CN104946553B - 一种枯草芽孢杆菌及其在抗太子参叶斑病中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种枯草芽孢杆菌及其在抗太子参叶斑病中的应用，属于微生物技术领域；所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）JK05，该菌株已于2014年11月25日在中国典型培养物保藏中心（CCTCC）登记保藏，保藏号为CCTCC NO:M 2014595；经平板对峙法测定，菌株JK05对太子参叶斑病病原菌斑点叶点霉的抑制率达到80.33%；本发明同时公开了一种枯草芽孢杆菌在抗太子参叶斑病中的应用；喷施枯草芽孢杆菌JK05菌液可显著降低太子参叶斑病的感病率和感病指数；本发明对于减少化学农药在太子参栽培管理过程中的使用有积极作用，且枯草芽孢杆菌JK05培养条件简单，培养周期短，易于工业化生产及保存，具有良好的开发应用前景。

Description

一种枯草芽孢杆菌及其在抗太子参叶斑病中的应用
技术领域
本发明涉及一种枯草芽孢杆菌及其在抗太子参叶斑病中的应用，具体涉及一种拮抗太子参叶斑病病原菌斑点叶点霉的枯草芽孢杆菌及该枯草芽孢杆菌在抗太子参叶斑病中的应用，属于微生物技术领域。
背景技术
太子参为补益类常用中药，来源于石竹科植物孩儿参Pseudostellaria heterophylla （Miq.） Pax ex Pax et Hoffm.的干燥块根，具有益气健脾、生津润肺的功效（中国药典，2005）。随着市场需求量增加，太子参种植面积和区域迅速扩大，在安徽宣州、福建柘荣、贵州施秉形成三大主产区。但近年来由于耕作制度不合理等原因，太子参各产区病害爆发，其中，叶斑病发病率更是高达30%-55%，导致减产15%-28%，严重影响了太子参的产量和质量，成为制约太子参发展的一个重要因素（钟爱清, 林丛发, 翁琳琳, 等. 水杨酸诱导太子参对叶斑病的抗性. 福建农业学报, 2011, 26(4): 615-619.）。
研究表明，太子参叶斑病是由半知菌亚门、球壳孢目、叶点霉属真菌斑点叶点霉（Phyllosticta commonsii）侵染而引起。针对该病原菌，目前主要采用的是化学防治方法，使用的药剂主要有苯醚甲环唑水分散剂、氟硅唑乳油、百泰、阿米西达水分散剂、菌毒克星、世高水分散剂、平平佳粉剂、波尔多液、多菌灵可湿性粉剂等。化学药剂起效快，但易出现药害、毒害、环境污染，且太子参中的农药残留将直接危害人类健康；另一方面，化学药剂的长期使用易引起病原菌的抗药性，从而降低甚至失去药效，最终导致更严重的危害。因此，迫切需要寻找新的途径以减少化学药剂的使用，为控制太子参叶斑病提供更有效、更安全的治理方法。
生物防治是利用微生物或其代谢产物抑制或杀死病原菌，从而达到防治太子参真菌病害的目的。目前，关于采用生物防治法对太子参真菌病害进行控制和治理的研究及报道较少，经检索，中国专利CN104031863A 和CN104164383A分别公开了一株枯草芽孢杆菌BS-C和一株解淀粉芽孢杆菌BN-D，两者均可高效抑制太子参根际土壤的专化型尖孢镰刀菌，在防治太子参根腐病方面具有应用前景。而关于太子参叶斑病病原菌斑点叶点霉的生物防治研究尚未见报道。本课题组从安徽宣城太子参栽培区的太子参根际土壤中分离筛选到一株高效拮抗太子参叶斑病病原菌斑点叶点霉的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），编号为JK05，直接喷施于植株及根周土壤可显著降低太子参叶斑病的感病率和感病指数。因此，该拮抗菌作为太子参叶斑病生防菌具有极大的应用前景。
发明内容
本发明是提供一种对太子参叶斑病病原菌斑点叶点霉具有高效拮抗活性的枯草芽孢杆菌。
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是提供一种对太子参叶斑病病原菌斑点叶点霉具有高效拮抗活性的枯草芽孢杆菌，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）JK05，现已保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏地址为武汉大学，保藏号为CCTCC NO: M 2014595，保藏日期为2014年11月25日。
本发明所提供的枯草芽孢杆菌JK05在采用平板对峙法进行测定时，对太子参叶斑病病原菌斑点叶点霉的抑制率达到80.33%。
本发明的另一目的提供上述枯草芽孢杆菌在抗太子参叶斑病中的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：将枯草芽孢杆菌JK05进行液体发酵制备成菌液，直接喷施于太子参植株及根周土壤，其施用浓度为106-108 cfu / mL，施用量为20-100 mL / 株，施用菌液后进行正常的田间管理。
所述枯草芽孢杆菌JK05菌液按如下方法制备得到：将冰箱保存的枯草芽孢杆菌JK05斜面转接至LB固体培养基进行活化（27-37 ℃）；将活化后的菌株JK05接种至LB液体培养基，27-37 ℃、110-130 r / min条件下培养12-24 h获得种子液；将种子液接种至LB液体培养基（接种量为1-5%），于27-37 ℃、110–130 r / min条件下培养48-96 h获得JK05菌液，其中JK05芽孢数达到109 cfu / mL以上，用于太子参植株及根周土壤的喷施。
所述LB液体培养基包括以下组分：胰蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH7.0-7.4。
与现有技术相比，本发明的优点是：
（1）未施用枯草芽孢杆菌JK05的对照处理在接种叶斑病病原菌斑点叶点霉30 d后，感病率超过90%，感病指数为90以上；而施用JK05的处理组在接种病原菌30 d后，感病率仅大约40%，感病指数也低于40。可见，枯草芽孢杆菌JK05对降低太子参叶斑病的发病率及感病指数效果显著，对于减少化学农药在太子参栽培管理过程中的使用有积极作用。
（2）枯草芽孢杆菌JK05培养条件简单，培养周期短，易于工业化生产及保存，具有良好的开发应用前景。
说明书附图
图1为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）JK05的抑菌效果试验结果图；图中a、接JK05；b、对照；
图2-4为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）JK05抗太子参叶斑病的作用效果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不局限于此。
牛肉膏蛋白胨培养基的配制：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，琼脂20 g，水1000 ml，pH 7.0-7.4，121 ℃，0.1 MPa，高压灭菌20 min。
PDA培养基的配制：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，水定容至1000 ml，pH自然，121 ℃，0.1 MPa高压灭菌20 min。
LB固体培养基的配制：胰蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，NaCl 10 g/L，琼脂20 g，pH7.0-7.4，121 ℃，0.1 MPa，高压灭菌20 min。
LB液体培养基的配制：胰蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0-7.4，121 ℃，0.1 MPa，高压灭菌20 min。
实施例1
（1）根际细菌的分离纯化
土样为应用“五点采样法”采集自安徽宣城太子参栽培区的太子参根际土，按照土壤微生物常规平板稀释法进行分离。称取根际土样品10 g左右，放入装有玻璃珠的100 mL无菌水中振荡30 min，使其中的土壤颗粒分散均匀，静置5 min后，取土壤悬液的上清液部分进行10倍梯度稀释，依次稀释至10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7，将其中10-5、10-6和10-7的稀释液各取0.1 mL涂布至牛肉膏蛋白胨培养基平板，所有平板置于恒温培养箱中27 ℃培养2-3 d，待平板表面长出菌落后，对菌落进行多次划线分离，通过菌落形态观察结合镜检结果获得纯菌株，于4℃保存备用。
（2）拮抗菌JK05的筛选
按上述方法分离得到的根际细菌进一步采用平板拮抗试验进行拮抗菌的筛选。将太子参叶斑病病原菌斑点叶点霉接种到PDA平板的中央，27 ℃培养7 d至形成菌落，用灭菌后的打孔器在菌落上打孔，获得直径5 mm的菌饼。将斑点叶点霉菌饼接种至另一PDA平板中央，再将分离得到的根际细菌分别呈十字方向点植到菌饼周围，控制与菌饼中心的距离为3cm，同时以仅接种有斑点叶点霉菌饼而未点植根际细菌的平板作为对照，所有平板于27 ℃培养7 d后观察有无抑菌带。
将出现抑菌带的根际细菌在牛肉膏蛋白胨培养基上转接10次，将每一代培养物进行平板拮抗试验，观察其拮抗活性的稳定性。最终从中获得一株拮抗活性高且稳定的细菌菌株，编号为JK05，于4℃保存备用。
（3）拮抗菌JK05的鉴定
提取拮抗菌JK05的基因组DNA，利用通用引物对16srDNA进行扩增及测序，获得1459bp的扩增片段。
测序结果在GenBank数据库中进行同源性序列比对分析，结果显示拮抗菌JK05与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）相关基因片段在序列上具有100%相似值，因此，将拮抗菌JK05鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。
（4）拮抗菌JK05抑菌活性测定
抑菌活性测定（平板对峙法）：在PDA平板中心接入直径5 mm的斑点叶点霉菌饼，挑取拮抗菌JK05在PDA平板两侧沿一直线对称划线接种，与平板中央菌饼相距3 cm，置于27℃培养10 d，观察斑点叶点霉菌落生长情况，并测量其菌落直径，以不接拮抗菌的平板作为对照，抑菌率通过下式进行计算：
经测定，拮抗菌JK05对斑点叶点霉10天抑菌率达80.32%，试验结果见图1。
实施例2
斑点叶点霉孢子悬液的制备：将冰箱保存的斑点叶点霉斜面接种至PDA培养基进行活化（27 ℃）；将活化后的菌种转接至另一PDA培养基，27 ℃培养10 d；将获得的菌落用无菌水洗下，制得斑点叶点霉孢子悬液，并稀释至105cfu / mL。
实施例3
枯草芽孢杆菌JK05菌液的制备：将冰箱保存的枯草芽孢杆菌JK05斜面转接至LB固体培养基进行活化（27 ℃）；将活化后的菌株JK05接种至LB液体培养基，27 ℃、130 r /min条件下培养24 h获得种子液；将种子液接种至LB液体培养基（接种量为5 %），于27 ℃、130 r / min条件下培养96 h获得JK05菌液，其中JK05芽孢数达到109 cfu / mL以上。
实施例4
枯草芽孢杆菌JK05菌液的制备：将冰箱保存的枯草芽孢杆菌JK05斜面转接至LB固体培养基进行活化（30 ℃）；将活化后的菌株JK05接种至LB液体培养基，30 ℃、120 r /min条件下培养18 h获得种子液；将种子液接种至LB液体培养基（接种量为2.5 %），于30℃、120 r / min条件下培养72 h获得JK05菌液，其中JK05芽孢数达到109 cfu / mL以上。
实施例5
枯草芽孢杆菌JK05菌液的制备：将冰箱保存的枯草芽孢杆菌JK05斜面转接至LB固体培养基进行活化（37 ℃）；将活化后的菌株JK05接种至LB液体培养基，37 ℃、110 r /min条件下培养12 h获得种子液；将种子液接种至LB液体培养基（接种量为1 %），于37 ℃、110 r / min条件下培养48 h获得JK05菌液，其中JK05芽孢数达到109 cfu / mL以上。
实施例6
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）JK05抗太子参叶斑病能力的作用效果分析。
于盆钵中栽培太子参种苗，盆栽分为四组，每组30株并设三个重复，各组的处理方法如表1所示。菌液及无菌水喷施方法为：将实施例3中制备的枯草芽孢杆菌JK05菌液稀释至107 cfu / mL，并取50 mL均匀喷施于参苗以及参苗根周土壤，无菌水喷施方法亦相同。病原菌接种方法为：选取参苗植株上部的四片叶片，采用针刺法产生伤口，然后在有伤口的叶片表面喷洒病原菌孢子悬液（喷洒量为2 mL / 株），喷洒病原菌孢子悬液在喷施无菌水或菌液3天后进行。接种病原菌后，每天观察太子参叶斑病的发病情况与程度，并统计感病率和感病指数。
表1 各组参苗处理方法
根据接种叶片正反两面出现病斑的数量及直径进行病情分级，分级标准如表2所示。
表2 病株的分级标准
统计时，按叶片发病程度分别将其归入合适的等级中，根据以下公式进行感病率和感病指数的计算：
感病率=（感病株数/接种株数）×100%
感病指数=∑（各级病株数×该级代表数值）×100 /（总株数×最高一级代表数值）
经观察和统计，供试参苗的感病率和感病指数结果如图2所示。
实施例7
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）JK05抗太子参叶斑病能力的作用效果分析。
于盆钵中栽培太子参种苗，盆栽分为四组，每组30株并设三个重复，各组的处理方法如表3所示。菌液及无菌水喷施方法为：将实施例4中制备的枯草芽孢杆菌JK05菌液稀释至106 cfu / mL，并取100 mL均匀喷施于参苗以及参苗根周土壤，无菌水喷施方法亦相同。病原菌接种方法为：选取参苗植株上部的四片叶片，采用针刺法产生伤口，然后在有伤口的叶片表面喷洒病原菌孢子悬液（喷洒量为2 mL / 株），喷洒病原菌孢子悬液在喷施无菌水或菌液3天后进行。接种病原菌后，每天观察太子参叶斑病的发病情况与程度，并统计感病率和感病指数。
表3 各组参苗处理方法
根据接种叶片正反两面出现病斑的数量及直径进行病情分级，分级标准如表4所示。
表4 病株的分级标准
统计时，按叶片发病程度分别将其归入合适的等级中，根据以下公式进行感病率和感病指数的计算：
感病率=（感病株数/接种株数）×100%
感病指数=∑（各级病株数×该级代表数值）×100 /（总株数×最高一级代表数值）
经观察和统计，供试参苗的感病率和感病指数结果如图3所示。
实施例8
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）JK05抗太子参叶斑病能力的作用效果分析。
于盆钵中栽培太子参种苗，盆栽分为四组，每组30株并设三个重复，各组的处理方法如表5所示。菌液及无菌水喷施方法为：将实施例5中制备的枯草芽孢杆菌JK05菌液稀释至108 cfu / mL，并取20 mL均匀喷施于参苗以及参苗根周土壤，无菌水喷施方法亦相同。病原菌接种方法为：选取参苗植株上部的四片叶片，采用针刺法产生伤口，然后在有伤口的叶片表面喷洒病原菌孢子悬液（喷洒量为2 mL / 株），喷洒病原菌孢子悬液在喷施无菌水或菌液3天后进行。接种病原菌后，每天观察太子参叶斑病的发病情况与程度，并统计感病率和感病指数。
表5 各组参苗处理方法
根据接种叶片正反两面出现病斑的数量及直径进行病情分级，分级标准如表6所示。
表6 病株的分级标准
统计时，按叶片发病程度分别将其归入合适的等级中，根据以下公式进行感病率和感病指数的计算：
感病率=（感病株数/接种株数）×100%
感病指数=∑（各级病株数×该级代表数值）×100 /（总株数×最高一级代表数值）
经观察和统计，供试参苗的感病率和感病指数结果如图4所示。

Claims (8)

1. 一种枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）JK05在抗太子参叶斑病中的应用，所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）JK05，其保藏单位为中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC NO: M 2014595。
2. 根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）JK05在抗太子参叶斑病中的应用，其特征在于，所述应用具体为：将枯草芽孢杆菌JK05进行液体发酵制备成菌液，直接喷施于太子参植株及根周土壤，施用菌液后进行正常的田间管理。
3. 根据权利要求2所述的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）JK05在抗太子参叶斑病中的应用，其特征在于，所述菌液的施用浓度为106-108 cfu / mL，施用量为20-100 mL /株。
4. 根据权利要求2所述的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）JK05在抗太子参叶斑病中的应用，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌JK05菌液按如下方法制备得到：将冰箱保存的枯草芽孢杆菌JK05斜面转接至LB固体培养基进行活化；将活化后的菌株JK05接种至LB液体培养基，培养获得种子液；将种子液接种至LB液体培养基，培养获得JK05菌液，其中JK05芽孢数达到109 cfu / mL以上，用于太子参植株及根周土壤的喷施。
5. 根据权利要求4所述的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）JK05在抗太子参叶斑病中的应用，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌JK05活化所需温度为27-37℃。
6. 根据权利要求4所述的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）JK05在抗太子参叶斑病中的应用，其特征在于，所述活化后的菌株JK05接种至LB液体培养基后的培养条件为27-37℃、110-130 r / min条件下培养12-24 h。
7. 根据权利要求4所述的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）JK05在抗太子参叶斑病中的应用，其特征在于，种子液接种至LB液体培养基的接种量为1-5%。
8. 根据权利要求4所述的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）JK05在抗太子参叶斑病中的应用，其特征在于，种子液接种至LB液体培养基，于27-37℃、110–130 r / min条件下培养48-96 h获得JK05菌液。
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