마이세스 아비코엔시스 MJM10673 균주의 배양액 또는 이를 포함하는 조성물을 해충 또는 해충의 유충에 처리하는 단계를 포함하는, 상기 해충 또는 해충의 유충의 Met(Methoprene-tolerant) 수용체를 조절하는 하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 양태에서 본원은 또한, 본원에 따른 스트렙토마이세스 아비코엔시스 MJM10673 균주의 배양액 또는 이를 포함하는 조성물을 해충 또는 해충의 유충에 처리하는 단계를 포함하는, 상기 해충 또는 해충의 유충의 Met(Methoprene-tolerant) 수용체를 조절을 통한 유충호르몬 조절 방법에 관한 것이다.
본원에 따른 방법에서 유충호르몬의 조절은 길항 작용에 의한 것이다.
본원에 따른 방법에서 본원은 또한 본원에 따른 스트렙토마이세스 아비코엔시스 MJM10673 균주의 배양액의 Met(Methoprene-tolerant) 수용체를 조절을 통한 유충호르몬 조절을 앞서 언급한 바를 참조할 수 있다.
다른 양태에서 본원은 상기 스트렙토마이세스 아비코엔시스 MJM10673 균주의 배양액을 포함하는 살충제용 조성물을 해충 또는 상기 해충의 토서식지, 또는 상기 해충의 방제가 필요한 식물 또는 토양 또는 물을 포함하는 식물의 서식지와 접촉시키는 것을 포함하는, 해충의 퇴치 또는 방제 방법에 관한 것이다.
본원 방법이 적용될 수 있는 해충 및 작물은 상기에 기재한 바와 같다.
본원의 해충의 퇴치 또는 방제는 해충을 없애거나 농작물을 해충으로부터 예방하거나 구제하여 해충을 몰아내어 없애버리는 것을 말한다.
본원의 방법은 해충 또는 그 유충 또는 그 알 자체, 또는 해충의 서식지; 또는 식물의 전부 또는 일부 또는 그 종자, 식물 또는 해충 또는 그 유충이 서식하는 서식지 예를 들면 토양 또는 물에, 당업계에 공지된 임의의 적용 방법에 의해 본 발명의 살충제용 조성물과 접촉시킬 수 있다. 이 경우에, "접촉"은 직접적 접촉 (조성물을 해충 또는 식물 - 전형적으로 식물의 잎, 줄기 또는 뿌리에 직접적으로 적용함) 및 간접적 접촉 (조성물을 해충 또는 식물의 생육지에 적용함) 둘 다를 포함한다.
본원의 방법은 또한 성장하는 식물 또는 작물을 살충 유효량의 조성물과 접촉시킴으로써 식물/작물을 해충에 의한 공격 또는 침입으로부터 보호하기 위해 사용될 수 있다. 본원에서 용어 식물 또는 작물은 성장하는 작물 및 수확된 작물 둘 다를 포함하는 것이다.
본원의 방법은 해충의 공격으로부터 보호하고자 하는 식물, 식물 번식 재료, 예컨대 종자, 토양, 표면, 물질 또는 공간을 살충 유효량의 본원 조성물로 처리함으로써 이용된다. 본원 방법은 해충에 의한 식물, 식물 번식 재료, 예컨대 종자, 토양, 표면, 물질 또는 공간의 감염 전 및 감염 후에 둘 다 수행될 수 있다.
본원 방법은 해충의 발생이 예상되는 장소에 예방적으로 적용될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실험 재료
본 발명에서 사용한 Met과 CYC로 형질전환된 Y187 세포(Saccharomyces cerevisiae strain Y187-Aa; 기탁 번호: KCTC12621BP)는 한국공개특허 제10-2014-0100066에 개시되어 있는 것을 사용하였다.
실시예 1. 토양으로부터 본원에 따른 방선균의 분리 및 동정
실시예 1-1 균주의 분리
방선균은 인천광역시 강화군의 토양으로부터 부식산(Humic acid)-비타민 한천 배지(0.1% humic acid : dissolved in 0.2N NaOH, 0.05% Na2HPO4, 0.171% KCl, 0.005% MgSO4, 0.001% FeSO4·7H2O, 0.002% CaCO3, 50ppm cycloheximide, 10ppm nalidixic acid, thimine-HCl을 비롯한 8종의 비타민 및 2% agar)를 사용하여 분리하였다(Hayakawa, M. and Nonomura, H. Humic acid-vitamin agar, a new medium for the selective isolation of soil actinomycetes. J. Ferment. Tech. 65:501-509. 1987). 분리한 방선균의 보존을 위하여 Bennett's 배지(1% glucose, 0.1% yeast extract, 0.2% Bacto-peptone, 0.1% beef extract)에서 배양하였다(Hesseltine, C.W., Benedict, R.G. and Pridham, T.G. Useful criteria for species differentiation in the genus Streptomyces. Ann. N. Y. Acad. Sci. 60:136-151. 1954).
실시예 1-2 균주의 동정
상기 실시예 1-1에서 분리한 균주에 대하여, 16S rRNA 염기서열을 통한 유전학적 특성 및 배양학적 특성을 다음과 같이 분석하였다.
(1) 배양학적 특성
균주의 각종 배지에 따른 배양학적 특성을 분석하기 위해, 각종 ISP 배지조건에서 28℃에서 14일간 배양한 후 균주의 배양 생리적 특성을 조사하였다. 그 결과, 스트렙토마이세스 아비코엔시스 MJM10673 균주의 생육정도는 효모-맥아 한천, 무기염-전분 한천, 글리세롤-아스파라긴 한천에서 비교적 양호한 생육정도를 나타내었다.
[표 1] 균주의 배지별 배양 생리적 특성
Figure 112019124710021-pat00001
(2) 유전학적 특성
분리한 균주의 동정을 위해 16s rRNA 유전자 염기서열 분석을 수행하였다. 구체적으로, 균주의 16s rRNA 유전자의 염기서열을 얻기 위하여 DNeasy Blood & Tissue kit (Qiagen)을 이용하여 genomic DNA를 분리 하였고 이를 템플레이트(template)로 사용하여 27F (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3') 및 1492R (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3') 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 증폭된 PCR 산물은 정제 후 마크로젠(Macrogen Corp.)에 의뢰하여 서열을 분석하였다. 염기서열은 EzTaxon-e server(http://www.ezbiocloud.net)와 NCBI의 BLAST을 이용하여 GenBank 데이터베이스의 염기서열과 비교하였다. 그 결과, MJM 10673 균주는 Streptomyces abikoensis NRBC 13860과 99.79% 유사도를 보였다. 이에 분리된 균주를 스트렙토마이세스 아비코엔시스 (Streptomyces abikoensis) MJM10673으로 명명하고, 2019년 11월 25일자로 국립농업과학원 미생물은행에 기탁하여 기탁번호 KACC 92292P를 부여받았다.
실시예 2. 본원에 따른 스트렙토마이세스 아비코엔시스(Streptomyces abikoensis) MJM10673 균주 배양액의 유충호르몬 안타고니스트 활성 검증
본원에 따른 스트렙토마이세스 아비코엔시스 MJM10673 균주 배양액의 곤충 유충호르몬 안타고니스트 활성은 본원 발명자에 의해 출원된 대한민국 공개특허 제2014-0100066호에 개시되어 있는 시스템을 이용하여 실험하였다. 상기 방법은 Met과 CYC로 형질전환된 형질전환체를 본원에 따른 균주의 배양액의 존재 중에서 배양할 경우, Met과 CYC가 결합하지 않아 LacZ가 전사되지 않는 경우 유충호르몬의 안타고니스트활성을 갖는 것으로 결정되는 원리이다.
구체적 실험방법은 다음과 같다. 스트렙토마이세스 아비코엔시스 MJM10673 균주 배양액의 용매 분획에 따른 유충호르몬 안타고니스트 활성 검정을 위해 스트렙토마이세스 아비코엔시스 MJM10673 균주를 M3(2% 가용성 전분, 1% 글루코스, 1% 대두박, 0.02% FeSO4·7H20, 0.3% CaCO3(pH7.2))배지에서 28℃, 150 rpm 조건에서 7일 동안 진탕 배양하였다. 배양 후 이를 원심 분리하여 배양액을 수거하였으며, 수거한 배양액 원액을 사용하여 유충호르몬의 안타고니스트 활성을 조사하였다.
유충호르몬 안타고니스트 활성 검정을 위해 이집트 숲모기의 Met-CYC가 형질전환된 이스트 Y187 세포(Saccharomyces cerevisiae strain Y187-Aa; 기탁 번호: KCTC12621BP; 한국공개특허: 제10-2014-0100066)를 2.0×106 세포/ml가 될 때까지 더블드랍아웃(DDO, SD-Leu/-Trp) 배지를 이용하여 30℃에서 배양하였다. 이를 100㎕씩 96-웰 플레이트에 분배하였다. 96-웰 플레이트에 피리프록시펜 0.033 ppm과 스트렙토마이세스 아비코엔시스 MJM10673 균주 배양액 1 ㎕를 처리하고 30℃에서 3시간 동안 추가로 배양한 후, 이스트 β-갈락토시다제 분석 키트(Thermo Scientific)을 제조자의 방법대로 사용하여 β-갈락토시다제 분석을 수행하였다. 음성 대조군으로는 피리프록시펜 0.033 ppm과 증류수를 처리하여 동일한 방법으로 β-갈락토시다제 분석을 수행하였다. 96-웰 플레이트에 들어있는 이들 β-갈락토시다제 분석 반응 혼합물을 30℃에서 5시간 동안 배양하고, 각각의 OD420을 iMarkTM 마이크로플레이트 리더(BIO-RAD)를 이용하여 측정하였다. 이렇게 측정된 OD420을 하기 식 1에 대입하여 유충호르몬 안타고니스트(JHAN) 활성을 평가하였으며, 그 결과를 도 1의 가로 축에 나타내었다.
[식 1]
JHAN 활성= (OD420 control - OD420 MJM 10673)/OD420 control
상기 식 1에서, OD420 control은 피리프록시펜 0.033 ppm을 처리한 경우의 OD420이고, OD420 MJM 10673은 피리프록시펜 0.033 ppm과 스트렙토마이세스 아비코엔시스 MJM10673 균주 배양액을 처리한 경우의 OD420이다.
상기 식 1은 피리프록시펜 0.033 ppm을 처리한 경우의 OD420을 0으로 보았을 때, 스트렙토마이세스 아비코엔시스 MJM10673 균주 배양액의 OD420을 평가한 것이다.
그 결과 도 1에서와 같이, 본원에 따른 스트렙토마이세스 아비코엔시스 MJM10673 균주 배양액에 대한 유충 Met 수용체 조절을 통한 유충호르몬 안타고니스트 활성을 조사한 결과, 약 0.75 수준으로 높은 유충호르몬 안타고니스트 활성을 나타내었다.
실시예 3. 항이스트(anti-yeast) 활성 부재 검증
본 실험은 실시예 2의 본원에 따른 균주의 유충호르몬 안타고니스트 활성이 활성 검증을 위해 사용한 항이스트 활성에서 유래한 것이 아니라 본원에 따른 균주 배양액에 의한 것임을 증명하기 위해 실시하였다.
탐색 대상 물질이 이스트에 대하여 독성을 가지고 있을 경우, 실시예 1의 방법으로 측정된 OD420은 대상 물질의 유충호르몬 안타고니스트 활성에 기인한 것이 아니라 항이스트 활성에 기인한 것이기 때문이다. 실시예 1의 스트렙토마이세스 아비코엔시스 MJM10673 균주 배양액에 대하여 이스트 세포에 대한 생장 저해 효과를 조사함으로써 항이스트 활성 여부를 검정하였다.
이를 위하여 이집트 숲모기의 Met-CYC가 형질전환된 이스트 Y187 세포를 OD600이 2.0×106 세포/ml의 농도가 될 때까지 디디오(DDO, SD-Leu/-Trp) 배지를 이용하여 30℃에서 배양하였다. 이를 200 ㎕씩 96-웰 플레이트에 분배하였다. 96-웰 플레이트에 배양액 2 ㎕를 처리하고 30℃에서 진탕 배양(shaking incubation)하면서 24시간 후 세포의 성장율을 OD600으로 측정하였다.
그 결과 도 2에서와 같이, 스트렙토마이세스 아비코엔시스 MJM10673 균주의 배양액은 이스트 세포의 생장에 큰 영향을 주지 않음으로써 항 이스트 활성이 없음을 확인하였고, 유충호르몬 안타고니스트 활성은 본원에 개시된 균주의 배양액에 의한 것임을 나타낸다.
실시예 4. 위생해충 파리목 해충에 대한 살충 활성 검정
실시예 2과 3에서의 스트렙토마이세스 아비코엔시스 MJM10673 균주 배양액에 대해 모기 유충의 살충 활성을 평가하였다. 흰줄숲모기(Aedes albopictus) 2, 3, 4령 유충 각 10마리씩을 한 처리구로 하여, 배양액을 총 부피의 50% 또는 10%로 처리하고 24시간 간격으로 3일 동안 사충 수를 조사하였다. 또한, 빨간집모기(Culex pipiens pallens) 3령 유충 10마리씩을 한 처리구로 하여, 배양액을 총 부피의 10%로 처리하고 24시간 간격으로 3일 동안 사충 수를 조사하였다. 그 결과를 도 3 및 도 4에 각각 나타내었다. 본 발명의 스트렙토마이세스 아비코엔시스 MJM10673 균주 배양액은 모기 유충에 대해 높은 수준의 살충 활성을 보이는 것을 확인하였다.
실시예 5. 어류에 대한 급성 어류 독성 활성 검정
수중에서 생활하는 모기 유충의 방제에 적용하기 위해서는 대상 물질이 어독성을 보이지 않아야 하기 때문에, 실시예 2와 3에서의 스트렙토마이세스 아비코엔시스 MJM10673 균주 배양액에 대해 어류 급성 독성 활성을 확인하고 그 결과를 도 5에 나타내었다. 1 L 부피의 물에서 구피 성어 5마리씩을 한 처리구로 하여, 배양액을 총 부피의 10%로 처리하고 24시간 간격으로 2일 동안 구피의 치사율을 확인하였다. 그 결과, 대조구인 증류수와 유사한 수준의 치사율을 보여 어류에 대한 독성이 거의 없는 것을 확인하였다.
이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.
국립농업과학원 KACC92292P 20191119

Claims (9)

  1. 국립농업과학원 미생물은행에 KACC 92292P로 기탁된, 스트렙토마이세스 아비코엔시스 MJM10673 균주.
  2. 제 1 항에 따른 스트렙토마이세스 아비코엔시스 MJM10673 균주의 배양액을 포함하는 유충호르몬 안타고니스트 조성물.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 배양액은 배양체는 포함하지 않는 것인, 유충호르몬 안타고니스트 조성물.
  4. 제 1 항에 따른 스트렙토마이세스 아비코엔시스 MJM10673 균주 배양액을 포함하는 유충호르몬에 대한 안타고니스트 활성을 통한, 파리목 해충 방제용 조성물.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 파리목 해충은 이집트 숲모기(Aedes aeypti), 흰줄숲모기(Aedes albopictus), 토고숲모기(Aedes togoi), 하토리숲모기(Aedes hatorii), 제물포숲모기(Aedes chemulpoensis), 등줄숲모기(Aedes dorsalis), 서울숲모기(Aedes seoulensis), 금빛숲모기(Aedimorphus vexans nipponii), 빨간집모기(Culexpipiens), 작은빨간집모기(Culex tritaeniorhynchus), 지하집모기(Culex pipiens molestus), 줄다리집모기(Culex vagans), 잭손집모기(Culex jacksoni), 미메티쿠스집모기(Culex mimeticus), 중국얼룩날개모기 (Anopheles sinensis), 큰검정들모기(Armigeres subalbatus), 광릉왕모기(Toxorhynchites christophi), 긴얼룩다리모기(Tripteroides bambusa), 또는 반점날개늪모기(Mansonia uniformis)를 포함하는 해충인, 파리목 해충 방제용 조성물.
  6. 제 1 항에 따른 스트렙토마이세스 아비코엔시스 MJM10673 균주의 배양액을 파리목 해충, 파리목 해충의 유충 또는 파리목 해충의 알; 식물의 전부 또는 일부, 또는 식물의 종자; 또는 파리목 해충 또는 식물의 서식지와 접촉시키는 단계를 포함하는, 파리목 해충 방제 방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 배양액은 배양체를 포함하지 않는 것인, 파리목 해충 방제 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 해충은 이집트 숲모기(Aedes aeypti), 흰줄숲모기(Aedes albopictus), 토고숲모기(Aedes togoi), 하토리숲모기(Aedes hatorii), 제물포숲모기(Aedes chemulpoensis), 등줄숲모기(Aedes dorsalis), 서울숲모기(Aedes seoulensis), 금빛숲모기(Aedimorphus vexans nipponii), 빨간집모기(Culexpipiens), 작은빨간집모기(Culex tritaeniorhynchus), 지하집모기(Culex pipiens molestus), 줄다리집모기(Culex vagans), 잭손집모기(Culex jacksoni), 미메티쿠스집모기(Culex mimeticus), 중국얼룩날개모기 (Anopheles sinensis), 큰검정들모기(Armigeres subalbatus), 광릉왕모기(Toxorhynchites christophi), 긴얼룩다리모기(Tripteroides bambusa), 또는 반점날개늪모기(Mansonia uniformis)를 포함하는 해충인, 파리목 해충 방제 방법.
  9. 제 1 항에 따른 스트렙토마이세스 아비코엔시스 MJM10673 배양액을 파리목 해충, 파리목 해충의 유충 또는 파리목 해충의 알에 처리하는 단계를 포함하는, 파리목 해충에서 유충호르몬 수용체인 Met(Methoprene-tolerant) 수용체를 조절하는 하는 방법으로, 상기 조절은 상기 Met 수용체의 CYC (Cycle) 단백질과의 이합체 형성을 억제하는 것인, 방법.
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