CN107384817A - 具有酶活性、减少氨及硫化氢的功效的枯草芽孢杆菌菌株及其用途 - Google Patents
具有酶活性、减少氨及硫化氢的功效的枯草芽孢杆菌菌株及其用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及具有酶活性、减少氨及硫化氢的功效的枯草芽孢杆菌菌株及其用途，本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SRCM101269菌株的去除氨及硫化氢的效果非常优异。并且，与只对氨或硫化氢两个中的一个具有减少效果的现有菌株相比，本发明的菌株对氨及硫化氢两者都具有减少效果，因此在产业上非常有用。因此，用本发明的菌株处理家畜粪尿或食物垃圾时，与化学处理相比，能够获得对人体或动物安全且经济的去除恶臭的效果。
Description
技术领域
本发明涉及具有酶活性、减少氨及硫化氢的功效的枯草芽孢杆菌菌株及其用途。
背景技术
有机废弃物总产生量中占据13.9％的畜牧废弃物最近正成为引起各种环境问题的主要污染物质，因此畜牧废弃物的堆肥化不仅能够减少畜牧废弃物所引起的环境污染问题，而且从能够帮助可代替化学肥料的有机肥料的生产和由此带来的农业生产性的提高，以及废弃资源的回收利用的方面来看，畜牧废弃物的堆肥化的功效也非常大。利用家畜粪尿处理的堆肥化方法主要使用利用微生物来分解有机物的方法，即如牛粪等固相的粪尿处理方法。然而，即使工厂的设备已是最优化的，但是每次的家畜粪尿的状态都会不同，而且在处理期间牛粪堆积物中产生的恶臭会引起周边地区居民的严重抱怨而导致社会问题，此外，收集各农家中堆积的家畜粪尿并在堆肥化工厂进行大量处理所需要的时间或经济费用也是不可忽视的问题，因此，利用于堆肥化中的微生物的选择会起到比任何因素更重要的作用。就利用于堆肥化中的微生物的特性而言，最适合的微生物是能够忍受在堆肥化过程中产生的高热的高温性微生物，并且有必要是纤维素酶活性高的菌株，其中所述纤维素酶是分解家畜粪尿中大量含有的纤维的酶。然而，牛粪中产生的恶臭基本上是通过以下渠道产生的，即牛粪中含有的微生物在堆积物中增殖的同时会生成氨和硫化氢等恶臭原因化合物，对此，目前对微生物所引起的恶臭的生物学处理主要是利用氨氧化细菌或硫化细菌来解决问题。已知代表性的分解氨性氮的氮化细菌亚硝化单胞菌(Nitrosomonas)是通过氨单加氧酶(amo，ammonia monooxygenase)的作用将氨性氮转换为亚硝酸性氮，但是已知属于自养细菌(autotrophic bacteria)的亚硝化单胞菌因生长速度比异养细菌慢，而且分解氨所需的热量消耗量高，因此不适合用于以分解氮为目的的家畜粪尿。此外，分解硫化合物的细菌Starkeya novella或硫杆菌(Thiobacillus)，以及已知为分泌硫化物奎宁还原酶(sulfide quinine reductase)的荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)则由于分离或培养条件不是单纯的，因此在减少家畜粪尿的硫化氢方面有所困难。
现有的具有分解氨及硫化合物的能力的微生物在产业化实现上有很多困难，因此最近正积极进行利用芽孢杆菌属(Bacillus sp.)的特性及产业化的研究，其中所述芽孢杆菌属(Bacillus sp.)参与中温到高温的堆肥化的全部过程，与在高温的堆肥化过程中未被发现的霉菌或酵母相比细胞增殖速度快，并且即使不是高温性细菌也能形成孢子，从而在中温步骤中再次生长并参与发酵。尤其，芽孢杆菌属是生成耐热性孢子的革兰氏阳性菌，并作为异养细菌在分解家畜粪尿中含有的糖类时具有能够分泌有效酶的能力，并且增殖或培养条件比较快且单纯。此外，可在堆积的家畜粪尿的兼性厌氧条件下进行增殖，并且具有能够分解作为水分调节剂而添加的锯屑、稻草或落叶等木质成分的酶，因此被认为是适合用于牛粪堆肥化的微生物。
另外，韩国公开专利第2013-0055564号中公开了“有机废弃物的处理方法”，韩国授权专利第0430298中公开了“可添加到畜牧饲料及用于处理畜粪的微生物制剂”，但是完全没有公开如本发明中所述的关于“具有酶活性、减少氨及硫化氢的功效的枯草芽孢杆菌菌株及其用途”的技术。
发明内容
要解决的技术问题
本发明是根据上述要求而提出的，本发明中，从传统酱类分离出枯草芽孢杆菌，并在评价功能性的延长的范围内确认是否存在分解氨的酶氨单加氧酶(amo)基因，并选取可适用于牛粪堆肥化的菌株。此外，对作为家畜粪尿的牛粪和牛粪中添加鸡粪及木质成分的混合粪进行了恶臭的减少及有效成分的含量分析，并且为了确认家畜粪尿的堆肥化适用可能性，制作了以特定量混合牛粪、鸡粪及作为水分调节剂的锯屑的堆肥坛，并确认了通过复合恶臭的减少和纤维素含量的减少来最终筛选出的菌株枯草芽孢杆菌SRCM101269的堆肥适用特性。因此，确认了本发明中分离的枯草芽孢杆菌SRCM101269菌株具有酶活性的同时减少氨及硫化氢的功效优异，因此不仅能够有效利用于畜牧废水、畜牧粪尿等有机物的分解，而且还能够有效利用于如食物垃圾等有机物的分解，从而完成了本发明。
技术方案
为了解决上述问题，本发明提供具有酶活性、减少氨及硫化氢的功效的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SRCM101269菌株。
此外，本发明提供用于去除氨及硫化氢所引起的恶臭或用于分解有机物的微生物制剂，其含有选自所述菌株、所述菌株的培养物、所述培养物的浓缩液及干燥物中的一种以上作为有效成分。
此外，本发明提供去除氨及硫化氢所引起的恶臭或分解有机物的方法，所述方法将选自所述菌株、所述菌株的培养物、所述培养物的浓缩液及干燥物中的一种以上与畜牧废水、畜牧粪尿或食物垃圾一起培养。
发明效果
本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SRCM101269菌株的去除氨及硫化氢的效果优异。并且，与只对氨或硫化氢两个中的一个具有减少效果的现有菌株相比，本发明的菌株对氨及硫化氢两者都具有减少效果，因此在产业上非常有用。因此，用本发明的菌株处理家畜粪尿或食物垃圾时，与化学处理相比，能够获得对人体或动物安全且经济的去除恶臭的效果。
附图说明
图1是基于SRCM101269菌株的16S rRNA基因序列制作出的系统树图。重复进行自展(bootstrap)分析1,000次。
图2示出为了检测出枯草芽孢杆菌SRCM101269菌株的氨单加氧酶基因而利用特异引物的产物的琼脂糖凝胶电泳结果。PCR产物大小为295bp。泳道(lane)：M，DNA大小标记；1，SRCM101269的PCR产物。
图3示出牛粪及混合粪的分解期间的亚硝酸盐浓度变化。混合粪是通过混合牛粪(70％)、鸡粪(10％)及水分调节剂锯屑(20％)来制备。直线是牛粪中的亚硝酸盐浓度，虚线是混合粪中的亚硝酸盐浓度，圆形符号为对照组(实心圆形，牛粪；空心圆形，混合粪)，四角形符号为欧洲亚硝化单胞菌(Nitrosomonas europaea)(实心四角形，牛粪；空心四角形，混合粪)，三角形符号为SRCM101269(实心三角形，牛粪；空心三角形，混合粪)。
图4示出牛粪及混合粪的分解期间的硫酸盐(sulfate)浓度变化。混合粪是通过混合牛粪(70％)、鸡粪(10％)及水分调节剂锯屑(20％)来制备。直线是牛粪中的硫酸盐浓度，虚线是混合粪中的硫酸盐浓度，圆形符号为对照组(实心圆形，牛粪；空心圆形，混合粪)，四角形符号为欧洲亚硝化单胞菌(实心四角形，牛粪；空心四角形，混合粪)，三角形符号为SRCM101269(实心三角形，牛粪；空心三角形，混合粪)。
图5是将混合牛粪(70％)、鸡粪(10％)及水分调节剂锯屑(20％)来制备的混合粪作为对象，按照时间段分析根据枯草芽孢杆菌SRCM101269菌株的接种的控制复合恶臭的能力的结果(□，对照组；■，枯草芽孢杆菌SRCM101269)。
图6是将混合牛粪(70％)、鸡粪(10％)及水分调节剂锯屑(20％)来制备的混合粪作为对象，按照时间段分析根据枯草芽孢杆菌SRCM101269菌株的接种的纤维素含量变化的结果(□，对照组；■，枯草芽孢杆菌SRCM101269)。
具体实施方式
为了实现本发明的目的，本发明提供具有酶活性、减少氨及硫化氢的功效的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SRCM101269菌株。
本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SRCM101269是从传统的酱类分离的，分离菌株的酶活性、减少氨及硫化氢气体的能力优异，并且，对16S rRNA进行分析的结果确认为枯草芽孢杆菌菌株，因此，将上述菌株于2016年3月7日保藏于韩国微生物保藏中心(保藏编号：KCCM11817P)。
所述枯草芽孢杆菌SRCM101269菌株的分离及增殖可通过本领域公知的任一方法来进行。
本发明中，所述枯草芽孢杆菌SRCM101269菌株是对饲养家畜时产生的废水或粪尿的恶臭或食物腐败时产生的恶臭，尤其对氨及硫化氢成分显示出强烈的减少效果的有效微生物。所述氨成分为氨性氮，是在氮化合物中以氨或铵盐的形式存在的氮，其为在蛋白质被分解时或家畜的排泄物或家畜的排泄物被堆肥化的过程中产生的恶臭的主要原因之一。当氨性氮流入到水中时，也会成为鱼贝类集体死亡的原因，并且用作水污染指标。此外，还会弱化家畜的免疫力，提高疾病的发生率，降低家畜的成长。所述硫化氢成分为氢的硫化物，是具有恶臭的无色有毒气体，多发生在石油精制、石油化学、药品制备、粪尿处理厂等中，是具有爆炸性的气体。对人体造成的影响有引起窒息作用、神经系障碍、呼吸或中枢麻痹等，而且还会引起头痛、呕吐、眩晕症、消化器官障碍、低血压症、步行障碍等。
本发明一实施方案的菌株中，所述酶活性可以是淀粉酶(amylase)活性、蛋白酶(protease)活性、纤维素酶(cellulase)活性及木聚糖酶(xylanase)活性，但并不限定于此。
此外，本发明提供用于去除氨及硫化氢所引起的恶臭或用于分解有机物的微生物制剂，其含有选自所述枯草芽孢杆菌SRCM101269菌株、所述菌株的培养物、所述培养物的浓缩液及干燥物中的一种以上作为有效成分。
本发明一实施方案的微生物制剂中，所述有机物可以是畜牧废水、畜牧粪尿或食物垃圾，但并不限定于此。
本发明的培养物是表示在培养基或培养液中培养的特定微生物的培养物，所述培养物可以包含特定微生物或也可以不包含特定微生物，但是优选包含微生物。所述培养物的剂型可以是液体或固体，但并不限定于此。
本发明中，所述微生物制剂可以是固体或液体形态。就所述固体形态的微生物制剂而言，将所述微生物附着于载体上，然后进行干燥至水分含量为0.1～10重量％，并可以以珠子(bead)形态进行产品化或粉碎后以粉末形态进行产品化。当水分含量超过10重量％时，微生物的再活化效率会降低，或者恶臭去除效果的增加甚微，因此，从经济上不优选。使用固体形态的微生物制剂时，具有以下优点，即制备工序简单，产品的生产费用低，保存性优异。
所述载体可以使用选自粉末状的粘土类、活性炭、焦炭、火山灰及粉煤灰中的一种以上，所述粘土类可以使用选自沸石、蛭石、硅藻土、高岭土、陶土、长石及滑石中的一种以上，但并不限定于此。
所述固体形态的微生物制剂中可以添加赋形剂。所述赋形剂可以单独使用氨基酸、维生素C、维生素E、酮酸及葡萄糖或混合其中的两种以上来使用，但并不限定于此。
就所述液体形态的微生物制剂而言，为了混合所述微生物的培养物并稳定微生物，可以在混合葡萄糖或甘油后制备成最终浓度为10～30重量％，优选可以制备成最终浓度为20重量％，但并不限定于此。当微生物少于10重量％时，微生物制剂的恶臭去除效果会甚微，当微生物超过30重量％时，恶臭去除效果的增加会甚微，因此，在经济上不优选。使用液体形态的微生物制剂时，具有以下优点，即活性比粉末产品快，使用方便。
此外，本发明提供用于去除恶臭或用于分解有机物的微生物制剂的制备方法，其包括培养所述枯草芽孢杆菌SRCM101269菌株的步骤。
所述枯草芽孢杆菌SRCM101269菌株的培养可以通过本领域公知的任一方法来进行，微生物制剂可以制备成固体或液体形态。
作为制备成固体形态的一例，可通过制备成珠子(bead)的方法来制备，所述方法包括以下步骤：(a)将0.1～5.0重量％的如褐藻胶(alginate)、果胶(pectin)、角叉菜胶(carrageenan)或聚天冬氨酸(polyaspartic acid)等负电荷生物降解性高分子的溶液和枯草芽孢杆菌SRCM101269菌株培养液的混合物滴入于浓度为0.5～3.0重量％的包含Ca2+、Cu2+、Zn2+、Ni2+、Co2+、Mn2+、Al2+、Fe2+或Mg2+的金属盐溶液中，从而制备珠子；以及(b)将所述珠子浸渍于0.1～3.0重量％的如酮酸、酮酸衍生物或聚赖氨酸(polylysine)等正电荷生物降解性高分子的溶液后进行搅拌，从而通过静电引力来涂布珠子。通过如上所述的方法制备的微生物制剂可以进行冷冻干燥后直接使用，还可以为了提高微生物的生存及活性效果的持续性而进一步实施以下步骤，使得在其外部形成更厚的生物降解性高分子膜，从而提高微生物制剂的效果持续性，上述进一步实施的步骤包括：(c)用50mM乙酸钠(pH为5.5)洗涤所述珠子，从而去除余量的正电荷生物降解性高分子物质；(d)将所述珠子浸渍于0.1～2.0重量％的负电荷生物降解性高分子溶液后进行搅拌；以及(e)用生理盐水洗涤所述珠子，然后浸渍于0.1～2.0重量％的正电荷生物降解性高分子溶液后进行搅拌，从而形成外模。
此外，本发明提供去除恶臭或分解有机物的方法，所述方法将选自枯草芽孢杆菌SRCM101269菌株、所述菌株的培养物、所述培养物的浓缩液及干燥物中的一种以上与畜牧废水、畜牧粪尿及食物垃圾一起培养。
当使用所述菌株、所述菌株的培养物、所述培养物的浓缩液或干燥物时，能够在不会产生二次污染的前提下减少恶臭，因此具有土壤改良及环境改善的效果。
下面，通过实施例来对本发明进行详细说明。但是，下述实施例仅用于例示本发明，本发明的内容并不限定于下述实施例。
材料及方法
微生物的分离及选取
为了芽孢杆菌属(Bacillus sp.)菌株的选取，收集了淳昌(Sunchang)地区市售的传统酱类，取出1g的收集的试料，并通过连续稀释法涂抹于营养琼脂(NA)(Difco TM)培养基进行培养，然后利用微生物的形态学差异进行一次选取，再次进行纯培养并分离了菌株。为了在下次实验中使用选取的微生物，在-80℃下保管并使用。
细胞外酶活性的测定
为了在分离菌株中选取发酵特性中如淀粉酶(amylase)、蛋白酶(protease)、纤维素酶(cellulase)、木聚糖酶(xylanase)等细胞外酶活性高的芽孢杆菌菌株，利用纸片法，并且使用含有能够与各个酶进行特异性反应的底物成分的固体选取培养基。为了调查对选取的菌株的细胞外酶活性，将选取的菌株接种于营养液体培养基(NB)(Difco TM)并以37℃、200rpm进行摇床培养18小时，然后在12,000rpm、4℃下进行离心分离15分钟，从而取得培养上清液并用作粗酶液。蛋白酶的活性是通过以下方法来调查：制备以脱脂乳作为底物并在2％的脱脂乳(Difco TM)中添加1.5％的琼脂的脱脂乳琼脂培养基，并用0.45μm膜(赛多利斯(Sartorius)公司)对各个选取的菌株的培养上清液进行除菌，然后分别以20μl的量分配到已准备的6mm纸片(ADVANTEC公司)上，并在37℃下进行反应24小时，然后以透明圈(Clear zone)的直径来调查分解能力。淀粉酶活性是通过以下方法来调查：在含有1％的水溶性淀粉(西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)公司)的淀粉琼脂培养基中对选取的菌株的培养上清液进行除菌，并以20μl的量分配到已准备的纸片上。以20μl的量分配到已准备的纸片后在37℃下反应24小时，以透明圈的直径来调查分解能力。纤维素酶生成能力是通过以下方法来测定：在含有1％的CMC(carboxylmetyl-cellulose(羧甲基纤维素)，西格玛奥德里奇公司)的CMC固体培养基中放置纸片，分配20μl的粗酶液并在37℃下培养18小时，然后用0.1％的刚果红溶液进行染色15分钟后用蒸馏水洗涤并进行干燥，然后测定没有被染色的透明圈。木聚糖酶活性是通过以下方法来确认：在以1％的木聚糖(西格玛奥德里奇公司)作为底物的固体培养基中放置纸片，并通过与纤维素酶生成能力的测定方法相同的方法来测定透明圈的大小，从而选取活性优异的菌株。
选取的菌株的鉴定
为了通过最终选取的菌株的16S rRNA基因的碱基序列来进行鉴定，使用通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'：SEQ ID NO：1)和1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'：SEQ ID NO：2)对基因进行扩增，然后使用BigDye终止子v3.1循环测序试剂盒(BigDyeterminator v3.1Cycle Sequencing kit)(Applied Biosystems Inc.(美国应用生物技术有限公司))来解读1,443bp，其中所述1,443bp包含鉴定中重要的可变碱基区域(Chakravorty et al.，2007J.Microbiol.Methods 69，330-339)。利用解读的碱基序列在BLASTN检索和核糖体数据库项目第10版(Ribosomal Database Project，RDP)(http://rdp.cme.msu.edu)的SeqMatch(序列匹配)程序中调查同源性高的标准菌株的16S rRNA基因碱基序列，并利用CLUSTAL W(Thompson et al.，1994Nucleic Acids Res.22，4673-4680)对碱基序列进行了相互比较。为了进行系统图分析，将确保的菌株的16S rRNA碱基序列进行排列，并通过色谱图的视觉性观察和手工操作进行修正使得差距最小化，然后使用基于Tamura-Nei模型的极大似然(Maximum Likelihood)方法(Tamura and Nei，1993Mol.Biol.Evol.10，512-526)制作了系统树(phylogenetic tree)(图1)。为了在算出的各个系统树中提高各分支的统计学可信度，重复进行自展(bootstrap)分析1,000次，系统分析和自展分析则使用了MEGA程序(Tamura et al.，2011Mol.Biol.Evol.28，2731-2739)。
对于选取的菌株是否具有氨单加氧酶基因的调查
为了确认最终选取的菌株是否具有分解氨的基因，利用作为指示菌株的枯草芽孢杆菌168(登录号：NC_000964)的氨单加氧酶基因信息来制作引物(正向：5'-TGGATGGATGATCGGAACAC-3'；SEQ ID NO：3，反向：5'-GGTGCCGACAAAGCTAGTCA-3'；SEQ IDNO：4，产物大小为295bp)，从而实施了菌落PCR(聚合酶链式反应)。用于扩增氨单加氧酶基因的PCR条件为在95℃下进行初期变性5分钟，然后在95℃下变性1分钟，在54℃下结合30秒钟，在72℃下扩增1分钟，并重复35次，在72℃下进行最后扩增5分钟。对于通过PCR获得的产物，则利用1.0％的琼脂糖凝胶(Lonza公司)并通过电泳来确认了是否存在氨单加氧酶基因。
对于选取菌株的减少恶臭的能力的测定
为了分析减少恶臭的能力，使用氨氧化细菌欧洲亚硝化单胞菌(Nitrosomonaseuropaea，KCTC12270)和已知为去除硫化氢的菌Starkeya novella(KCTC2845)作为标准菌株，并使用在与最终选取的菌株的比较研究中。欧洲亚硝化单胞菌是接种于添加有硫酸铵的无机营养培养基#464(http://kctc.kribb.re.kr)，选取的菌株和Starkeya novella是分别接种于NB(Difco公司)，并在37℃、200rpm下进行摇床培养18小时，然后取1ml的培养液接种于实验组，在实验组中接种1ml的灭菌蒸馏水来代替培养液的则作为对照组。实验组使用了从超过检测界限值的淳昌地区收集的、恶臭严重的牛粪试料和混合粪(牛粪、鸡粪、其他木质成分的混合粪)，分别取5g的各个试料加入50ml的管中，并接种菌株，然后在光培养基(WooilBio F&M)中在37℃下进行静置培养，并同时用作用于测定氨和硫化氢气体量的变化和残留的硝酸盐及硫酸盐的变化的分析试料。
对于氨(NH3)和硫化氢(H2S)气体量的测定
关于氨和硫化氢气体量的变化，则使用可进行实时数据记录且能够测定的分解能力的检测界限达100ppm的复合气体检测器(Multi-RAE Lite，RAE System公司)进行测定。就用于测定的试料而言，将试料作为对象从培养前0天开始测定了9天，其中测定的时间间隔为3天。在测定前利用纯空气进行零点修正，然后利用制造商提供的50ppm的氨和25ppm的硫化氢标准气体(CALCAZ公司，美国)进行修正，然后进行测定，测定方法包括以下步骤：用50ml的注射器(syringe)采集气体并喷洒于检测器的测定部位，并记录测量到的数值，重复3次后取平均值用作结果值。
对于生成亚硝酸盐(NO2 -)和硫酸盐(SO4 2-)的测定
就NO2 -的生成量而言，通过利用格里斯(Griess)试剂的亚硝酸盐/硝酸盐检测试剂盒(西格玛奥德里奇公司)，并将前述的为了测定选取菌株的减少恶臭的能力而准备的试料作为对象，测定处理组内存在的稳定的氧化物NO2 -来进行分析。对该方法进行简单记述时，则如下所述。在包含对照组在内的实验组中添加蒸馏水而制备悬浮液，并将其移至1.5ml的管中，在12,000rpm、4℃下进行离心分离15分钟，然后取上清液并在12,000rpm、4℃下进行离心分离3分钟，然后将80μl的上清液放入96孔板的各个定好的容器中，并加入20μl的缓冲溶液进行调节，使反应液达到100μl，然后添加50μl的格里斯试剂A溶液并均匀混合后在室温放置5分钟，之后添加50μl的格里斯试剂B溶液并均匀混合后在室温放置10分钟而诱导显色，并且利用平板读数仪(帝肯(TECAN)公司，文尼多夫(Mannedorf))在540nm下测定吸光度，将亚硝酸盐标准曲线作为基准测定NO2 -生成量。对所有试料进行重复实验，并利用从标准曲线得到的线性回归方程式来定义为1mg的牛粪或混合粪试料中含有的NO2的μM浓度，所述标准曲线的制作方法为：将NaNO2作为标准溶液，通过连续稀释来进行反应，并在540nm下测定吸光度，然后基于结果值制作定量标准曲线。此外，试料组中残留的SO4的浓度是对Kolmert等(2000J.Microbiol.Methods 41，179-184)方法进行变形后用其测定的。将Na2SO4作为标准溶液并通过连续稀释来制作定量标准曲线而算出结果值，前述的牛粪或混合粪的试料是进行稀释后以25μl的量分别添加到微孔板中，然后添加125μl的蒸馏水进行混合，然后在405nm下测定了吸光度，并将各个值用作对照组。之后，添加40μl的沉淀溶液(在1L的蒸馏水(D.W.)中有1％的氯化钡、1％的氯化钠、0.025％的明胶、5ml的浓缩盐酸盐(hydrochloride))进行混合，并在室温下反应5分钟，然后在405nm下测定了吸光度，利用从标准曲线得到的线性回归方程式定义为1mg的牛粪或混合粪所含有的SO4的mM浓度，为了测定SO4而使用的试剂均购买西格玛奥德里奇公司的产品。
控制复合恶臭的能力和分解纤维素的能力
为了调查控制复合恶臭的能力，通过混合牛粪(70％)、鸡粪(10％)及作为水分调节剂的锯屑(20％)来制作了小型堆肥化装置发酵池。在制作的发酵池中接种0.25％的SRCM101269培养液并用作用于分析的试料，作为对照组则制作了没有进行接种的发酵池，并进行了比较。利用可对氧、有毒可燃性气体及挥发性有机化合物进行复合测定或单独测定的便携式复合气体检测仪iBrid MX6(英思科公司(Industrial Scientific))，每天在小型堆肥化装置发酵池的上层部分的特定位置测定了复合恶臭的变化量。此外，为了在小型堆肥化装置中调查正在发酵中的堆肥试料的纤维素分解能力，以一周为间隔采集试料42天，并在60℃下处理24小时，待完全干燥后均质化为微细粉末，并对Updegraff(1969Anal.Biochem.32，420-424)的方法进行变形后用其进行测定。每个试料各取0.5g并添加10ml的浓硫酸(98％)，然后在25℃的恒温水槽中进行预处理1小时，然后通过标准校正曲线法进行了分析。为了对试料内的纤维素进行定量分析，制作了标准校正曲线，然后利用结果值并利用试料分析结果调查了试料的纤维素分解能力，其中所述标准校正曲线是通过以下方法来制作：将20μm以下的结晶质微细纤维素(西格玛奥德里奇公司)作为标准溶液并在620nm下测定吸光度而制作了标准校正曲线。
实施例1.从传统发酵食品分离芽孢杆菌菌株
为了牛粪的堆肥化，选取了如下所述的功能性芽孢杆菌菌株，所述菌株可以不是高温性细菌，但应能够形成孢子并在中温步骤中再次发芽及生长，从而能够参与发酵(Ryckeboer et al.，2003J.Appl.Microbiol.94，127-137)的功能性芽孢杆菌菌株，为了选取所述功能性芽孢杆菌菌株，收集了在全罗北道淳昌郡制备的约112种酱类，并对收集的试料进行培养，然后用肉眼根据菌落的形状、颜色等形状差异分离出共146种细菌。为了将分离的菌株作为对象测定牛粪肥料化所需的酶活性，在NB液体培养基中培养并用在下述实验中。
实施例2.分离菌株的细胞外酶活性分析
通常的堆肥化过程是以有机物分解时所产生的高温作为基准而分为主发酵(活性堆肥(active composting))和腐熟(后发酵，熟化(maturation))步骤，主发酵过程是有机物的分解积极进行的时期，是能够维持高温而会产生动植物及病原菌的杀灭和去除恶臭的效果。已知主要产生这种有效反应的主发酵过程是堆肥化工艺中最主要的步骤，其不仅是对多种分解产物到稳定化的有机物产生较大影响的时期，而且还是对整个堆肥化工艺时间的缩短或迟延也产生较大影响的时期(Papadimitrious and Balis，1996CompostSci.Util.4，52-61)。在主发酵期间产生的各种有机物成分的分解也大部分是通过微生物分泌的细胞外酶来进行分解，因此，微生物的酶的活性会对随着堆肥化的进行而出现的物理化学性环境变化带来较大影响。因此，将分离的微生物作为对象，通过定性分析对细胞外酶中被认为与牛粪的堆肥化关联度高的淀粉酶(amylase)、蛋白酶(protease)、纤维素酶(cellulase)及木聚糖酶(xylanase)的活性进行了调查(表1)。
[表1]
分离菌株的细胞外酶活性
a酶活性＝透明圈的大小/纸片的大小(6mm)
结果显示，分离菌株中共7个菌株对4种酶具有活性，其中SRCM101269菌株具有均匀的酶活性，即，SRCM101269菌株对于在主发酵步骤中对初期产生影响的蛋白酶和淀粉酶的活性最优异，并且同时显示出主要在发酵后期显示活性且已知为参与木质纤维素(lignocelluloses)分解(Kim et al.，1997Korean J.Microbiol.33，267-273)的纤维素酶和木聚糖酶活性，尤其在透明圈的大小和透明度方面最优异，因此将其选取为最终菌株。据报道(Atkinson et al.，1996Compost Sci.Util.4，14-23)称，通常主发酵所需的时间会受到构成堆肥化原料的有机物的分解效率的很大影响，并且与只对一种酶显示活性相比，对蛋白质、脂质、碳水化物等高分子物质的各种水解酶的活性均优异时，在堆肥化时间及费用上能够获得理想的结果，从而能够确认SRCM101269的牛粪适用可能性。
实施例3.分子生物学鉴定及系统树的制作
为了最终选取的SRCM101269的鉴定，对16S rRNA基因碱基序列进行了分析。在GenBank(基因库)中对分析结果进行BLAST检索的结果，确认为枯草芽孢杆菌(B.subtilis)，利用碱基序列在SeqMatch(序列匹配)程序中与同源性高的标准菌株进行相互比较的结果，与枯草芽孢杆菌DSM 10显示出99％的相似性。基于16S rRNA碱基序列制作了系统树，并对系统树进行了分析(图1)，最终命名为枯草芽孢杆菌SRCM101269。
实施例4.调查是否具有分解氨的基因(氨单加氧酶)
在对如牛粪、猪粪、鸡粪等家畜粪尿进行肥料化的过程中最大的困难之一是会产生如氨等令人讨厌的气体，这种问题不仅对使用家畜粪尿的农家带来不好的影响，而且还会成为引起周边居民的抱怨的原因，并且对周边农作物的生长发育也会产生不好的影响，因此有效去除氨气体在粪尿的肥料化中非常重要。粪尿中产生的恶臭的主要原因在于硫化氢和氨，尤其在氨气体的浓度高于50mg/L时，在厌氧性腐熟及寒冷地区会产生冻结(Ryckeboer et al.，2003J.Appl.Microbiol.94，127-137)。目前为止，已知的与氨相关的研究有如下述研究等各种研究正在进行：利用尿素分解酶(Urease(尿素酶))的酶作用抑制剂的氨的产生的研究(Varel，2002A review.J.Anim.Sci.80，E1-E7)，可去除粪尿的恶臭和氨性氮且具有发酵促进功效的微生物的选取(Kim et al.，2003KoreanJ.Biotechnol.Bioeng.18，466-472)、关于为了猪粪堆肥化而进行的芽孢杆菌属菌株的分离鉴定和去除液体肥料恶臭的研究(Kim et al.，2004Korean J.Microbiol.40，154-159)，但是，大部分都是与微生物选取和效果相关的研究为主进行。因此，为了更容易更简便地确认氨的分解与否，利用NCBI数据库并基于枯草芽孢杆菌168的基因组数据，对与氨单加氧酶(ammonia monooxygenase)相关的基因进行检索，并利用其制作了特异引物。利用制作的引物进行PCR，然后用电泳对最终选取的菌株枯草芽孢杆菌SRCM101269的条带(band)进行确认的结果，分析出其具有氨单加氧酶(图2)。因此，确认了SRCM101269菌株为具有分解氨的能力的菌株，也是具有去除氨性恶臭的效果的菌株。
实施例5.通过测定氨和硫化氢来分析减少恶臭的能力
已知牛粪堆积时产生的恶臭的主要原因在于氨和硫化合物的复合气体的生成(Ohet al.，2006Korean J.Odor Res.Eng.5，1-9)，为了去除这种恶臭，近期正积进行关于利用生物过滤(biofiltration)的生物学处理系统的研究(Kim et al.，2000J.Hazard.Mater.72，77-90)，但是目前在牛粪的发酵时直接添加微生物来控制硫化氢和氨气体的研究是不足的(Kuroda et al.，2004Biosci.Biotechnol.Biochem.68，286-292)。有报道称，尤其与利用其他粪尿的情况即混合有鸡粪的情况相比，在利用牛粪进行堆肥化的情况下，在恶臭度评价中测出的硫化合物的浓度比氨的浓度更高(Jang et al.，2009Impact Assessment 19，29-38)。在牛粪试料的情况下，使用硫化合物分解细菌Starkeya novella作为标准菌株，并与选取菌株进行比较，在添加有鸡粪的混合粪的情况下，使用分解氨的代表性细菌欧洲亚硝化单胞菌作为标准菌株，并通过比较研究对最终选取菌株的减少恶臭的能力进行了相对性评价。首先，在牛粪的情况下，通过未接种菌株的对照组可以确认因牛粪试料中含有的其他微生物菌群而使氨气体得到分解，并且确认了对照组和接种Starkeya novella的实验组没有显示出大的差异，但是在接种选取菌株SRCM101269的实验组中，在经过发酵6天后确认了氨气体比对照组减少了2倍以上，9天后氨气体的浓度减少至不足10ppm。此外，在混合粪的情况下，确认了在发酵第3天包括对照组在内的所有实验组的氨气体浓度平均减少了30ppm的水平，3天后在接种对照组和欧洲亚硝化单胞菌的实验组中随着发酵时间变长未显示出大的变化，但是在接种SRCM101269的混合粪中，在3天以后氨气体也持续减少，在发酵经过9天后氨气体减少至11ppm(表2)。另一方面，就硫化氢而言，在牛粪和混合粪中对照组及比较实验组均没有显示出浓度变化，但是在接种SRCM101269的实验组中，发酵经过9天后牛粪和混合粪均平均减少了65ppm水平(表2)，由此确认了与标准菌株相比，通过本发明选取的SRCM101269的减少氨和硫化氢的效果均优异而具有优异的减少恶臭的能力，因此SRCM101269是可适用于牛粪及混合粪的肥料化的菌株。
[表2]
因接种的菌株而使牛粪及混合粪被分解的期间所产生的NH3气体的变化
a混合粪是通过混合牛粪(70％)、鸡粪(10％)及作为水分调节剂的锯屑(20％)来制备。
bMultiRAE Lite，RAE系统具有对分解能力的分析的检测范围(NH3，0-100ppm；H2S，0-100ppm)。
实验是重复三次(P<0.05)。
实施例6.通过测定亚硝酸盐(NO2 -)和硫酸盐(SO4 2-)来分析减少恶臭的能力
为了对发酵期间产生的气体所包含的氨和硫化氢在牛粪和混合粪试料中通过微生物引起的代谢过程而积累为亚硝酸和硫酸盐的量进行分析，测定了亚硝酸盐和硫酸盐的浓度变化。已知代表性的亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas sp.)系列的微生物会通过硝酸化过程将氨氧化为亚硝酸和硝酸来获得能量，将氨转换为亚硝酸的细菌称为氨氧化细菌，将亚硝酸转换为硝酸的细菌称为亚硝酸氧化细菌。这些微生物利用NH4、NO2、NO3等多种形态的氮，氮化合物的转换会使氮化合物的氧化形态发生变化，从而实现氮的循环。利用这种代谢过程，并通过微生物的分离到适用的多种研究，将微生物利用在氨性恶臭的去除中，所述微生物的分离到适用的多种研究为如氨及亚硝酸性氮氧化细菌菌株的分离、用于改善畜牧环境的去除氨的微生物的探索及分离等。因此，通过将最终选取菌株SRCM101269的亚硝酸浓度的变化与欧洲亚硝化单胞菌进行比较，对减少氨的功能进行调查的结果(图3)，在牛粪的情况下，对照组在经过3天后亚硝酸盐急剧增加，但是6天后维持与其他试料相同的浓度而并没有显示出大的差异，但是在混合粪的情况下，虽然对照组中没有显示出大的变化，但是在接种欧洲亚硝化单胞菌和SRCM101269的实验组中在6天以后约增加2倍左右，尤其与接种欧洲亚硝化单胞菌的实验组相比，在接种SRCM101269的实验组中产生了更积极的氨氧化作用而显示出最高的数值。与前述的氨气体检测结果进行比较时可以确认，在混合粪中氨气体被氧化而积累为亚硝酸，因此显示出浓度增加的相关关系，并且在混合粪中通过氮氧化机制来减少氨。
就分解硫化类恶臭的能力而言，硫具有多种氧化状态，并以有机物和无机物的形态存在，并且通过因微生物引起的氧化及还原反应使得多种硫化合物的氧化状态得到维持。尤其在好氧性条件下，通过有机物的脱硫会形成硫酸盐，并且硫酸盐还原细菌会利用其，从而通过硫酸盐还原作用成为几个氨基酸的必要构成元素而合成蛋白质，厌氧性微生物会将有机化合物还原为硫化氢和一部分有机性硫化合物，如硫杆菌等硫细菌会通过代谢作用将硫化氢用作电子给体。因此，为了减少硫化类恶臭，通过如硫氧化微生物和硫酸盐还原细菌等特殊微生物的氧化或还原作用来发挥循环及再循环硫化合物的作用。因此，为了调查减少硫化氢的能力，利用已知为硫化合物氧化微生物的Starkeya novella并通过与SRCM101269进行比较来测定了硫酸盐的浓度(图4)。测定结果显示，在牛粪中，经过6天后硫酸盐均减少而显示出相似的数值，尤其在接种Starkeya novella和SRCM101269的实验组中，经过3天后大部分的硫酸盐被分解而显示出4mg/ml以下的数值，虽然显示出SRCM101269具有较快的分解能力，但是在混合粪中所有实验组的硫酸盐的浓度未显示出大的变化。据调查，这是由于在混合粪的初期硫酸盐浓度本身较低，因此没有显示出硫酸盐的含量变化。因此，确认了与标准菌株相比，SRCM101269为在减少恶臭的能力方面上氨和硫酸盐的分解能力均优异的菌株，因此SRCM101269是在牛粪和混合粪中均可使用的菌株而可适用于产业。
实施例7.通过制造发酵池的复合恶臭控制能力及纤维素分解能力
最终为了对利用SRCM101269去除畜牧粪尿的复合恶臭和进行堆肥化的适合性进行评价，制作了小型堆肥发酵池，并在户外与对照组一起进行发酵，同时对复合恶臭的变化量和与促进畜牧粪尿的堆肥化相关的纤维素含量的变化进行测定并分析，其中所述促进畜牧粪尿的堆肥化是指在畜牧业的堆肥化初期步骤中通过纤维素酶来分解稻壳、芒草、稻草、锯屑等水分调节剂而提供菌株的初期生长中所需的碳源等。直到制作发酵池后的第7天为止，对照组和实验组中的恶臭浓度均急剧增加，但是与对照组相比，在接种SRCM101269的发酵池中从第9天开始复合气体的浓度显著减少，在14天后是维持20ppm以下而显示出缓慢减少的趋势(图5)。考虑到根据环境部的恶臭防止法(Ministry of Environment，2014)的复合恶臭允许标准是排出口为500ppm以下、场地边界线为15ppm以下时，如果在初期对牛粪堆积物喷洒最终选取菌株SRCM101269进行混合发酵，则能够在相对较短的时间内减少恶臭。此外，对在堆肥化过程中对腐熟度影响较大的纤维素的分解程度进行比较的结果，初期的纤维素的含量没有大的变化，并一直持续到第7天，在经过7天后堆肥化积极进行而使纤维素的含量大幅度减少至18％以下(图6)。在前述的分离步骤中可以分析出，在SRCM101269的情况下，由于显示出高的纤维素酶活性，因此在堆肥坛中随着堆肥化的进行易分解性纤维素会转换为如糖等低分子有机化合物而使含量得到减少，这显示出通过缩短纤维素、半纤维素、果胶等难分解性物质被分解的堆肥化持续步骤的所需时间，从而具有在制作用于堆肥化的发酵池时能够减少工序和时间的优点。虽然之后需要大量生产工序及最优化等后续工序，但是通过本发明确认了作为用于堆肥化的、可在产业上进行应用的菌株的可能性，所述菌株具有不亚于标准菌株的减少恶臭的功能，并且在制作发酵池时能够减少时间及费用。
[保藏编号]
保藏机构：韩国微生物保藏中心(国外)
保藏编号：KCCM11817P
保藏日期：20160307
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Claims (6)
1.具有酶活性、减少氨及硫化氢的功效的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SRCM101269菌株。
2.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌SRCM101269菌株的保藏编号为KCCM11817P。
3.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于，所述酶活性是淀粉酶活性、蛋白酶活性、纤维素酶活性及木聚糖酶活性。
4.用于去除氨及硫化氢所引起的恶臭或用于分解有机物的微生物制剂，其含有选自权利要求1～3中任一项所述的菌株、所述菌株的培养物、所述培养物的浓缩液及干燥物中的一种以上作为有效成分。
5.根据权利要求4所述的微生物制剂，其特征在于，所述有机物为选自畜牧废水、畜牧粪尿及食物垃圾中的一种以上。
6.去除氨及硫化氢所引起的恶臭或分解有机物的方法，所述方法将选自权利要求1～3中任一项所述的菌株、所述菌株的培养物、所述培养物的浓缩液及干燥物中的一种以上与畜牧废水、畜牧粪尿或食物垃圾一起培养。
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