CN103221532A

CN103221532A - 微生物和含有其的除臭剂

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Publication number: CN103221532A
Application number: CN2011800546161A
Authority: CN
Inventors: 多田宣纪; 松下响; 木邑敏章
Original assignee: Toyota Motor Corp
Current assignee: Toyota Motor Corp
Priority date: 2010-11-15
Filing date: 2011-11-09
Publication date: 2013-07-24
Anticipated expiration: 2031-11-09
Also published as: US8741625B2; US20130236415A1; EP2640828A1; JP2012105556A; CN103221532B; WO2012066749A1; DK2640828T3; EP2640828B1; ES2561281T3; JP5447348B2

Abstract

本发明提供了对作为异味成分的短链脂肪酸有除臭能力的嗜热微生物。公开了对短链脂肪酸有除臭能力的嗜热微生物，其属于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。

Description

微生物和含有其的除臭剂

技术领域

本发明涉及例如具有除臭能力的微生物和含有所述微生物的除臭剂。

背景技术

通常，在用有机残留物如牲畜排泄物制造堆肥时存在大量异味成分挥发的问题。异味成分的实例包括短链脂肪酸，甚至在低浓度时，它们也作为异味成分造成问题。

作为除臭方法相关的常规技术，报道了微生物除臭技术，其中使用特定微生物以及复合微生物来进行除臭。例如，对于硫化合物，报道了通过排硫硫杆菌(Thiobacillus thioparus)和假单胞菌属物种(Pseudomonas sp.)的混合培养物来分解二甲基硫醚(Takahiro Kanagawa和D.P.Kelly，FEMS Microbiology Letters，1986，Vol.34，13-19页)以及通过假单胞菌来分解硫化氢(日本专利公开(Kokai)No.4-262778A(1992))。此外，报道了使用乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)分解吲哚和粪臭素的方法(日本专利公开(Kokai)No.2-53482A(1990))。尽管与硫化合物、吲哚和粪臭素之微生物除臭有关的这些技术有效地部分降低了牲畜排泄物等的异味成分，但它们不能充分地降低例如含有大量短链脂肪酸的牲畜排泄物的异味。

同时，作为针对短链脂肪酸的微生物除臭技术，已知栗褐芽孢杆菌(Bacillus badius)MA001菌株具有除臭能力(FERM BP-4493)(日本专利No.2810308)。然而，由于该栗褐芽孢杆菌MA001菌株的最佳活性温度范围接近常温(约15摄氏度至45摄氏度)，所以在将它们用于制造堆肥等在高温条件下进行的过程时其作用受到极大限制。

发明内容

技术问题

为了实现对制造堆肥过程中的异味成分短链脂肪酸的微生物除臭，需要在制造堆肥过程的高温条件下活跃地发挥功能的微生物。

鉴于上述情况，本发明的一个目的是提供对异味成分短链脂肪酸有除臭能力的嗜热微生物。

问题的解决方案

我们进行了深入的研究以解决上述问题。结果，我们发现了对短链脂肪酸有除臭能力的嗜热微生物，从而完成了本发明。

即，本发明提供了对短链脂肪酸有除臭能力的嗜热微生物，其属于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，例如由保藏编号NITE BP-998所示的地衣芽孢杆菌。在本文中，待除臭的短链脂肪酸的实例包括选自以下的一种或更多种：丙酸、丁酸(正丁酸)、戊酸(正戊酸)和异戊酸(3-甲基丁酸)。

而且，本发明提供了包含上述微生物作为活性成分的除臭剂。包含在所述除臭剂中的微生物可负载于微生物载体。

此外，本发明提供了堆肥的生产方法，其包括向有机残留物添加上述微生物或除臭剂的步骤。

公开于日本专利申请No.2010-255140(本申请要求享有其的优先权)说明书和/或附图中的内容并入本文。

发明的有益效果

根据本发明，可以减少异味成分短链脂肪酸的产生，从而在制造堆肥等过程中进行除臭。

附图简述

图1-1是显示TAB7菌株16S rRNA基因的同源性分析结果的图。

图1-2续接图1-1。

图2显示负载有TAB7菌株的微生物材料对牲畜排泄物中短链脂肪酸的分解的图。

实施方案的描述

以下将对本发明进行详细的描述。

本发明的微生物是对短链脂肪酸有除臭能力的嗜热微生物，其属于地衣芽孢杆菌。在本文中，“对短链脂肪酸有除臭能力”是指通过分解和减少短链脂肪酸从而对短链脂肪酸的异味进行除臭的能力。而且，“嗜热微生物”是指能够在50摄氏度或更高(例如，50摄氏度至60摄氏度，优选55摄氏度至60摄氏度)的高温条件下生长的微生物。本发明的微生物是嗜热的并且在制造堆肥过程的50摄氏度或更高的高温条件下活跃地发挥功能，并且可以分解在制造堆肥(即堆肥生产)过程中带来困扰的作为异味成分的短链脂肪酸，从而对在制造堆肥中产生的或由所得堆肥散发的异味进行除臭。

尽管对通过本发明微生物进行除臭的短链脂肪酸没有具体限制，但其实例包括乙酸、丙酸、丁酸(正丁酸)、异丁酸(2-甲基丙酸)、戊酸(正戊酸)、氢化当归酸(hydrangelic acid)(2-甲基丁酸)、异戊酸(3-甲基丁酸)、特戊酸(2，2-二甲基丙酸)、己酸(正己酸)、庚酸(正庚酸)、辛酸(正辛酸)、壬酸(正壬酸)和癸酸(正癸酸)。具体实例包括选自以下的一种或更多种：丙酸、丁酸(正丁酸)、戊酸(正戊酸)和异戊酸(3-甲基丁酸)。

使用例如制造堆肥过程中的牲畜排泄物作为分离出本发明微生物的来源。从制造堆肥过程中的牲畜排泄物中可分离这样的属于地衣芽孢杆菌的微生物来作为本发明的微生物：其在牲畜排泄物中活跃地发挥功能且可以在高温条件下生长，并且能够有效分解短链脂肪酸从而对其进行除臭。对所分离微生物的除臭能力进行评价的方法的实例包括一种方法，该方法包括：向含有短链脂肪酸的培养基添加所分离的微生物并对其进行培养，培养后，通过气相色谱-质谱等测量培养物中短链脂肪酸的量。如果已加入微生物的培养物中短链脂肪酸的量显著降低，则可确定该微生物对短链脂肪酸具有除臭能力。属于地衣芽孢杆菌的TAB7菌株可成功地通过该方法分离。

TAB7菌株于2010年10月29日以保藏编号NITE P-998保藏于独立行政法人国立技术和评价研究所专利微生物保藏中心(IncorporatedAdministrative Agency National Institute of Technology and Evaluation，Patent Microorganisms Depositary，NPMD)(日本千叶县木更津市上总鎌足2-5-8，292-0818)，然后于2011年9月28日转为根据布达佩斯条约在独立行政法人国立技术和评价研究所专利微生物保藏中心以保藏编号NITE BP-998的保藏。根据细菌学特性和16S rRNA基因的同源性分析(在以下实施例中给出)等，将TAB7菌株鉴定为属于地衣芽孢杆菌的新细菌菌株。应注意本发明的微生物涵盖通过自发或人工诱导突变获得且保持对短链脂肪酸的除臭能力的TAB7菌株的嗜热突变体。

例如，TAB7菌株可以在含有1％葡萄糖、1％酵母提取物、0.1％Na₂HPO₄和0.1％(NH₄)₂SO₄的培养基中在6.0至9.0的pH(例如pH7.0)和25摄氏度至55摄氏度(优选45摄氏度至52摄氏度)温度的条件下培养和生长。应注意用于培养TAB7菌株的培养基可以是一般发酵技术所采用的多种营养培养基的任意种。例如，含有有机营养源(例如肉汤和蛋白胨)和痕量无机营养源的培养基可用于培养TAB7菌株。

同时，本发明的除臭剂是含有上述本发明的微生物作为活性成分的除臭剂。例如，在制造堆肥过程中产生的异味或者堆肥的异味可以这样被除臭：通过向制造堆肥过程中的牲畜排泄物和堆肥添加本发明的除臭剂。还可以使用负载于微生物载体的本发明微生物作为除臭剂中的本发明微生物。尽管对微生物载体没有特别限制，但其实例包括珍珠岩、膨润土、沸石、蛭石、硅藻土、泥煤苔和活性炭。例如，将100ml本发明微生物的培养液(OD660nm处的吸光值为约2.0)添加到1kg的珍珠岩中，然后搅拌约5分钟，从而使得本发明的微生物吸附到珍珠岩。此外，除本发明的微生物外，本发明的除臭剂可包含添加剂如淀粉、油、糠、锯屑、纤维素、碳水化合物、甲壳素、明胶、碳酸钙、硫酸钙、碳酸镁、活性炭、硅藻土、沸石、玻璃、尼龙、尿烷和聚酯。

此外，本发明的堆肥的生产方法(下文中称为“本发明方法”)是利用上述本发明微生物或除臭剂的堆肥生产方法，其中，对向其中添加了所述微生物或除臭剂的有机残留物进行堆肥制造。根据本发明方法，可以对制造堆肥过程中由短链脂肪酸散发的异味进行除臭，从而可以提供几乎没有或完全没有异味的堆肥。用于制造堆肥的有机残留物的实例包括动物的排泄物或者粪尿混合物，包括人和牲畜(例如猪、牛和鸡)的排泄物。

在本发明方法中，例如，向预先适当调整其中水含量(例如水含量比为约60％)的有机残留物，以每kg有机残留物10⁵至10¹³细菌的量添加本发明的微生物或含有所述微生物的本发明除臭剂。所述添加可以在制造堆肥前的任意时间进行。随后，使已添加了本发明微生物或除臭剂的有机残留物进行堆肥制造。通过例如使本发明微生物或除臭剂与有机残留物的混合物发酵来进行堆肥制造。发酵条件的实例包括温度为40摄氏度至75摄氏度(优选50摄氏度至60摄氏度)且时间为2至5周(优选3至5周)。通过该过程，在制造堆肥过程中由短链脂肪酸散发的异味可以被减少，并且可以生产几乎没有或完全没有短链脂肪酸之异味的堆肥。

对根据本发明方法进行堆肥制造期间堆肥中短链脂肪酸的异味或者通过本发明方法生产的堆肥中短链脂肪酸的异味的评价方法的实例包括这样的方法，通过气相色谱-质谱等测量堆肥制造期间堆肥中或者由此生产的堆肥中短链脂肪酸的量。当与用有机残留物进行堆肥制造期间未向其中添加本发明微生物或除臭剂的堆肥或者由此生产的堆肥相比短链脂肪酸的量显著降低时，则可确定根据本发明方法进行堆肥制造期间的堆肥或者通过本发明方法生产的堆肥具有减少的异味，从而是有利的。

或者，可以通过感官评价堆肥中短链脂肪酸的异味。即，多个人检查根据本发明方法进行堆肥制造期间堆肥的气味或者通过本发明方法生产的堆肥的气味，当确定与用有机残留物进行堆肥制造期间未向其中添加本发明微生物或除臭剂的堆肥或由此生产的堆肥相比异味显著减少或完全不存在时，则可确定根据本发明方法进行堆肥制造期间的堆肥或者通过本发明方法生产的堆肥令人不愉快的气味减少，从而是有利的。

实施例

下文将参照实施例对本发明进行更详细的描述；但是，本发明的技术范围不限于这些实施例。

实施例1

有效分解短链脂肪酸并对其进行除臭的微生物的分离以及所述微生物的分类学特性。

1-1.微生物的分离

为了寻找在堆肥制造中发挥活跃作用并且能够在堆肥制造过程中有效分解异味成分并对其进行除臭的微生物，从日本各地饲养牲畜的农户获得堆肥制造过程中的牲畜排泄物，并尝试分离减少异味的微生物。

结果，获得了能够活跃地作用于牲畜排泄物并且在可有效分解短链脂肪酸并对其进行除臭的高温条件下生长的微生物。由此获得的细菌菌株被称为TAB7菌株。

1-2.TAB7菌株的生理学特性

使用“BERGEY′S MANUAL of Systematic Bacteriology，第三卷”和“Manual for the Identification of Medical Bacteria，第三版”中描述的方法并且通过使用API50CHB(bioMerieux，Lyon，France)的测试研究了TAB7菌株的细菌学特性。结果获得了以下发现。

[表1]

TAB7菌株的生长和形态学发现以及细菌学特性

+：阳性-：阴性

如从表1所述的细菌学特性中了解到的，TAB7菌株是运动的革兰氏阳性细菌，其形成孢子但未显示出由孢子造成的细菌体膨胀。它的过氧化氢酶反应为阳性，氧化酶反应为阴性。这些特性与芽胞杆菌属的一般特性相一致。

此外，TAB7菌株发酵甘油、核糖、果糖等，但其不发酵L-木糖、半乳糖等。而且，其显示β-半乳糖苷酶和精氨酸双水解酶活性；不产生3-羟基丁酮(acetoin)；不显示明胶酶活性；不还原硝酸盐。此外，TAB7菌株在10％NaCl中生长并水解酪蛋白和淀粉。经确认这些特性与地衣芽胞杆菌的特性大致相符，通过以下描述的基于16S rRNA基因的鉴定测试提示了这一点。然而，差异是存在的，特别地，差异在于TAB7菌株不产生3-羟基丁酮也不水解明胶。在这方面观察到TAB7菌株与已知的地衣芽胞杆菌菌株不同。

1-3.通过16S rRNA基因序列对TAB7菌株进行分类学鉴定

为了根据基因序列对TAB7菌株进行分类和鉴定，从TAB7菌株的基因组DNA获得16S rRNA基因，根据Biseibutsugaku jikkenho(直译：微生物实验技术)(Kodansha Ltd.)中描述的方法测定所述基因的核苷酸序列。这样鉴定的TAB7菌株16S rRNA基因的一部分核苷酸序列如核苷酸序列SEQ ID NO：1所示。

此外，在DNA核苷酸序列数据库(NCBI(GenBank))中对TAB7菌株16S rRNA的核苷酸序列进行BLAST检索。结果示于图1-1和1-2。如图1-1和1-2所示，TAB7菌株与地衣芽胞杆菌显示最高的同源性。

根据以上结果，将TAB7菌株鉴定为地衣芽胞杆菌的新菌株。

1-4.TAB7菌株在牲畜排泄物中的生长的确认

为了使TAB7菌株在堆肥制造期间稳定发挥功能，TAB7菌株需要在牲畜排泄物成分中生长。为此，使用真正的牲畜排泄物检测TAB7的生长。

从收集自农场的各猪排泄物(水含量比为约60％)和鸡排泄物(水含量比为约60％)中称取100g。然后，在向牲畜排泄物添加400mL经纯化的水后，添加用于培养基的琼脂，以使琼脂的含量为1.5％，对所得混合物进行高压灭菌(121摄氏度20分钟)。

高压灭菌后，将混合物冷却至约室温，在净室(clean room)中，将它们添加到灭菌的培养皿并固化。

使用铂环在如上所述制备的牲畜排泄物培养基中接种TAB7菌株，并在50摄氏度下培养12小时，确认TAB7菌株没有问题地在牲畜排泄物中生长。

实施例2

TAB7菌株对牲畜排泄物中短链脂肪酸的分解

2-1.TAB7菌株的培养

培养需要量的TAB7菌株，并在含有下表2所示成分的培养基中进行增殖。

[表2]

培养基成分：

(1)葡萄糖 1％

(2)酵母提取物 1％

(3)Na₂HPO₄ 0.1％

(4)(NH₄)₂SO₄ 0.1％

将上述培养基成分溶解在经纯化的水中，并将pH调节为7.0，使用高压灭菌器将所得溶液在121摄氏度维持15分钟以灭菌。

然后，将300mL这样生产的培养基添加到500ml的三角瓶中，在其中接种来自预先生产之甘油储液的少量TAB7菌株。伴随搅拌在50摄氏度下培养16小时后，获得吸光度约为2.0(OD660nm)的TAB7菌株培养液。

2-2.将TAB7菌株附接到微生物载体

向1kg珍珠岩(微生物载体)添加100ml上文2-1章节获得的TAB7菌株培养液。然后搅拌所得混合物5分钟以使TAB7菌株吸附到珍珠岩上，从而获得微生物材料。

2-3.用带有TAB7菌株的微生物材料分解牲畜排泄物中的短链脂肪酸

从养猪场获得3至6月龄猪的新鲜排泄物(水含量比为约70％)，使用经干燥的排泄物(水含量比为约20％)以调节水含量，将排泄物的水含量调节为约60％。

向9kg水含量经调节的猪排泄物添加18g上文2-2章节生产的微生物材料(在每g微生物材料中存在约10⁷活TAB7菌株细菌)作为所述测试组(每g牲畜排泄物中含有约2x10⁴TAB7菌株细菌)。另外，使用含有未进行任何添加的猪排泄物的组作为对照组。

使用小型堆肥制造实验单元KAGUYAHIME(Fujihira Industry Co.，Ltd.产品)由这些排泄物制造堆肥。在进行堆肥制造约4天后测量猪排泄物中异味成分短链脂肪酸的浓度。

为测量短链脂肪酸的浓度，首先，测量所收集堆肥样品中的水含量比，将其在60摄氏度下在顶空中维持30分钟后(22ml管)，通过气相色谱-质谱K9(JEOL Ltd.的产品)分离由此挥发的气体以对堆肥中的短链脂肪酸进行定量(所用柱：TC-WAX，ID0.32mm，30m，GL Sciences Inc.的产品)。由此定量的短链脂肪酸的量示于图2。

在图2中，各图表示以下；(A)：堆肥中挥发的丁酸的浓度，(B)：堆肥中挥发的戊酸的浓度，(C)：堆肥中挥发的丙酸的浓度，以及(D)堆肥中挥发的异戊酸的浓度。

如图2所示，确认与对照组(未添加微生物材料的组)相比测试组(添加微生物材料的组)的堆肥中丁酸、戊酸、丙酸和异戊酸分别降低90.1％、77.5％、62.5％和90.1％。

涉及保藏的生物材料

NITE BP-998

本文引用的所有公开出版物、专利和专利申请通过整体引用并入本文。

Claims

1.一种具有针对短链脂肪酸之除臭能力的嗜热微生物，其属于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。

2.根据权利要求1所述的微生物，其中所述短链脂肪酸是选自以下的一种或更多种：丙酸、丁酸、戊酸和异戊酸。

3.根据权利要求1或2所述的微生物，其中所述微生物是由保藏编号NITE BP-998所指定的微生物。

4.一种包含根据权利要求1至3中任一项所述的微生物作为活性成分的除臭剂。

5.根据权利要求4所述的除臭剂，其中所述微生物负载于微生物载体。

6.一种堆肥的生产方法，其包括向有机残留物添加根据权利要求1至3中任一项所述的微生物或根据权利要求4或5所述的除臭剂的步骤。